本發(fā)明屬于化學檢測領域，尤其是一種ase-hplc法測定骨碎補中柚皮苷含量的方法。

背景技術(shù)：

骨碎補，英文名：drynariafortunei。真蕨目、骨碎補科蕨類植物，全年均可采挖，除去泥沙，干燥，或再燎去茸毛(鱗片)，無臭，味淡，微澀。

骨碎補有療傷止痛、補腎強骨、外用消風祛斑的功效，可用于跌撲閃挫、筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨疹軟、耳鳴耳聾、牙齒松動、外治斑禿、白癱風等的治療。

現(xiàn)代藥理研究也表明骨碎補具有降血脂、降低胺基糖普類抗生素的毒性和促進骨吸收等作用。柚皮苷是骨碎補的主要有效成分之一，2015年版《中國藥典》(一部)以柚皮苷作為其質(zhì)量評價的指標。目前，骨碎補中柚皮苷的提取主要有煎煮法、加熱回流法、索氏提取法、超聲萃取法、微波輔助萃取法，測定方法有高效液相色譜法(hplc)和薄層一紫外分光光度法，但是上述方法提取時間長、測定步驟煩瑣。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述不足，本發(fā)明旨在提供一種簡便、準確的ase-hplc法測定骨碎補中柚皮苷含量的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：一種ase-hplc法測定骨碎補中柚皮苷含量的方法，依次包括下述步驟：

步驟1：采用ase法萃取粉碎后的骨碎補樣品，并收集甲醇萃取液；

步驟2：采用hplc法測定甲醇萃取液中柚皮苷的含量。

進一步的，所述的步驟1包括下述子步驟：

步驟s1：將骨碎補樣品粉碎，過三號篩，取過篩后的樣品粉末0.25g；

步驟s2：將樣品粉末與1g硅藻土混合，裝于放有纖維濾膜的ase萃取池中，加硅藻土至與池口平行，用甲醇萃?。?/p>

步驟s3：收集萃取液，并使用甲醇定容至50ml。

進一步的，所述的步驟s2所述的萃取，參數(shù)如下：萃取池體積為10ml，萃取溫度為100℃，萃取時間為8min，萃取次數(shù)為3次，沖洗體積為60％，吹掃時間為60s。

進一步的，步驟2所述的hplc法的檢測參數(shù)為：色譜柱為thermosyncronisdim.aq；柱溫為40℃；流速為0.3ml/min；流動相為甲醇-醋酸-水；檢測波長為283nm。

進一步的，所述的色譜柱的規(guī)格為1.7μm，50×2.1mm。

進一步的，所述的流動相為體積比為35:4:65的甲醇-醋酸-水。

進一步的，ase法所采用的儀器為美國dionex公司的ase350快速溶劑萃取儀；hplc法所采用的儀器為thermou3000uhplc液相色譜儀。

本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，具有以下優(yōu)勢：

本發(fā)明曾對快速溶劑萃取使用的溶劑進行考察，有論文提到使用60％乙醇提取柚皮苷相對含量較高，雜質(zhì)較少，故對使用甲醇和60％乙醇進行了溶劑考察，結(jié)果顯示甲醇與60％乙醇提取柚皮苷含量一致，且雜質(zhì)峰基本相同，故采用與藥典一致的提取溶劑。

由于有論文提到柚皮苷有論文提示不能回流太久，藥典回流6h比3h會更低，另外炮制中沙燙的時間和溫度也會對柚皮苷的含量有影響，故柚皮苷可能對熱不穩(wěn)定，故要對萃取溫度要進行考察，且萃取時間也要考察，在上述實驗基礎上，我們采用3因素3水平正交實驗方案l9(33)安排實驗，考察了溫度、時間、次數(shù)3個因素對加速溶劑萃取骨碎補中柚皮苷過程的影響，確定從骨碎補中提取柚皮苷的最佳提取工藝組合為提取溫度100℃，提取時間8min，提取次數(shù)3次。

附圖說明

圖1為柚皮苷對照品圖譜圖；

圖2為快速溶劑萃取的樣品圖譜圖；

圖3為藥典方法提取的樣品圖譜圖；

圖4為柚皮苷以濃度(mg/ml)-峰面積進行線性回歸圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式，對本發(fā)明的權(quán)利要求做進一步的詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護范圍之內(nèi)。

1、儀器設備及試劑

1.1儀器：

電子分析天平(xa205du)、ase350快速溶劑萃取儀(美國dionex公司)、thermou3000uhplc液相色譜儀；

1.2試劑(除特別注明外，本實驗所用試劑均為分析純)：

水：符合gb/t6682規(guī)定的一級水；

甲醇(ch4o)：色譜純(液相色譜用)；

醋酸(ch3cooh)：分析純。

2方法

2.1對照品溶液的制備：

取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含柚皮苷60μg的溶液，即得。

2.2供試品溶液的制備

2.2.1《中國藥典》2015年版一部制備供試品方法：

取本品粗粉約0.25g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇30ml，加熱回流3小時，放冷，濾過，濾液置50ml量瓶中，用少量甲醇分數(shù)次洗滌容器，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.2快速溶劑萃取法(ase)制備供試品方法：

樣品經(jīng)粉碎機粉碎，過三號篩，取0.25g，精密稱定，與約1g硅藻土混合均勻，待用，移入到預先放好纖維濾膜的ase10ml萃取池中再加入適量硅藻土，輕輕振搖使之與池口在同一水平線上，擰緊萃取池上蓋，放入快速萃取儀中進行萃取。萃取結(jié)束后，把萃取液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用少量甲醇清洗萃取瓶3次合并至容量瓶中，使用甲醇定容至刻度，即得。

2.3ase萃取條件

萃取池體積為10ml，萃取溫度為100℃，萃取時間為8min，萃取次數(shù)為3次，沖洗體積為60％，吹掃時間為60s。

2.4色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-醋酸-水(35:4:65)為流動相；檢測波長為283nm。理論板數(shù)按柚皮苷峰計算應不低于3000。

2.5測定法照高效液相色譜法(通則0512)測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

檢測參數(shù)為：色譜柱為thermosyncronisdim.aq，1.7μm，50×2.1mm；柱溫為40℃；流速為0.3ml/min；流動相為體積比為35:4:65的甲醇-醋酸-水；檢測波長為283nm。

2.6標準限值要求

本品按干燥品計算，含柚皮苷(c27h32o14)不得少于0.50％。

2.7計算(外標法)

式中cr——對照品溶液濃度，單位為微克每升(mg/l)；

ax——供試品的峰面積；

ar——對照品峰面積。

注意：

1.使用前萃取池底部應拆卸清理干凈，否則容易引起壓力不穩(wěn)；

2.萃取池底部的濾紙應在密封圈內(nèi)，否則引起滲漏；

3.萃取池裝樣時松緊適中，太松容易導致提取液過多；

4.開機前檢查氣瓶氣壓是否達到1mpa；

5.使用結(jié)束后清理干凈，萃取池要及時晾干(容易生銹)。

3結(jié)果

3.1線性關系

取柚皮苷對照品，精密稱定，加甲醇制成每1ml約含60μg的溶液，即得，然后分別精密吸取該溶液0.1μl、0.3μl、0.5μl、0.8μl、1μl進入lc測定，并依照上述方法測定，結(jié)果詳見表1。

以濃度(mg/ml)-峰面積進行線性回歸，見圖4；求得回歸方程：柚皮苷：y＝6988.0496x+35.1302，r²＝0.9993,柚皮苷在0.006936～0.06936mg范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

表1

3.2重復性試驗

取相同批號的樣品(批號：151002)0.25g，共4份，精密稱定，按上述ase提取方法提取供試品溶液，進樣量為1μl，以上述的色譜條件平行試驗，測得樣品中柚皮苷的含量見表2，rsd為0.8％，試驗表明ase提取方法重復性良好。

表2

3.3精密度和穩(wěn)定性試驗

取柚皮苷對照品溶液(0.06936mg/ml)，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，峰面積rsd為0.5％，詳見圖1，表明儀器精密度良好。

取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0，2，4，8，10h依法測定，結(jié)果見圖2，柚皮苷峰面積的rsd為0.2％，表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4樣品不同儀器提取結(jié)果及與藥典方法結(jié)果比較(3批)

使用不同的ase儀器對樣品進行萃取的含量結(jié)果見表3，使用ase法萃取的樣品中柚皮苷的含量與使用藥典中所提供的方法提取的樣品中柚皮苷的含量的結(jié)果對比見表4，使用藥典方法提取的樣品的色譜圖見圖3：

表3

表4

4討論：

4.1ase提取溶劑的選擇：

試驗中，曾對快速溶劑萃取使用的溶劑進行考察，有論文提到使用60％乙醇提取柚皮苷相對含量較高，雜質(zhì)較少，故對使用甲醇和60％乙醇進行了溶劑考察，結(jié)果顯示甲醇與60％乙醇提取柚皮苷含量一致，且雜質(zhì)峰基本相同，故采用與藥典一致的提取溶劑。

4.2ase提取條件的優(yōu)化

由于有論文提到柚皮苷有論文提示不能回流太久，藥典回流6h比3h會更低，另外炮制中沙燙的時間和溫度也會對柚皮苷的含量有影響，故柚皮苷可能對熱不穩(wěn)定，故要對萃取溫度要進行考察，且萃取時間也要考察，在上述實驗基礎上，我們采用3因素3水平正交實驗方案l9(33)安排實驗，考察了3個因素對加速溶劑萃取骨碎補中柚皮苷過程的影響。本實驗確定萃取溫度、靜態(tài)萃取時間、循環(huán)次數(shù)為考察因素(見表5)。

確定從骨碎補中提取柚皮苷的最佳快速溶劑萃取工藝，結(jié)果見表6。

表5

表6

由極差分析可以看出，提取次數(shù)對柚皮苷的含量影響最大，其次是提取溫度和提取時間。最終確定最佳提取工藝組合為提取溫度100℃，提取時間8min，提取次數(shù)3次。

以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。