本發(fā)明涉及分析化學(xué)中表面等離子體共振技術(shù)的應(yīng)用方法，具體涉及一種用于測定槲皮素與蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合水平的表面等離子體共振分析方法。

背景技術(shù)：

表面等離子體共振法，簡稱為spr(surfaceplasmonresonance)，是一種廣泛用于分析、檢測物質(zhì)的分子間相互作用的分析方法，能夠用于大分子、小分子、離子間相互作用的研究。spr的基本原理為先在合適的條件下利用入射光照射spr傳感芯片，激發(fā)入射光在入射點(diǎn)產(chǎn)生的倏逝波與與傳感芯片表面金屬薄層的表面等離子波的共振，使得出射光強(qiáng)減弱；此后使相互作用過程在傳感芯片表面發(fā)生，導(dǎo)致溶液性質(zhì)的改變，引起共振條件的變化，進(jìn)而出射光性質(zhì)發(fā)生變化，即可實(shí)現(xiàn)對相互作用反應(yīng)的監(jiān)測。在一個典型的spr實(shí)驗(yàn)中，參與相互作用反應(yīng)的一個反應(yīng)物往往被通過共價鍵、靜電作用、疏水作用等方式結(jié)合到spr的檢測芯片表面，分析時使另一個(或幾個)反應(yīng)參與物的溶液流動通過該檢測芯片表面。當(dāng)發(fā)生相互作用反應(yīng)時，檢測芯片的表面和表面附近溶液的性質(zhì)發(fā)生改變，最終產(chǎn)生儀器信號的響應(yīng)。spr特別適用于測定相互作用反應(yīng)的速率常數(shù)、平衡常數(shù)等物理化學(xué)數(shù)據(jù)，可以不需標(biāo)記地實(shí)時、快速對非穩(wěn)定平衡的體系進(jìn)行測定。

槲皮素(quercetin)又名櫟精或槲皮黃素，是黃酮類物質(zhì)中的一種，其結(jié)構(gòu)式如下：

槲皮素是蘆丁等多種其他黃酮類物質(zhì)糖甙結(jié)構(gòu)中的甙元，具有多種生理藥理活性。它具有抗氧化活性，能夠被用于抗衰老作用；它能夠顯著抑制離體癌細(xì)胞的生長，可以作為抗癌藥物組分；它能夠抑制血小板聚集和抑制5-羥色胺釋放的效果，因而在心腦血管疾病的治療中也存在應(yīng)用。當(dāng)作為藥物使用時，槲皮素進(jìn)入人體后需要通過與多種蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用以實(shí)現(xiàn)其生理、藥理功能，例如，槲皮素在體內(nèi)的輸運(yùn)依賴于它與血液中的人血清白蛋白(humanserumalbumin，hsa)的可逆結(jié)合以，其功效發(fā)揮也和其與受體蛋白的可逆結(jié)合有關(guān)。因此，研究槲皮素與蛋白質(zhì)相互作用的有關(guān)過程，特別是求得其與多種蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的平衡常數(shù)，往往是其藥理、代謝等研究的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

spr法是一種適合用于分析分子間相互作用的方法，特別適合于蛋白-槲皮素間的快速實(shí)時分析。但是槲皮素幾乎不溶于水而易溶于有機(jī)溶劑，故spr對槲皮素的分析存在困難。spr分析過程依賴將被分析物溶液流經(jīng)傳感芯片時產(chǎn)生的信號，其信號強(qiáng)度取決于傳感芯片表面附近(約50納米內(nèi))被測物的質(zhì)量的大小，因此當(dāng)被分析物是槲皮素等小分子物質(zhì)時，它必須在水環(huán)境中有足夠大的溶解度，以形成足夠強(qiáng)的信號。此外，spr分析過程往往使用含有無機(jī)鹽的緩沖溶液來制備樣品溶液以模擬生物體內(nèi)生理環(huán)境，這進(jìn)一步加劇了槲皮素溶解度低的問題。目前專利方法中并無使用spr法研究槲皮素與蛋白質(zhì)相互作用方法的報道，原因即為槲皮素在水溶液中溶解度問題。因此，有必要通過分析步驟的改進(jìn)，提高槲皮素在水環(huán)境中的溶解度，并進(jìn)一步開發(fā)基于spr的槲皮素-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合水平的快速分析測定方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有方法的不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于表面等離子體共振原理的新型相互作用分析方法，通過在溶劑中添加有機(jī)溶劑以改善槲皮素的溶解度，實(shí)現(xiàn)對槲皮素和蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合水平(即結(jié)合反應(yīng)的平衡常數(shù))的測定。

本發(fā)明基于表面等離子體共振(spr)技術(shù)的分析方法包括傳感芯片的清潔、芯片表面的羧基化修飾、蛋白質(zhì)溶液ph的篩選、芯片表面羧基的活化、蛋白質(zhì)的共價結(jié)合、槲皮素的溶解與稀釋、蛋白質(zhì)與槲皮素相互作用過程的測定、數(shù)據(jù)分析等步驟。具體過程如下，各步驟須依次進(jìn)行。

1、傳感芯片的清潔。

當(dāng)spr傳感芯片(通常為鍍金玻璃片)為可拆卸式結(jié)構(gòu)時，將傳感芯片整體浸沒于由濃氨水、30％過氧化氫、水按體積比1:1:5混合而成的溶液中，并置于60-95℃環(huán)境中至少10分鐘，然后以水清洗，干燥后使用。當(dāng)傳感芯片為不可拆卸式結(jié)構(gòu)(即金屬層直接鍍于棱鏡表面)時，在芯片表面檢測窗口位置滴加上述溶液，并置于低于90℃但盡可能高(不損壞棱鏡等結(jié)構(gòu))的溫度下至少30分鐘，然后以水洗凈表面并干燥后使用。也可以使用全新傳感芯片。

優(yōu)選的，每次分析流程均使用全新傳感芯片，為鍍有裸露金膜的玻璃片，一次性使用，分析完成后棄去。

2、芯片表面的羧基化修飾。

將清潔的傳感芯片安裝入spr儀器后，使?jié)M足以下條件的溶液流通經(jīng)過芯片表面：溶質(zhì)為一種巰基取代的直鏈羧酸，其中巰基位于碳鏈遠(yuǎn)離羧基的另一個末端；碳鏈長度為含有三至二十碳原子，即巰基丙酸、巰基丁酸直至巰基二十烷酸之一；溶質(zhì)濃度為2mmol/l至50mmol/l；溶劑為水和/或乙醇，視何者能將溶質(zhì)溶解至所需濃度而定。流通過程中實(shí)時監(jiān)測spr信號，流通時間從進(jìn)樣后直到spr信號不再變化為止，但至少為1分鐘，溶液流速為0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘，視流通池體積而定。以上步驟完成后以水沖洗整個管路和芯片表面。流通時芯片區(qū)域溫度為0℃至60℃。

優(yōu)選的，使用5mmol/l的3-巰基丙酸水溶液以5微升/分鐘的流速流通30分鐘，芯片區(qū)域控溫37℃，完成后以水沖洗管路和芯片表面。

3、蛋白質(zhì)溶液的ph篩選。

本方法所針對的目標(biāo)蛋白為水溶性蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)大于4。實(shí)時監(jiān)測spr信號，使用滿足以下條件的溶液流通經(jīng)過芯片表面：蛋白質(zhì)濃度為1納克/毫升至50毫克/毫升中的某一個值；溶劑為乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，鈉離子濃度為不超過50mmol/l的一個值；ph為2.5至6.0中的至少3個值，范圍須覆蓋至少2個ph單位，間隔至少為0.2，至多為1個ph單位。即，流通的溶液為幾種固定蛋白種類和濃度、固定緩沖液濃度但ph不同的溶液。每個溶液流通相同的時間，介于5秒和60分鐘之間，流速相同，介于0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘之間。芯片區(qū)域溫度為0℃至60℃間的一個值。比較各個不同ph的蛋白溶液流經(jīng)羧基修飾的芯片時spr信號的變化。若在所嘗試的幾個ph值中、所使用的流通時間下，各溶液均使spr信號達(dá)到穩(wěn)定，則選擇穩(wěn)定后信號與基線相差最大的溶液的ph用作后續(xù)分析；若在使用的流通時間下各溶液均未使信號達(dá)到穩(wěn)定，則選擇信號變化最快的溶液的ph用作后續(xù)分析；若部分達(dá)到穩(wěn)定部分未達(dá)穩(wěn)定，則選擇流通完成時刻信號與基線相差最大的溶液的ph用作后續(xù)分析。此步驟完成后用水沖洗整個管路和芯片。

優(yōu)選的，將蛋白質(zhì)分別溶解于鈉離子濃度為10mmol/l，ph分別為4.0，4.5，5.0，5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，以5微升/分鐘的流速各流通5分鐘，控溫37℃，選擇結(jié)束時信號變化最大的溶液的ph。

4、芯片表面羧基的活化。

選擇下述兩種方法之一將芯片表面修飾的巰基羧酸的羧基進(jìn)行活化。

其一，使?jié)M足以下條件的溶液流通經(jīng)過芯片表面：溶質(zhì)為edc，即n-(3-二甲氨基丙基)-n’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和nhs，即n-羥基丁二酰亞胺，兩者濃度均為0.0001至0.5克/毫升，且edc濃度不低于nhs濃度，流速介于0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘之間，流通時間以spr信號不再變化為準(zhǔn)，但至少為1分鐘。芯片區(qū)域溫度為0℃至60℃間的一個值。

其二，先后使edc溶液和nhs溶液分別流通經(jīng)過芯片表面，各自濃度范圍、流速均同上，流通時間均以各自的spr信號不再變化為準(zhǔn)，但各自均至少為1分鐘。芯片區(qū)域溫度為0℃至60℃間的一個值。

優(yōu)選的，以edc和nhs的混合溶液流通30分鐘，兩者濃度分別為0.01和0.002克/毫升，流速為5微升/分鐘?？販貫?7℃。

5、蛋白質(zhì)的共價結(jié)合。

將目標(biāo)蛋白質(zhì)用第3步中確定的緩沖液溶解，蛋白質(zhì)濃度為1納克/毫升至50毫克/毫升之間，然后使之流通經(jīng)過芯片表面，芯片區(qū)域溫度為0℃至60℃間的一個值。流速介于0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘之間，流通時間以spr信號不再變化為準(zhǔn)，但至少為1分鐘。完成后以水沖洗管路和芯片。

優(yōu)選的，使用0.01克/毫升、ph為5.0的蛋白溶液，以5微升/分鐘流速流通20分鐘，控溫37℃。

6、槲皮素的溶解與稀釋。

選擇磷酸鹽緩沖溶液(pbs)、tris緩沖溶液(三羥甲基氨基甲烷緩沖液，tbs)或者h(yuǎn)epes緩沖溶液(n-2-羥乙基哌嗪-n’-2’-乙基磺酸緩沖液，hbs)溶液之一，25℃時ph為6.6至8.5，向其中添加3％至15％吡啶(體積分?jǐn)?shù))。此后添加適量其他添加劑，例如乙二胺四乙酸鈉(edta)和表面活性劑p20等，總質(zhì)量分?jǐn)?shù)不超過5％。以此溶劑作為槲皮素的稀釋溶劑。

將槲皮素溶解于純吡啶，濃度為1-50mmol/l中的一個值。以上述稀釋溶劑稀釋此槲皮素的吡啶溶液，至少得到3個不同濃度，且每個濃度間至少相差20％。每次稀釋水含有槲皮素的吡啶時，以相同比例稀釋一個未溶解槲皮素的純吡啶，得到不同濃度的吡啶溶液，其吡啶含量和上述稀釋的含有槲皮素的溶液相同。各溶液中槲皮素濃度分別記為c1、c2、…ci。

優(yōu)選的，以hbs-ep+緩沖液(含有10mmol/lhepes，0.15mol/l氯化鈉，3mmol/ledta，0.005％體積分?jǐn)?shù)的表面活性劑p20，25℃時ph為7.4)中添加8％(體積分?jǐn)?shù))吡啶的溶液為稀釋劑，將槲皮素溶解于純吡啶至10mmol/l，然后以此稀釋劑稀釋至0.06、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mmol/l，每次稀釋時均以相同比例稀釋一個不含槲皮素的純吡啶溶液。

7、蛋白質(zhì)與槲皮素相互作用過程的測定。

將spr儀器管路中的流通溶液替換為第6步中所用的槲皮素稀釋溶劑。將第6步中得到的各個濃度的槲皮素的稀釋后溶液與對應(yīng)的各不含槲皮素的稀釋的吡啶溶液按照由稀至濃、先吡啶后槲皮素的順序依次送入spr儀器進(jìn)行分析。樣品流速介于0.1微升/分鐘至1毫升/分鐘之間，芯片區(qū)域控溫0℃至60℃之間。每次進(jìn)樣后均記錄信號直至不再變化，且至少維持1分鐘。每次進(jìn)樣直至信號接近穩(wěn)定后，停止進(jìn)樣，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％至10％之間的十二烷基硫酸鈉(sds)溶液沖洗管路和芯片直至信號接近穩(wěn)定，此后再將管路中溶液替換為第6步中所用的稀釋溶劑，進(jìn)行下一次分析。記錄每一個濃度為ci的槲皮素溶液進(jìn)樣且信號穩(wěn)定后的信號值，記為ri，每一個與ci同樣稀釋，但是不含槲皮素的溶液進(jìn)樣且信號穩(wěn)定后的信號值為ri。

優(yōu)選的，控溫37℃，每次分析時樣品流速為5微升/分鐘，使用的sds質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％。

8、數(shù)據(jù)分析。

按照以下步驟求得所用蛋白質(zhì)與槲皮素發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的平衡常數(shù)。

a、如步驟7中所述，記錄各ci時的ri和ri；

b、計算各個1/ci和1/(ri-ri)，并以1/(ri-ri)對1/ci作圖，1/ci為橫坐標(biāo)，1/(ri-ri)為縱坐標(biāo)。

c、對圖中數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合，所得方程的截距記為b，斜率記為a，則結(jié)合反應(yīng)的平衡常數(shù)為b/a，單位為實(shí)驗(yàn)中所用濃度單位的倒數(shù)。

本發(fā)明的分析方法中，使用吡啶溶解槲皮素并以含有吡啶的緩沖溶液稀釋，以解決槲皮素在水溶液中溶解度不足，導(dǎo)致的spr分析困難的問題，同時分析過程中在配制稀釋的槲皮素溶液時均一一對應(yīng)地配制了相同組分但不含槲皮素的吡啶的稀釋溶液，用于表征吡啶對spr信號的影響，以準(zhǔn)確獲得槲皮素產(chǎn)生的相互作用信號。

附圖說明

圖1：本發(fā)明利用表面等離子體共振技術(shù)測定槲皮素與蛋白結(jié)合水平的分析過程示意圖。

圖2：本發(fā)明的實(shí)施例中第7步，hsa蛋白質(zhì)與含有槲皮素的各稀釋后溶液相互作用的spr檢測結(jié)果圖，用于求得各ri。

圖3：本發(fā)明的實(shí)施例中第7步，hsa蛋白質(zhì)與不含有槲皮素的各吡啶稀釋溶液相互作用的spr檢測結(jié)果圖，用于求得各ri。

圖4：本發(fā)明的實(shí)施例中第8步，所作圖和線性擬合結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖，通過實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本申請的保護(hù)范圍不受這些實(shí)施例的具體條件的限制。

實(shí)施例：采用本發(fā)明中的分析方法測定槲皮素與人血清白蛋白(hsa)相互作用反應(yīng)的平衡常數(shù)。具體步驟如下。

1、使用全新傳感芯片，為鍍有裸露金膜的玻璃片。將其安裝進(jìn)入spr儀器，啟動儀器，芯片區(qū)域控溫維持37℃。

2、使用5mmol/l的3-巰基丙酸水溶液以5微升/分鐘的流速流通30分鐘，芯片區(qū)域控溫37℃，完成后以水沖洗管路和芯片表面。

3、將hsa溶解于鈉離子濃度為10mmol/l，ph分別為4.0，4.5，5.0，5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，以5微升/分鐘的流速各流通5分鐘。流通結(jié)束時信號變化最大的溶液的ph為5.5，故此后蛋白質(zhì)共價結(jié)合時亦使用此ph的緩沖溶液。

4、以edc和nhs的混合溶液流通30分鐘，兩者濃度分別為0.01和0.002克/毫升，流速為5微升/分鐘。

5、使用0.01克/毫升、ph為5.0的hsa溶液，以5微升/分鐘流速流通20分鐘。

6、以hbs-ep+緩沖液(含有10mmol/lhepes，0.15mol/l氯化鈉，3mmol/ledta，0.005％體積分?jǐn)?shù)的表面活性劑p20,25℃時ph為7.4)中添加8％(體積分?jǐn)?shù))吡啶的溶液為稀釋劑，將槲皮素溶解于純吡啶至10mmol/l，然后以此稀釋劑稀釋至0.06、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mmol/l，每次稀釋時均以相同比例稀釋一個不含槲皮素的純吡啶溶液。

7、蛋白質(zhì)與槲皮素相互作用過程的測定。

將spr儀器管路中的流通溶液替換為第6步中所用的槲皮素稀釋劑。將第6步中得到的各個濃度的槲皮素的稀釋后溶液與對應(yīng)的各不含槲皮素的稀釋的吡啶溶液按照由稀至濃、先吡啶后槲皮素的順序依次送入spr儀器進(jìn)行分析。樣品流速為5微升/分鐘，進(jìn)樣后維持5分鐘，此后以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％的sds溶液沖洗管路，再將管路中溶液替換為第6步中所用的稀釋溶劑，進(jìn)行下一次分析。hsa與含有槲皮素的各個樣品溶液相互作用所得spr信號如圖2所示，hsa與各個不含槲皮素的吡啶稀釋溶液的相互作用所得spr信號如圖3所示。本實(shí)施例中，c1＝0.04mmol/l，c2＝0.06mmol/l，c3＝0.10mmol/l，c4＝0.20mmol/l，c5＝0.30mmol/l；r1＝66.2ru，r2＝97.2ru，r3＝148ru，r4＝308ru，r5＝434ru；r1＝8.97ru，r2＝12.4ru，r3＝17.9ru，r4＝21.4ru，r5＝17.2ru。

8、數(shù)據(jù)分析。

按照以下步驟求得所用蛋白質(zhì)與槲皮素發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的平衡常數(shù)。

a、記錄各ci時的ri和ri；已于第7步中敘述；

b、以各個1/(ri-ri)對1/ci作圖，1/ci為橫坐標(biāo)，1/(ri-ri)為縱坐標(biāo)，如圖4所示；

c、對圖4中各個數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合，所得方程為y＝6.95×10^-4x+2.35×10^-4，線性系數(shù)為0.99。以截距除以斜率，得到槲皮素與hsa相互作用的結(jié)合常數(shù)為0.34mmol^-1·l，即3.4×10²mol^-1·l。