本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種熒光標(biāo)記的細(xì)胞色素c的固定化方法，以及所述固定化的熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c在生物樣品檢測中的用途。

背景技術(shù)：

一氧化氮(no)是具有多種生物活性的信使分子和效應(yīng)分子，對心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)都具有重要的調(diào)節(jié)作用，近來研究表明no還能發(fā)揮非特異性宿主防御作用，介導(dǎo)組織損傷、細(xì)胞凋亡等病理過程，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)和自身免疫性皮膚病。no雖然結(jié)構(gòu)簡單，但在有氧環(huán)境下極不穩(wěn)定，檢測難度大，因而相關(guān)分析方法的研究極大的關(guān)注，cn105153214提供了一種硅基羅丹明一氧化氮熒光探針、cn103923641提供了一種檢測線粒體中一氧化氮的熒光探針。

細(xì)胞色素c是一種定位于線粒體內(nèi)外膜間隙的血紅素蛋白，廣泛存在于各種含線粒體呼吸鏈的生物體中。細(xì)胞色素c含有c型血紅素，能夠與no通過配位反應(yīng)完成各種生理功能。早期的研究表明細(xì)胞色素c能夠直接與no結(jié)合與解離。

目前，發(fā)明人前期針對細(xì)胞色素c與no反應(yīng)機制的研究發(fā)現(xiàn)no進(jìn)入溶液以no形式存在，使cytc周圍的微環(huán)境發(fā)生變化，進(jìn)入到heme腔中改變其電子分布，增大了met80與heme之間的距離，使其相互作用減弱，met與heme之間的配位鍵改變，分子間發(fā)生重排，其中心fe與no形成新配位鍵，但所形成的fe-n鍵不穩(wěn)定，當(dāng)no量較少時，隨時間變化又會斷裂，再次生成五配位fe，可以與溶液中的自由基團結(jié)合，最終達(dá)到一個平衡，當(dāng)不斷通入no時，所形成的配位鍵不再發(fā)生斷裂，破壞了其達(dá)到的平衡。

在對上述結(jié)合機制進(jìn)行深入研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，由于cytc與no的配位反應(yīng)伴隨著空間構(gòu)象的改變、配位鍵的形成，因此在不破壞細(xì)胞色素c結(jié)構(gòu)和與no結(jié)合活性的基礎(chǔ)上，用熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c將能夠用于檢測細(xì)胞色素c與no結(jié)合過程中的能量轉(zhuǎn)移。

目前，國內(nèi)外還沒有利用固定化熒光標(biāo)記的細(xì)胞色素c來檢測一氧化氮的方法和產(chǎn)品。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種固定化的熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c，通過細(xì)胞色素c與no的配位反應(yīng)，引起細(xì)胞色素c構(gòu)象的改變和能量的遷移，進(jìn)而導(dǎo)致熒光光密度的改變，從而實現(xiàn)no的檢測。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供一種熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c的固定化方法，包括以下步驟：

(1)從微生物中提取純化細(xì)胞色素c；

(2)將細(xì)胞色素c與熒光素反應(yīng)制備熒光標(biāo)記的細(xì)胞色素c，除去游離熒光素；

(3)用異丙醇鋁制備鋁膠母液；

(4)將步驟(2)和(3)的產(chǎn)物混勻，涂布固相載體。

其中，所述細(xì)胞色素c來自光合細(xì)菌。

所述熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c的固定化方法，所述細(xì)胞色素c包含的氨基酸序列如seqidno:1所示。

所述熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c的固定化方法，步驟(1)具體為：將菌體凍融后，超聲破碎，上清液過離子交換色譜，洗脫液再過分子篩層析，獲得電泳純的細(xì)菌源細(xì)胞色素c。

所述熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c的固定化方法，步驟(2)具體為：將1mg細(xì)胞色素c溶解于nahco3溶液中，加入5μl20mm的熒光素琥珀酰亞胺酯，混勻，4℃反應(yīng)2h，0.01m的ph7.4磷酸鹽緩沖液透析，除去未結(jié)合的游離熒光素二乙酸酯。

所述熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c的固定化方法，步驟(3)具體為：取2g異丙醇鋁，加入44ml沸水中，80℃攪拌45min，加入1.2ml1m的hcl，煮沸1h，冷卻至4℃。

所述熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c的固定化方法，步驟(4)具體為：取等量的步驟(2)和(3)的產(chǎn)物混勻，4℃反應(yīng)1h，均勻涂覆于固相載體表面。

本發(fā)明第二個目的是：提供通過所述熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c的固定化方法制備的固定化熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c。

本發(fā)明第三個目的是：提供上述熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c的固定化方法在制備檢測生物樣品中no的檢測試劑中的用途。

本發(fā)明第四個目的是：提供上述熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c的固定化方法在制備檢測生物樣品中no的檢測裝置中的用途。

本發(fā)明所述檢測生物樣品中no的檢測裝置為細(xì)胞色素c珠、細(xì)胞色素c片、細(xì)胞色素c容器或細(xì)胞色素c傳感器。

所述的細(xì)胞色素c珠是表面涂覆有細(xì)胞色素c的透明球狀固體、細(xì)胞色素c片是表面涂覆有細(xì)胞色素c的透明片狀固體、細(xì)胞色素c容器是內(nèi)表面涂覆有細(xì)胞色素c的透明容器、細(xì)胞色素c傳感器是指感應(yīng)部件上涂覆有所述細(xì)胞色素c。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

(1)本發(fā)明首次公開了一種固定化熒光標(biāo)記的細(xì)胞色素c。其能夠立即響應(yīng)溶液中的no使得熒光光密度值瞬間大幅度改變，從而能夠快速、靈敏的檢測生物樣本、細(xì)胞培養(yǎng)液、發(fā)酵液等液體環(huán)境中易被氧化而瞬間消失的no。本發(fā)明所述固定化熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c對溶液中no的響應(yīng)速度約為0.4s，no的檢測限約為10μm。

(2)熒光標(biāo)記方法簡單并且避免了對細(xì)胞色素c空間結(jié)構(gòu)和功能的影響。本發(fā)明采用熒光素二乙酸酯標(biāo)記法，通過雙功能基團將熒光素標(biāo)記于細(xì)胞色素c蛋白質(zhì)支鏈的伯氨基上，不影響以鐵卟啉為活性中心的no結(jié)合位點的功能。

(3)本發(fā)明所述固定化熒光標(biāo)記的細(xì)胞色素c應(yīng)用范圍廣，可以固定于熒光光度計的樣品杯透光避內(nèi)部，也可以固定于透明載體上，可重復(fù)多次使用。尤其適用于體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的檢測，具有較好的經(jīng)濟價值。

附圖說明

圖1為純化的沼澤紅假單胞菌atcc:17001細(xì)胞色素c電泳圖。泳道1是純化的細(xì)胞色素c，泳道2是蛋白marker，由上到下依次為95、77、55、43、34、26、17kda，所述純化的蛋白位于約55-77kda之間。

圖2為不同溶液中，固定化熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c在510-590nm激發(fā)光下產(chǎn)生的的熒光光密度值。粗線為熒光標(biāo)記的細(xì)胞色素玻璃珠在超聲除氣的磷酸鹽緩沖溶液中的熒光光密度值；細(xì)線為熒光標(biāo)記的細(xì)胞色素玻璃珠在no飽和的磷酸鹽緩沖溶液中的熒光光密度值。橫軸為波長nm，縱軸為熒光光密度值a.u.

圖3為固定化熒光標(biāo)記的細(xì)胞色素c在535nm的熒光光密度值，橫軸為時間sec，縱軸為熒光光密度值a.u.。第3.5秒的位置“1”，向檢測溶液中加入no飽和的緩沖液；第14.5秒的位置“2”，向檢測溶液中再加入超聲除氣的緩沖液進(jìn)行稀釋。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1：光合菌細(xì)胞色素c的分離純化和鑒定

從沼澤紅假單胞菌atcc:17001中分離提取細(xì)胞色素c。將沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液離心，收集菌體以發(fā)酵液體積1/100量的tris-hcl(0.1m，ph7.4)緩沖液重懸，置-20℃冷凍過夜，室溫融解后，4℃超聲破碎10min，15000g冷凍離心20min，取上清液。

用tris-hcl(0.01m，ph7.4)緩沖液平衡deae纖維素層析柱，將上樣后先以10倍柱體積tris-hcl(0.01m，ph7.4)緩沖液漂洗，再用低離子強度nacl溶液(0.02m)洗滌至無蛋白成分流出，最后加入高離子強度的nacl(0.2m)，收集并合并洗脫液，并進(jìn)行濃縮。

將濃縮液上樣至sephadexg-100分子篩柱，用tris-hcl(0.01m，ph7.4)緩沖液洗脫，分部收集、合并呈鐵紅色的級分，濃縮、蛋白定量，取樣進(jìn)行sds-page電泳鑒定純度和大小(參見圖1)。

實施例2：細(xì)胞色素c的熒光標(biāo)記

將細(xì)胞色素c用0.1mnahco3溶液稀釋至500μg/ml，將六氯熒光素琥珀酸亞胺酯用dmso溶解至20mm，取5μl加入上述細(xì)胞色素c溶液中，混勻室溫反應(yīng)1h，以0.1mph7.4的tris-hcl緩沖液透析，直至透析液中不含熒光物質(zhì)。

實施例3：熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c的固定化

取2g異丙醇鋁，加入44ml沸水中，80℃攪拌45min，加入1.2ml1m的hcl，煮沸1h，冷卻至4℃，制備得鋁膠母液。

將熒光標(biāo)記的細(xì)胞色素c與鋁膠母液按體積比1:1混合，充分混勻4℃靜置反應(yīng)1h，均勻鋪布于玻璃珠上，置4℃冰箱中過夜保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例4：固定化熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c的熒光檢測

將實施例3制備的固定有熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c的玻璃珠分別加入超聲除氣的磷酸鹽緩沖溶液(0.01mph7.4)、以及充入no飽和的磷酸鹽緩沖溶液中，用熒光光度計檢測不同波長的激發(fā)光下產(chǎn)生的熒光光子的量(參見圖2)。固定化熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c在no飽和緩沖液中相對于超聲除氣緩沖液中，熒光光密度值顯著降低。

該實驗結(jié)果表明與超聲除氣的磷酸緩沖液相比，在no飽和的磷酸鹽緩沖溶液中熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c產(chǎn)生熒光的能力下降。本發(fā)明所述固定化熒光標(biāo)記的細(xì)胞色素在530-540nm激發(fā)光下產(chǎn)生的熒光光子數(shù)量較高，波長超過550nm時，熒光光密度值顯著下降，并且兩種溶液中光密度差值最大的波長區(qū)間也大約位于530-540nm之間。選擇535nm作為熒光光密度檢測的最佳參數(shù)。

實施例5：固定化熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c對溶液中no的響應(yīng)

將實施例3制備的固定有熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c的玻璃珠加入分別加入超聲除氣的磷酸鹽緩沖溶液(0.01mph7.4)中，檢測熒光光密度值。先加入等體積no飽和的磷酸鹽緩沖溶液立即混勻，檢測熒光光密度值的變化；再加入等體積超聲除氣的磷酸鹽緩沖液稀釋，檢測熒光光密度值的變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3表明，加入no飽和的磷酸鹽緩沖溶液后，熒光光密度值立即斷崖式下降，進(jìn)一步加入超聲除氣的磷酸鹽緩沖液后，熒光光密度值又大幅度回升。

上述結(jié)果證實：

(1)本發(fā)明所述固定化熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c對溶液中no的響應(yīng)速度快、熒光光密度信號變化大，能快速靈敏的檢測no的含量。

(2)本發(fā)明所述固定化熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c響應(yīng)于no產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移和構(gòu)像改變是可逆的，能夠重復(fù)使用。

實施例6：固定化熒光標(biāo)記細(xì)胞色素c用于體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)no的檢測

體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，向周齡balb/c小鼠腹腔內(nèi)注射5ml生理鹽水，揉捏腹腔，抽出腹腔液1500rpm離心3min，細(xì)胞沉淀置于1640完全培養(yǎng)基(含20％fbs)中，37℃培養(yǎng)，隔日換液。

將體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞均分為兩組，實驗組向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加終濃度1000u/ml的ifn、10μg/ml的lps、10μg/ml的sps、60μg/ml的ltn以及200μg/mlpaa，以刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生no；對照組不加藥物。

熒光光密度結(jié)果表明實驗組熒光光密度值約為235a.u.，而對照組熒光光密度值約為280a.u.。

上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。