本發(fā)明涉及納米生物技術領域，具體涉及一種單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片檢測方法。

背景技術：

懸浮芯片以直徑為5.6μm的聚苯乙烯或摻雜有磁性的熒光微球為固相載體，可在檢測體系中呈懸浮游離狀態(tài)存在，并隨液壓的施壓方向在流體管路中流動通行；每一種微球因其包被不同比例的特殊熒光染料，使其被定義為唯一的編碼地址，使得眾多的編碼微球被排列成類似于“陣列”的圖譜。在微球的固相表面修飾有不同的基團分子，例如羧基、羥基、生物素、鏈霉親和素等，并通過化學反應與特定的生物分子形成微球探針，這些生物分子可以是捕獲抗體、核苷酸探針、多肽或受體。從而進行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結合反應或核酸雜交反應。該技術采用2種不同波長的激光進行檢測，其中：紅色激光激發(fā)的是微球上的紅色分類染料，根據(jù)微球的不同熒光編碼，可以將微球進行分類，從而將各個不同的分析反應區(qū)別出來；綠色激光激發(fā)的是報告熒光分子，目的是確定微球上結合的報告熒光分子的數(shù)量，其量化的值即中位熒光強度值(Median Fluorescent Intensity,MFI)，理論上在一個反應孔內可以完成多達500種不同的生物學反應。該技術技術是以熒光編碼微球為基礎的檢測手段，快速靈敏、背景信號低、可實現(xiàn)多個樣品的高通量檢測，在生物和醫(yī)學分析領域表現(xiàn)出很多優(yōu)勢。目前，傳統(tǒng)的懸浮芯片技術是基于免疫學反應的，如：大分子檢測，通常采用夾心法；對于小分子，則采用競爭法來檢測。

核酸適配體是一類具有特異性識別功能的單鏈核酸分子，具有與單克隆抗體相媲美的親和力與特異性。與單抗相比核酸適配體還具有以下優(yōu)點：可在體外篩選，靶分子范圍廣，分子量較低，沒有免疫源性和毒性，可通過化學合成制備、改造與標記，化學穩(wěn)定性好，能可逆變性與復性，可通過酶擴增、剪切等。這些優(yōu)點使其在生物醫(yī)學領域具有廣闊的應用前景，基于適配體的生物分析方法得到了快速發(fā)展。通過核酸適配體取代單克隆抗體，能夠有效改善受抗原免疫源性限制、耗時長及制備過程復雜、單克隆抗體價格昂貴、不易獲得等問題。另外，傳統(tǒng)的抗原抗體對小分子的特征性基團結合力不強，在識別小分子化學物方面存在一定的局限性。所以采用核酸適配體對小分子靶標物進行檢測，成為一種新型高效的檢測方式。

碳材料具備良好的特性，其中碳納米管具有更高的比表面積，更高的拉伸強度、高彈性、從金屬到半導體的電子特性等優(yōu)良特征。通過單壁碳納米管表面的改造修飾，能夠使改善碳納米管與其他物質難以相容的缺點。在微球上固定單壁碳納米管，形成骨架，利用其豐富的比表面積，物理吸附適配體鏈，使得適配體的高親和性更進一步放大。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的包括：提供一種的適用于現(xiàn)場快速檢測的復合核酸適配體-懸浮芯片；

提供該核酸適配體-懸浮芯片的制備方法、檢測方法和用途。

本發(fā)明所述的基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球，其一種實施方式是，所述基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球包括：

表面氨基化修飾的單壁碳納米管(1)，具有羧基位點的懸浮芯片磁性微球(2)，生物素化核酸適配體(3)偶聯(lián)熒光素標記的鏈霉親和素(4)；

其中所述單壁碳納米管(1)通過酰胺鍵與懸浮芯片磁性微球(2)通過偶聯(lián)，分布于懸浮芯片磁性微球(2)的表面；

所述生物素化核酸適配體(3)與單壁碳納米管(1)物理吸附連接。

優(yōu)選的，所述生物素化核酸適配體(3)中的核酸適配體為單鏈DNA寡核苷酸；

優(yōu)選的，所述熒光素標記的鏈霉親和素(4)中的熒光素為藻紅蛋白。

進一步優(yōu)選的，所述生物素化核酸適配體(3)中的核酸適配體為雙酚A的核酸適配體，其核苷酸序列為：

5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'；

或者所述生物素化核酸適配體(3)中的核酸適配體為雌二醇的核酸適配體，其核苷酸序列為：

5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGAAG-3'；

或者所述生物素化核酸適配體(3)中的核酸適配體為多氯聯(lián)苯的核酸適配體，其核苷酸序列為：

5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCACTCGGACCCCATTCTCCTTCCATCCCTCATCCGTCCACCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'。

本發(fā)明所述的基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球，其另一種實施方式是，所述基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球由以下步驟制備，包括：

1)單壁碳納米管表面氨基化基團修飾改造：

兩步酸化法處理單壁碳納米管表面，使其表面產(chǎn)生了羧基后，再進行氨基化改造，使羧基化的單壁碳納米管重新被氨基化；

2)氨基修飾的單壁碳納米管與懸浮芯片磁性微球的羧基位點進行偶聯(lián)：

將步驟1)制備的氨基化修飾的單壁碳納米管與懸浮芯片磁性微球的羧基位點通過氨基縮合反應進行偶聯(lián)；

3)制備生物素化核酸適配體偶聯(lián)熒光標記的鏈霉親和素：

分別將生物素標記于目標物核酸適配體，將熒光素標記于鏈霉親和素，然后使生物素化核酸適配體與熒光標記的鏈霉親和素偶聯(lián)；

4)制備基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球：

將步驟3)制備的生物素化核酸適配體-熒光標記的鏈霉親和素，與步驟2)制備的單壁碳納米管-懸浮芯片磁性微球進行偶聯(lián)，得到基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球；

其中偶聯(lián)單壁碳納米管的磁性微球于渦旋儀上渦旋混勻，超聲分散至均勻后，避光條件將其加入生物素化核酸適配體-熒光標記的鏈霉親和素，室溫下水浴緩慢震蕩，制備得到基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球。

優(yōu)選的，所述步驟1)所述的氨基化改造為：以乙二胺作供氨物質，二環(huán)己基碳二亞胺作為縮合劑，120℃下加熱回流，使羧基化的單壁碳納米管重新被氨基化；所述單壁碳納米管的投料量為0.01mg；

優(yōu)選的，步驟2)所述的氨基縮合反應溫度為120℃，反應時間為24小時；所述磁性微球的投料量為1.25×10⁵個；

優(yōu)選的，步驟3)所述的熒光標記所使用的熒光標記物為藻紅蛋白。

優(yōu)選的，步驟4)所述生物素化核酸適配體偶聯(lián)藻紅蛋白-鏈霉親和素的投料量為0.2nmol，反應時間為1.5h小時，反應溫度為28℃。

本發(fā)明所述的基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球，其一種可實施的方式是，將三種基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球混合得到；

所述三種指：核酸適配體的核苷酸序列為序列表SEQ NO ID.1的單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球，核酸適配體的核苷酸序列為序列表SEQ NO ID.2的單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球，以及核酸適配體的核苷酸序列為序列表SEQ NO ID.3的單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球。

優(yōu)選的，所述三種基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球的物質的量比為1:1:1。

此外，本發(fā)明還提供了上述所有基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球的檢測方法，步驟包括：將所述核酸適配體-懸浮芯片與待測目標物混合，檢測中位熒光信號強度，建立檢測標準曲線，得到待測物濃度；其中待測物濃度與中位熒光信號強度呈負相關關系。

本發(fā)明還提供了上述所有基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球檢測核酸、蛋白質、微生物和/或化學污染物的用途；

優(yōu)選的，其中對所述核酸、蛋白質、微生物和/或化學污染物的檢測范圍為1×10^-13g/mL～1×10^-7g/mL，檢測靈敏度≥1×10^-15g/mL。

關于本發(fā)明所述的基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球，說明書附圖1給出了其結構模型示意圖。其中，圖1僅示意單壁碳納米管(1)與磁性檢測微球(2)的連接關系，而不限定磁性檢測微球(2)所連接的單壁碳納米管(1)的數(shù)量；同時，圖1僅示意生物素化核酸適配體(3)與單壁碳納米管(1)的連接關系，并不對單壁碳納米管(1)吸附的生物素化核酸適配體(3)數(shù)量做出限制。

通過結合單壁碳納米管、懸浮芯片技術構建了超靈敏檢測的新型核酸適配體檢測技術。充分利用核酸適配體特異性強、親和力高的優(yōu)點，使得檢測探針操作簡便，檢測靈敏。磁性聚苯乙烯微球具有大的比表面積，擁有多達10⁷-10⁸反應位點，單壁碳納米管豐富的比表面積和優(yōu)良的力學特點，將羧基化的微球和氨基修飾的單壁碳納米管偶聯(lián)，能結合更多的檢測探針，進一步擴大信號反應。首先將氨基化修飾的單壁碳納米管偶聯(lián)在微球上，加入經(jīng)SA-PE熒光標記的探針，也即目標物分子，會在碳納米管上物理性吸附，添加靶標分子后，會將熒光標記的探針競爭下來，致使熒光值降低。建立目標物檢測的標準曲線方程，該檢測平臺將為更多的化學污染物的現(xiàn)場快速檢測提供技術和理論上的支撐，可用于食品衛(wèi)生、衛(wèi)生檢驗與環(huán)境監(jiān)測等領域，具有很好的理論意義和實用價值。

本發(fā)明所述的熒光標記的親和素，所述熒光標記物為藻紅蛋白，所得熒光標記的親和素為鏈霉親和素-藻紅蛋白，整體也可稱熒光報告蛋白；本發(fā)明所述的熒光標記的親和素，也可以采用本領域常用的熒光標記物或標記蛋白進行熒光標記，如：異硫氰酸熒光素、5-羧基熒光、花青染料熒光素3和花青染料熒光素5標記等。

本發(fā)明所述的基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球的制備步驟：(1)單壁碳納米管表面氨基化基團修飾改造；(2)氨基修飾的單壁碳納米管與懸浮芯片磁性編碼微球的羧基位點進行偶聯(lián)；(3)生物素化核酸適配體偶聯(lián)熒光報告分子-鏈霉親和素藻紅蛋白；(4)生物素化核酸適配體-鏈霉親和素藻紅蛋白在單壁碳納米管-懸浮芯片磁性編碼微球上進行偶聯(lián)，形成核酸適配體特異性探針懸浮芯片微球，可參照Luminex公司網(wǎng)站技術手冊

(https://www.luminexcorp.com/zh/research/reagents-and-accessories/magplex-microspheres/product-details/)。

本發(fā)明所述的懸浮芯片磁性微球購自Luminex公司。

有益效果

本發(fā)明基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球，對于核酸、蛋白質、微生物和/或化學污染物的檢測具有較寬的檢測范圍和較高的檢測靈敏度；其檢測范圍為1×10^-13～1×10^-7g/mL，檢測靈敏度在fg級(1×10^-15g/mL)以上。這與標準懸浮芯片技術和經(jīng)典ELISA技術相比具有較大優(yōu)勢。經(jīng)特異性檢測實驗證明，新型核酸適配體-懸浮芯片技術特異性良好。

附圖說明

圖1單壁碳納米管的超靈敏核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球的結構模型示意圖。

其中，(1)指單壁碳納米管，(2)指磁性檢測微球，(3)指生物物素化核酸適配體，(4)指熒光素標記的鏈霉親和素藻紅蛋白。

圖2為一種單壁碳納米管的超靈敏核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球檢測方法建立模式圖。

圖3為基于單壁碳納米管的超靈敏核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球檢測方法檢測雙酚A(BPA)、雌二醇(E₂)和多氯聯(lián)苯(PCB)的標準曲線圖。

具體實施方式

下面結合具體附圖2對本發(fā)明作地進一步的說明。

本研究以典型環(huán)境內分泌干擾物雙酚A(Bisphenol A，BPA)、雌二醇(17-β-Estradiol，E₂)和多氯聯(lián)苯(PCB)等作為研究對象，基于碳納米材料的比表面積大、可控物理性吸附生物材料特點，建立多種環(huán)境內分泌干擾物檢測的新型核酸適配體-懸浮芯片技術。

首先采用乙二胺縮合劑法對碳納米材料即單壁碳納米管(Single-walled nanotubes，SWNTs)進行氨基化基團修飾改造，制備出氨基化修飾的碳納米管，并利用紅外和XPS進行表征，測得氨基修飾率為2.46％。

經(jīng)修飾的SWNTs與懸浮芯片磁性編碼微球的羧基位點進行偶聯(lián)，增加了微球的比表面積，同時起到信號放大作用；

基于鏈霉親和素-生物素反應機理，將熒光報告蛋白鏈霉親和素-藻紅蛋白(Strepavidin-phycoerythrin，SA-PE)連接到生物素化的BPA、PCB和E₂核酸適配體上，

利用核酸適配體單鏈DNA與SWNTs可控物理吸附的性質，制備出相應的特異性探針微球；

如果待測樣中存在BPA、PCB和E₂，則被探針微球捕獲，并與報告分子(即BPA和E₂的核酸適配體)特異性結合，從而改變了適配體的三維空間構型，使得形成的復合物從微球上脫落，懸浮芯片系統(tǒng)測得的中位熒光強度值(Median Fluorescence Intensity，MFI)也相應降低。

本實驗通過優(yōu)化反應條件，獲得了最佳SWNT、SA-PE加入量以及孵育時間和孵育溫度等。在此條件下，建立了BPA、E₂和PCB的檢測標準曲線。說明該方法具有較寬的檢測范圍(5-6個數(shù)量級)和較高的檢測靈敏度(亞pg級)，與標準懸浮芯片技術和經(jīng)典ELISA技術等其他檢測技術相比具有較大優(yōu)勢。經(jīng)特異性檢測實驗證明，新型核酸適配體-懸浮芯片技術特異性良好。

實施例

實施例一、制備表面氨基化修飾的單壁碳納米管

采用兩步酸化法處理碳納米管：100mL 98％的濃H₂S0₄與68％的濃HN0₃按照3:1的體積比混合，在混合酸中加入200mg SWNT，38℃超聲波振蕩條件下回流反應4h。冷卻至室溫后，加入去離子水稀釋，纖維素濾膜過濾，用去離子水清洗直到濾液的pH呈中性。反應產(chǎn)物置于電熱鼓風干燥箱中，60℃下真空干燥過夜。

100mL 98％的濃H₂S0₄與30％的H₂0₂按照4:1的體積比混合，將1中的混酸酸化產(chǎn)物置于H₂S0₄與H₂0₂的混合溶液中，70℃下回流2h。冷卻至室溫后，加入去離子水稀釋，用濾膜過濾，清洗至洗至濾液pH呈中性。產(chǎn)物置于電熱鼓風干燥箱中，60℃下干燥過夜。

實施例二、氨基修飾的單壁碳納米管與懸浮芯片磁性編碼微球的偶聯(lián)

取3mg氨基化修飾過的SWNT，加入3mL dH₂O中，超聲5min，重復6次累計時間達到30min，中途用冰水消熱。取800μL，分散至1.5mL的蒸餾水中。避光環(huán)境取出空白羧基化熒光編碼磁性微球懸液的棕色瓶(52#)，晾至室溫，水浴超聲30s，渦旋混勻1min。取出120μL懸液至用鋁箔包覆好的1.5mL離心管中，磁分離器上放置5min，貼壁吸去上清。120μL 0.1M MES(pH＝4.5)加至微球中充分混勻，清洗微球。磁分離，棄去上清，加100μL MES重懸微球，錫箔紙包住離心管避光放至4℃，備用。

取20μL SWNT加入離心管，迅速震蕩混勻，再分別加入10μL濃度為10mg/mL NHS和30μL濃度為10mg/mL EDC，MES補足至120μL體系，室溫避光孵育4h，800r。磁分離棄上清，加200μL封閉緩沖液封閉未反應的羧基位點30min，室溫，800rpm。

分別用1mL清洗緩沖液Ⅰ和II清洗微球，磁分離后加入100μL TE緩沖液重懸微球，水浴超聲30s，渦旋混勻后，用血球計數(shù)板在光學顯微鏡下計數(shù)。將探針微球稀釋至2000個/μL避光保存于4℃。

實施例三、制備生物素化核酸適配體偶聯(lián)熒光報告分子-鏈霉親和素藻紅蛋白

取生物素化的核酸適配體，開蓋前于離心機12000rpm，離心60s，慢慢打開管蓋，加入34μL的PBS(含0.1M的MgCl₂)緩沖液，配制成100μM的貯存液，蓋上蓋充分震蕩混勻，分裝(2μL/PCR管，10管)備用，其余-20℃凍存；取1管2μL生物素化的核酸適配體，95℃水浴處理5min，冷卻至室溫。再作100倍稀釋得到1μM，即加入198μL Tris-HCI(20mM Tris-HCI，pH＝7.4,100mM NaCl，2mM MgCl₂)偶聯(lián)緩沖液，共200μL備用；避光取2μL的SA-PE，用PBS緩沖液稀釋100倍至200μL，備用；

取1μM的生物素化核酸適配體和100×稀釋的SA-PE按照體積比3:2混合，37℃800rpm振蕩孵育30min。

實施例四、制備雙酚A的生物素化核酸適配體-鏈霉親和素藻紅蛋白-單壁碳納米管懸浮芯片檢測磁性微球。

用移液器取出偶聯(lián)SWNT的熒光編碼磁性微球10μL(2000個/μL)與96孔板中，每孔加入1μL，將96孔板于渦旋儀上渦旋混勻30s，超聲1min，至分散均勻。避光條件各孔加入2μL生物素化核酸適配體偶聯(lián)熒光報告分子-鏈霉親和素藻紅蛋白(所述核酸適配體為：雙酚A核酸適配體，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示)，用偶聯(lián)緩沖液補足50μL體系，孵育溫度28℃，孵育時間1.5小時，獲得檢測雙酚A的生物素化核酸適配體-鏈霉親和素藻紅蛋白-單壁碳納米管懸浮芯片檢測磁性微球。

實施例五、制備雌二醇的生物素化核酸適配體-鏈霉親和素藻紅蛋白-單壁碳納米管懸浮芯片檢測磁性微球。

參照實施例四的制備方法，僅是將雙酚A核酸適配體替換為雌二醇核酸適配體；所述雌二醇核酸適配體的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

實施例六、制備多氯聯(lián)苯的生物素化核酸適配體-鏈霉親和素藻紅蛋白-單壁碳納米管懸浮芯片檢測磁性微球。

參照實施例四的制備方法，僅是將雙酚A核酸適配體替換為多氯聯(lián)苯核酸適配體；所述多氯聯(lián)苯核酸適配體的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

實施例七、制備三聯(lián)環(huán)境內分泌干擾物(雙酚A、雌二醇和多氯聯(lián)苯)的生物素化核酸適配體-鏈霉親和素藻紅蛋白-單壁碳納米管懸浮芯片磁性檢測微球。

將實施例四、五、六制備的生物素化核酸適配體-鏈霉親和素藻紅蛋白-單壁碳納米管懸浮芯片檢測磁性微球進行等摩爾的量混合，制成三聯(lián)環(huán)境內分泌干擾物的生物素化核酸適配體-鏈霉親和素藻紅蛋白-單壁碳納米管懸浮芯片檢測磁性微球。

所述三聯(lián)環(huán)境內分泌干擾物(雙酚A、雌二醇和多氯聯(lián)苯)的生物素化核酸適配體-鏈霉親和素藻紅蛋白-單壁碳納米管懸浮芯片磁性檢測微球，也稱基于單壁碳納米管的多元核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球。

測試例

測試例一、雙酚A(Bisphenol A，BPA)的檢測。

采用條件優(yōu)化后最佳的方案，在25℃600rpm條件下孵育2小時，測定不同濃度BPA(0、0.256、1.28、6.4、32、160、800和4000pg/mL)下的MFI值，平行測定三次取平均值。以沒有加入BPA檢測時的MFI值作為陽性MFI₀，建立濃度與MFI/MFI₀的標準曲線(所述標準曲線見說明書附圖3)。檢測時取10μL/孔樣品加入到96孔微滴定板的反應孔中；用移液器分別吸取pH＝7.4的PBS緩沖液37μL，對每孔加入的樣品進行吹打混勻；

測試例二、雌二醇(17-β-Estradiol，E₂)的檢測。

參照測試例一的制備方法，僅是將BPA替換為E₂，測定不同濃度E₂(0、0.5、2、8、32、128、512和2048pg/mL)下的MFI值，建立標準曲線(所述標準曲線見說明書附圖3)。

測試例三、多氯聯(lián)苯(PCB)的檢測。

參照測試例一的制備方法，僅是將BPA替換為PCB，測定不同濃度PCB(0、0.064、0.32、1.6、8、40、200和1000pg/mL)下的MFI值，建立標準曲線(所述標準曲線見說明書附圖3)。

測試例四、BPA、E₂和PCB的同時檢測。

由于懸浮芯片是一個高通量的檢測平臺，可以多通道的檢測目標分子。在已經(jīng)建立的單通道BPA的高親和力適配體-懸浮芯片檢測技術基礎上，增加了E₂，PCB共三種指標進行了共同檢測。用移液器分別于每孔中加入3μL三聯(lián)環(huán)境內分泌干擾物的生物素化核酸適配體-鏈霉親和素藻紅蛋白-單壁碳納米管懸浮芯片檢測磁性微球，在漩渦振蕩器上28℃中速振蕩1.5小時；懸浮芯片系統(tǒng)讀取100個微球/孔，獲得中位熒光強度值；以三種靶標物的濃度為X軸，獲得中位熒光強度值與陽性中位熒光強度值的比值為Y軸，代入獲得的標準曲線中，計算3個水質樣品中BPA、E₂和PCB的檢測值，具體檢測結果如表1所示。

表1 3個水質樣品中BPA,E₂and PCB的檢測結果(n＝5)

本發(fā)明通過優(yōu)化反應條件，獲得了最佳SWNT、SA-PE加入量以及孵育時間和孵育溫度等。在此條件下，建立了BPA、E₂和PCB的檢測標準曲線。說明該方法具有較寬的檢測范圍(1×10^-13～1×10^-7g/mL)和較高的檢測靈敏度(1×10^-15g/mL)以上，與標準懸浮芯片技術和經(jīng)典ELISA技術相比具有較大優(yōu)勢。經(jīng)特異性檢測實驗證明，新型核酸適配體-懸浮芯片技術特異性良好。

序列表

<110> 廣州醫(yī)科大學

<120> 一種基于單壁碳納米管的核酸適配體-懸浮芯片磁性檢測微球及其制備和檢測方法

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccggtgggtg gtcaggtggg atagcgttcc gcgtatggcc cagcgcatca cgggttcgca 60

cca 63

<210> 2

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcttccagct tattgaatta cacgcagagg gtagcggctc tgcgcattca attgctgcgc 60

gctgaagcgc gaag 74

<210> 3

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcagcacag aggtcagatg cactcggacc ccattctcct tccatccctc atccgtccac 60

cctatgcgtg ctaccgtgaa 80