本發(fā)明涉及分析化學中表面等離子體共振技術(shù)的應(yīng)用方法，具體涉及一種用于測定蘆丁與蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合水平的表面等離子體共振分析方法。

背景技術(shù)：

表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance,spr)技術(shù)是一種在分子間相互作用的分析領(lǐng)域中廣泛使用的方法。其基本原理為利用入射光照射spr傳感芯片，使得入射光產(chǎn)生的倏逝波與傳感芯片表面金屬的表面等離子波發(fā)生共振，影響出射光的性質(zhì)；此后在傳感芯片表面發(fā)生相互作用反應(yīng)，引起共振條件的變化，導致出射光性質(zhì)發(fā)生變化，對其進行監(jiān)測即可實現(xiàn)對相互作用反應(yīng)的檢測。在一般的spr分析過程中，相互作用反應(yīng)的一個參與物往往通過共價鍵、靜電作用、疏水作用等等方式被固定于spr檢測芯片表面，然后將另一個(或幾個)反應(yīng)的參與物溶解后流動通過該檢測芯片表面。當發(fā)生相互作用反應(yīng)時，反應(yīng)物的結(jié)合或解離將導致檢測芯片的表面性質(zhì)發(fā)生改變，反映為儀器信號的改變。spr技術(shù)可以進行快速、靈敏、無標記的分析，經(jīng)常被用于測定相互作用反應(yīng)的速率常數(shù)、平衡常數(shù)等物理化學數(shù)據(jù)。

蘆丁(rutin)是一種黃酮類化合物，在自然界，特別是植物中廣泛分布，在一些植物的根、莖、葉、果實等器官和組織內(nèi)都可以被發(fā)現(xiàn)。蘆丁的結(jié)構(gòu)式如下：

蘆丁具有明顯的生理活性，是常見的食品和中藥，例如蕎麥、銀杏、槐米、枸杞、蕓香、益母草、蘆薈、柴胡、桉葉，以及煙草中的重要活性成分。蘆丁的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。蘆丁具有較強的抗氧化活性，在人體中可以維持血管壁的張力、提高其彈性，降低血管壁脆性和滲透性，因而可以改善微血管循環(huán)、降低血脂和膽固醇含量，可以在心腦血管疾病的治療中發(fā)揮作用。此外，蘆丁還具有一定的抑菌和抗衰老作用，并且可以影響胰島素的分泌并提高胰島素受體親和力，在糖尿病治療領(lǐng)域中也有一定的應(yīng)用。蘆丁進入人體后，需要通過與多種蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用以實現(xiàn)其生理、藥理功能，例如其濃度較高時需要與血液中的人血清白蛋白(humanserumalbumin，hsa)發(fā)生結(jié)合從而隨著血液循環(huán)而被輸運到其他器官或組織，然后再解離以發(fā)揮生理功能，其功效發(fā)揮也和其與生物酶或者特異和非特異受體的結(jié)合有關(guān)。因此，研究蘆丁與蛋白質(zhì)相互作用的有關(guān)過程，特別是求得其與多種蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的平衡常數(shù)，對其藥理、藥代動力學等研究具有重要意義。

作為一種快速、無標記、實時的分析手段，spr法本質(zhì)上適合于蘆丁-蛋白質(zhì)相互作用的分析，但在實現(xiàn)過程中卻存在著困難，即蘆丁的溶解性問題。spr是一種質(zhì)量敏感型的分析方法，其信號強度取決于傳感芯片表面附近(50納米內(nèi))被測物質(zhì)量的大小，因此當被分析物是蘆丁等小分子物質(zhì)時，它必須在水環(huán)境中有足夠大的溶解度，以形成足夠強的信號。特別地，為了模擬生理環(huán)境，spr分析過程往往使用含有無機鹽的緩沖溶液來制備樣品溶液，這進一步導致了蘆丁溶解度降低的問題。已有專利方法中并無使用spr法研究蘆丁與蛋白質(zhì)相互作用的方法。因此，有必要通過分析步驟的改進，改善蘆丁在水溶液中的溶解性，并以此為基礎(chǔ)開發(fā)基于spr的蘆丁-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合水平的快速分析測定方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了彌補現(xiàn)有方法的不足，特別是蘆丁溶解度問題導致的分析困難，本發(fā)明的目的是提供一種基于表面等離子體共振原理的新型相互作用分析方法，實現(xiàn)對蘆丁和蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合水平(即結(jié)合反應(yīng)的平衡常數(shù))的測定。

本發(fā)明的分析方法包括傳感芯片的清潔、芯片表面的羧基化修飾、蛋白質(zhì)溶液ph的篩選、芯片表面羧基的活化、蛋白質(zhì)的共價結(jié)合、蘆丁的溶解與稀釋、蛋白質(zhì)與蘆丁相互作用過程的測定、數(shù)據(jù)分析等步驟。具體過程如下，各步驟須依次進行。

1、傳感芯片的清潔。

當spr傳感芯片(通常為鍍金玻璃片)為可拆卸式結(jié)構(gòu)時，將傳感芯片整體浸沒于由濃氨水、30％過氧化氫、水按體積比1:1:5混合而成的溶液中，并置于60-95℃環(huán)境中至少10分鐘，然后以水清洗，干燥后使用。當傳感芯片為不可拆卸式結(jié)構(gòu)(即金屬層直接鍍于棱鏡表面)時，在芯片表面檢測窗口位置滴加上述溶液，并置于低于90℃但盡可能高(不損壞棱鏡等結(jié)構(gòu))的溫度下至少30分鐘，然后以水洗凈表面并干燥后使用。也可以使用全新傳感芯片。

優(yōu)選的，每次分析流程均使用全新傳感芯片，為鍍有裸露金膜的玻璃片，一次性使用，分析完成后棄去。

2、芯片表面的羧基化修飾。

將清潔的傳感芯片安裝入spr儀器后，使?jié)M足以下條件的溶液流通經(jīng)過芯片表面：溶質(zhì)為一種巰基取代的直鏈羧酸，其中巰基位于碳鏈遠離羧基的另一個末端；碳鏈長度為含有三至二十碳原子，即巰基丙酸、巰基丁酸直至巰基二十烷酸之一；溶質(zhì)濃度為2mmol/l至50mmol/l；溶劑為水和/或乙醇，視何者能將溶質(zhì)溶解至所需濃度而定。流通過程中實時監(jiān)測spr信號，流通時間從進樣后直到spr信號不再變化為止，但至少為1分鐘，溶液流速為0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘，視流通池體積而定。以上步驟完成后以水沖洗整個管路和芯片表面。流通時芯片區(qū)域溫度為0℃至60℃。

優(yōu)選的，使用5mmol/l的3-巰基丙酸水溶液以5微升/分鐘的流速流通30分鐘，芯片區(qū)域控溫37℃，完成后以水沖洗管路和芯片表面。

3、蛋白質(zhì)溶液的ph篩選。

本方法所針對的目標蛋白為水溶性蛋白質(zhì)，其等電點大于4。實時監(jiān)測spr信號，使用滿足以下條件的溶液流通經(jīng)過芯片表面：蛋白質(zhì)濃度為1納克/毫升至50毫克/毫升中的某一個值；溶劑為乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，鈉離子濃度為不超過50mmol/l的一個值；ph為2.5至6.0中的至少3個值，范圍須覆蓋至少2個ph單位，間隔至少為0.2，至多為1個ph單位。即，流通的溶液為幾種固定蛋白種類和濃度、固定緩沖液濃度但ph不同的溶液。每個溶液流通相同的時間，介于5秒和60分鐘之間，流速相同，介于0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘之間。芯片區(qū)域溫度為0℃至60℃間的一個值。比較各個不同ph的蛋白溶液流經(jīng)羧基修飾的芯片時spr信號的變化。若在所嘗試的幾個ph值中、所使用的流通時間下，各溶液均使spr信號達到穩(wěn)定，則選擇穩(wěn)定后信號與基線相差最大的溶液的ph用作后續(xù)分析；若在使用的流通時間下各溶液均未使信號達到穩(wěn)定，則選擇信號變化最快的溶液的ph用作后續(xù)分析；若部分達到穩(wěn)定部分未達穩(wěn)定，則選擇流通完成時刻信號與基線相差最大的溶液的ph用作后續(xù)分析。此步驟完成后用水沖洗整個管路和芯片。

優(yōu)選的，將蛋白質(zhì)分別溶解于鈉離子濃度為10mmol/l，ph分別為4.0，4.5，5.0，5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，以5微升/分鐘的流速各流通5分鐘，控溫37℃，選擇結(jié)束時信號變化最大的溶液的ph。

4、芯片表面羧基的活化。

選擇下述兩種方法之一將芯片表面修飾的巰基羧酸的羧基進行活化。

其一，使?jié)M足以下條件的溶液流通經(jīng)過芯片表面：溶質(zhì)為edc，即n-(3-二甲氨基丙基)-n’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和nhs，即n-羥基丁二酰亞胺，兩者濃度均為0.0001至0.5克/毫升，且edc濃度不低于nhs濃度，流速介于0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘之間，流通時間以spr信號不再變化為準，但至少為1分鐘。芯片區(qū)域溫度為0℃至60℃間的一個值。

其二，先后使edc溶液和nhs溶液分別流通經(jīng)過芯片表面，各自濃度范圍、流速均同上，流通時間均以各自的spr信號不再變化為準，但各自均至少為1分鐘。芯片區(qū)域溫度為0℃至60℃間的一個值。

優(yōu)選的，以edc和nhs的混合溶液流通30分鐘，兩者濃度分別為0.01和0.002克/毫升，流速為5微升/分鐘?？販貫?7℃。

5、蛋白質(zhì)的共價結(jié)合。

將目標蛋白質(zhì)用第3步中確定的緩沖液溶解，蛋白質(zhì)濃度為1納克/毫升至50毫克/毫升之間，然后使之流通經(jīng)過芯片表面，芯片區(qū)域溫度為0℃至60℃間的一個值。流速介于0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘之間，流通時間以spr信號不再變化為準，但至少為1分鐘。完成后以水沖洗管路和芯片。

優(yōu)選的，使用0.01克/毫升、ph為5.0的蛋白溶液，以5微升/分鐘流速流通20分鐘，控溫37℃。

6、蘆丁的溶解與稀釋。

選擇磷酸鹽緩沖溶液(pbs)、tris緩沖溶液(三羥甲基氨基甲烷緩沖液，tbs)或者hepes緩沖溶液(n-2-羥乙基哌嗪-n’-2’-乙基磺酸緩沖液，hbs)溶液之一，25℃時ph為6.6至8.5，向其中添加3％至15％吡啶(體積分數(shù))。此后添加適量其他添加劑，例如乙二胺四乙酸鈉(edta)和表面活性劑p20等，總質(zhì)量分數(shù)不超過5％。以此溶劑作為蘆丁的稀釋溶劑。

將蘆丁溶解于純吡啶，濃度為1-50mmol/l中的一個值。以上述稀釋溶劑稀釋此蘆丁的吡啶溶液，至少得到3個不同濃度，且每個濃度間至少相差20％。每次稀釋水含有蘆丁的吡啶時，以相同比例稀釋一個未溶解蘆丁的純吡啶，得到不同濃度的吡啶溶液，其吡啶含量和上述稀釋的含有蘆丁的溶液相同。各溶液中蘆丁濃度分別記為c1、c2、…ci。

優(yōu)選的，以hbs-ep+緩沖液(含有10mmol/lhepes，0.15mol/l氯化鈉，3mmol/ledta，0.005％體積分數(shù)的表面活性劑p20，,25℃時ph為7.4)中添加8％(體積分數(shù))吡啶的溶液為稀釋劑，將蘆丁溶解于純吡啶至10mmol/l，然后以此稀釋劑稀釋至0.06、0.10、0.20、0.25、0.30mmol/l，每次稀釋時均以相同比例稀釋一個不含蘆丁的純吡啶溶液。

7、蛋白質(zhì)與蘆丁相互作用過程的測定。

將spr儀器管路中的流通溶液替換為第6步中所用的蘆丁稀釋溶劑。將第6步中得到的各個濃度的蘆丁的稀釋后溶液與對應(yīng)的各不含蘆丁的稀釋的吡啶溶液按照由稀至濃、先吡啶后蘆丁的順序依次送入spr儀器進行分析。樣品流速介于0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘之間，芯片區(qū)域控溫0℃至60℃之間。每次進樣后均記錄信號直至不再變化，且至少維持1分鐘。每次進樣直至信號接近穩(wěn)定后，停止進樣，以質(zhì)量分數(shù)1％至10％之間的十二烷基硫酸鈉(sds)溶液沖洗管路和芯片直至信號接近穩(wěn)定，此后再將管路中溶液替換為第6步中所用的稀釋溶劑，進行下一次分析。記錄每一個濃度為ci的蘆丁溶液進樣且信號穩(wěn)定后的信號值，記為ri，每一個與ci同樣稀釋，但是不含蘆丁的溶液進樣且信號穩(wěn)定后的信號值為ri。

優(yōu)選的，控溫37℃，每次分析時樣品流速為5微升/分鐘，使用的sds質(zhì)量分數(shù)為5％。

8、數(shù)據(jù)分析。

按照以下步驟求得所用蛋白質(zhì)與蘆丁發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的平衡常數(shù)。

a、如步驟7中所述，記錄各ci時的ri和ri；

b、計算各個1/ci和1/(ri-ri)，并以1/(ri-ri)對1/ci作圖，1/ci為橫坐標，1/(ri-ri)為縱坐標。

c、對圖中數(shù)據(jù)點進行線性擬合，所得方程的截距記為b，斜率記為a，則結(jié)合反應(yīng)的平衡常數(shù)為b/a，單位為實驗中所用濃度單位的倒數(shù)。

本發(fā)明的分析方法中，蘆丁用吡啶溶解并以含有吡啶的緩沖溶液稀釋，以解決蘆丁在水溶液中溶解度不足的問題，使之產(chǎn)生足夠強的spr信號。此外，分析過程中在配制稀釋的蘆丁溶液時一一對應(yīng)地配制了相同組分但不含蘆丁的吡啶的稀釋溶液，用于測定吡啶對spr信號的影響，以準確獲得蘆丁產(chǎn)生的相互作用信號。

附圖說明

圖1：本發(fā)明利用表面等離子體共振技術(shù)測定蘆丁與蛋白結(jié)合水平的分析過程示意圖。

圖2：本發(fā)明的實施例中第7步，hsa蛋白質(zhì)與含有蘆丁的各稀釋后溶液相互作用的spr檢測結(jié)果圖，用于求得各ri。

圖3：本發(fā)明的實施例中第7步，hsa蛋白質(zhì)與不含有蘆丁的各吡啶稀釋溶液相互作用的spr檢測結(jié)果圖，用于求得各ri。

圖4：本發(fā)明的實施例中第8步，所作圖和線性擬合結(jié)果。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖，通過實施例，進一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本申請的保護范圍不受這些實施例的具體條件的限制。

實施例：采用本發(fā)明中的分析方法測定蘆丁與人血清白蛋白(hsa)相互作用反應(yīng)的平衡常數(shù)。具體步驟如下。

1、使用全新傳感芯片，為鍍有裸露金膜的玻璃片。將其安裝進入spr儀器，啟動儀器，芯片區(qū)域控溫維持37℃。

2、使用5mmol/l的3-巰基丙酸水溶液以5微升/分鐘的流速流通30分鐘，芯片區(qū)域控溫37℃，完成后以水沖洗管路和芯片表面。

3、將hsa溶解于鈉離子濃度為10mmol/l，ph分別為4.0，4.5，5.0，5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，以5微升/分鐘的流速各流通5分鐘。流通結(jié)束時信號變化最大的溶液的ph為5.5，故此后蛋白質(zhì)共價結(jié)合時亦使用此ph的緩沖溶液。

4、以edc和nhs的混合溶液流通30分鐘，兩者濃度分別為0.01和0.002克/毫升，流速為5微升/分鐘。

5、使用0.01克/毫升、ph為5.0的hsa溶液，以5微升/分鐘流速流通20分鐘。

6、以hbs-ep+緩沖液(含有10mmol/lhepes，0.15mol/l氯化鈉，3mmol/ledta，0.005％體積分數(shù)的表面活性劑p20,25℃時ph為7.4)中添加8％(體積分數(shù))吡啶的溶液為稀釋劑，將蘆丁溶解于純吡啶至10mmol/l，然后以此稀釋劑稀釋至0.06、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mmol/l，每次稀釋時均以相同比例稀釋一個不含蘆丁的純吡啶溶液。

7、蛋白質(zhì)與蘆丁相互作用過程的測定。

將spr儀器管路中的流通溶液替換為第6步中所用的蘆丁稀釋劑。將第6步中得到的各個濃度的蘆丁的稀釋后溶液與對應(yīng)的各不含蘆丁的稀釋的吡啶溶液按照由稀至濃、先吡啶后蘆丁的順序依次送入spr儀器進行分析。樣品流速為5微升/分鐘，進樣后維持5分鐘，此后以質(zhì)量分數(shù)5％的sds溶液沖洗管路，再將管路中溶液替換為第6步中所用的稀釋溶劑，進行下一次分析。hsa與含有蘆丁的各個樣品溶液相互作用所得spr信號如圖2所示，hsa與各個不含蘆丁的吡啶稀釋溶液的相互作用所得spr信號如圖3所示。本實施例中，c1＝0.06mmol/l，c2＝0.10mmol/l，c3＝0.20mmol/l，c4＝0.25mmol/l，c5＝0.30mmol/l；r1＝129ru，r2＝178ru，r3＝225ru，r4＝225ru，r5＝224ru；r1＝118ru，r2＝161ru，r3＝199ru，r4＝198ru，r5＝193ru。

8、數(shù)據(jù)分析。

按照以下步驟求得所用蛋白質(zhì)與蘆丁發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的平衡常數(shù)。

a、記錄各ci時的ri和ri；已于第7步中敘述；

b、以各個1/(ri-ri)對1/ci作圖，1/ci為橫坐標，1/(ri-ri)為縱坐標，如圖4所示；

c、對圖4中各個數(shù)據(jù)點進行線性擬合，所得方程為y＝3.84×10^-3x+2.02×10^-2，線性系數(shù)為0.99。以截距除以斜率，得到蘆丁與hsa相互作用的結(jié)合常數(shù)為5.3mmol^-1·l，即5.3×10³mol^-1·l。