本發(fā)明涉及人參中人參皂苷的檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是一種ase-hplc法測(cè)定人參中多種人參皂苷的方法。
背景技術(shù)：
：人參是我國(guó)地道藥材中應(yīng)用最廣泛的代表，人參皂苷是人參的主要藥效成分，人參皂苷具有增強(qiáng)記憶力，提高免疫力，改善心血管，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，延緩衰老和抗腫瘤等功能，人參皂苷的含量測(cè)定已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。隨著社會(huì)的發(fā)展，對(duì)于藥品質(zhì)量控制的要求也越來(lái)越高，但由于人參化學(xué)成分復(fù)雜，人參皂苷種類多樣，現(xiàn)已確定并分離的人參皂苷化合物單體有50余種，根據(jù)苷元的不同，人參皂苷被分為原人參二醇類皂苷、原人參三醇類皂苷及齊墩果酸類皂苷。因此建立同時(shí)、多種、快捷、方便、可靠的人參皂苷檢測(cè)方法對(duì)人參及其制劑的質(zhì)量控制具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述不足，本發(fā)明旨在提供一種可同時(shí)測(cè)定多種人參皂苷單體、線性范圍廣、方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、快捷簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠的ase-hplc法測(cè)定人參中人參皂苷的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：一種ase-hplc法測(cè)定人參中的多種人參皂苷的方法，依次包括下述步驟：步驟1：采用ase萃取方法萃取粉碎過(guò)的人參樣品；其中，ase萃取方法包括先在索氏提取器中采用三氯甲烷萃取，然后在快速溶劑萃取儀中用甲醇萃取，收集甲醇萃取液；步驟2：采用hplc法檢測(cè)甲醇萃取液中的人參皂苷的含量。進(jìn)一步的，所述的步驟1包括下述子步驟：步驟s1：將樣品粉碎，過(guò)四號(hào)篩，取過(guò)篩后的粉末1g；步驟s2：裝于索氏提取器中，加入三氯甲烷，加熱回流4小時(shí)，三氯甲烷萃取液舍棄；步驟s3：將1g硅藻土和藥渣混合，移入放有纖維濾膜的ase10ml萃取池中，加硅藻土至與池口平行；步驟s4：放入快速萃取儀中進(jìn)行萃取，萃取溶劑為甲醇；步驟s5：將萃取液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，并加甲醇定容?0ml，取1ml加至裝有100mgpsa的2ml離心管中，離心，濾過(guò)，即得甲醇萃取液。進(jìn)一步的，所述的步驟s4中，萃取參數(shù)為：萃取溫度為110℃，萃取時(shí)間為10min，萃取次數(shù)為1次，沖洗體積為60％，吹掃時(shí)間為60s。進(jìn)一步的，所述的ase萃取方法采用美國(guó)dionex公司的ase350快速溶劑萃取儀。進(jìn)一步的，所述的步驟2中，hplc法的檢測(cè)參數(shù)為：色譜柱：thermosyncronisdim.aq；柱溫：50℃；流速：0.3ml/min；流動(dòng)相：乙腈-水；檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm。進(jìn)一步的，所述的流動(dòng)相：乙腈-水的體積比為18～32：68～82；第0分鐘，流動(dòng)相中乙腈-水的體積比為18：82；第10分鐘，流動(dòng)相中乙腈-水的體積比為20：80；第18分鐘，流動(dòng)相中乙腈-水的體積比為30：70；第24分鐘，流動(dòng)相中乙腈-水的體積比為32：68；第25-28分鐘，流動(dòng)相中乙腈-水的體積比為18：82。進(jìn)一步的，所述的色譜柱的規(guī)格為1.7μm，50×2.1mm；所述的hplc檢測(cè)方法所采用thermou3000uhplc液相色譜儀。本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.本發(fā)明提供一種同時(shí)測(cè)定3種人參皂苷單體hplc方法，所測(cè)定的3種人參皂苷單體為rg1、re、rb1，提高了效率；2.本發(fā)明只用乙腈和水作流動(dòng)相，解決了磷酸鹽對(duì)色譜柱損耗大,系統(tǒng)清洗麻煩等問題，流動(dòng)相配制方便，簡(jiǎn)便了操作；3.本發(fā)明所測(cè)定的結(jié)果表明，3種人參皂苷單體在0.5～3.0μl范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系、線性范圍廣，方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、快捷簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠。4.本發(fā)明能更好地分析人參皂苷單體的含量，為人參及其制劑的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。附圖說(shuō)明圖1為人參皂苷rg1以濃度(mg)-峰面積進(jìn)行的線性回歸圖；圖2為人參皂苷re以濃度(mg)-峰面積進(jìn)行的線性回歸圖；圖3為人參皂苷rb1以濃度(mg)-峰面積進(jìn)行的線性回歸圖；圖4為人參皂苷rg1、人參皂苷re和人參皂苷rb1的對(duì)照品圖譜圖；圖5為快速溶劑萃取樣品的圖譜圖；圖6為藥典方法提取樣品的圖譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。1.儀器設(shè)備及試劑1.1儀器：電子分析天平(xa205du)、ase350快速溶劑萃取儀(美國(guó)dionex公司)、thermou3000uhplc液相色譜。2.2試劑：試劑與溶液(除特別注明外，本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純)水：符合gb/t6682規(guī)定的一級(jí)水。乙腈(c2h3n)：色譜純(液相色譜用)。2.方法2.1對(duì)照品溶液的制備：取人參皂苷rg1對(duì)照品、人參皂苷re對(duì)照品及人參皂苷rb1對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，搖勻，即得。2.2供試品溶液的制備2.2.1《中國(guó)藥典》2015年版一部制備供試品方法：取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流3小時(shí)，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入100ml錐形瓶中，精密加水飽和正丁醇50ml，密塞，放置過(guò)夜，超聲處理(功率250w，頻率50khz)30分鐘，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25ml，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。2.2.2快速溶劑萃取法(ase)制備供試品方法：步驟s1：將樣品粉碎，過(guò)四號(hào)篩，取過(guò)篩后的粉末1g。步驟s2：裝于索氏提取器中，加入三氯甲烷，加熱回流4小時(shí)，三氯甲烷萃取液舍棄。步驟s3：將1g硅藻土和藥渣混合，移入放有纖維濾膜的ase10ml萃取池中，加硅藻土至與池口平行。步驟s4：放入快速萃取儀中進(jìn)行萃取，萃取溶劑為甲醇；萃取參數(shù)為：萃取溫度為110℃，萃取時(shí)間為10min，萃取次數(shù)為1次，沖洗體積為60％，吹掃時(shí)間為60s；采用美國(guó)dionex公司的ase350快速溶劑萃取儀。步驟s5：將萃取液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓⒓蛹状级ㄈ葜?0ml，取1ml加至裝有100mgpsa的2ml離心管中，離心，濾過(guò)，即得甲醇萃取液；步驟s6：采用hplc法檢測(cè)甲醇萃取液中的人參皂苷的含量；檢測(cè)參數(shù)為：色譜柱：thermosyncronisdim.aq，1.7μm，50×2.1mm，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫：50℃；流速：0.3ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm；流動(dòng)相：體積比為18～32：68～82的乙腈-水，采取如下所示的梯度洗脫：第0分鐘，流動(dòng)相中乙腈-水的體積比為18：82；第10分鐘，流動(dòng)相中乙腈-水的體積比為20：80；第18分鐘，流動(dòng)相中乙腈-水的體積比為30：70；第24分鐘，流動(dòng)相中乙腈-水的體積比為32：68；第25-28分鐘，流動(dòng)相中乙腈-水的體積比為18：82。hplc檢測(cè)方法所采用thermou3000uhplc液相色譜儀。理論板數(shù)按人參皂苷rg1峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。2.3測(cè)定法照高效液相色譜法(通則0512)測(cè)定分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。圖4為人參皂苷rg1、人參皂苷re和人參皂苷rb1的對(duì)照品圖譜圖；圖5為快速溶劑萃取樣品的圖譜圖；圖6為藥典方法提取樣品的圖譜圖。2.4標(biāo)準(zhǔn)限值要求本品按干燥品計(jì)算，含人參皂苷rg1(c42h72o14)和人參皂苷re(c48h82o18)的總量不得少于0.03％，人參皂苷rb1(c54h92o23)不得少于0.20％。2.5計(jì)算(外標(biāo)法)式中cr—對(duì)照品溶液濃度，單位為微克每升(mg/l)；ax—供試品的峰面積；ar—對(duì)照品峰面積。注意：1.使用前萃取池底部應(yīng)拆卸清理干凈，否則容易引起壓力不穩(wěn)；2.萃取池底部的濾紙應(yīng)在密封圈內(nèi)，否則引起滲漏；3.萃取池裝樣時(shí)松緊適中，太松容易導(dǎo)致提取液過(guò)多；4.開機(jī)前檢查氣瓶氣壓是否達(dá)到1mpa；5.使用結(jié)束后清理干凈，萃取池要及時(shí)晾干(容易生銹)。3結(jié)果3.1線性關(guān)系取人參皂苷rg1對(duì)照品、人參皂苷re對(duì)照品及人參皂苷rb1對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每1ml約含0.2mg的溶液，即得，然后分別精密吸取該溶液0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl、3.0μl進(jìn)入lc測(cè)定，并依照上述方法測(cè)定。人參皂苷rg1的線性試驗(yàn)結(jié)果見表1，以濃度(mg)-峰面積進(jìn)行線性回歸，詳見圖1；人參皂苷re的線性試驗(yàn)結(jié)果見表1，以濃度(mg)-峰面積進(jìn)行線性回歸，詳見圖1；人參皂苷rb1的線性試驗(yàn)結(jié)果見表1，以濃度(mg)-峰面積進(jìn)行線性回歸，詳見圖1；均呈良好的線性關(guān)系。表1濃度(mg)第一針峰面積第二針峰面積平均峰面積0.091194.530595.253594.89200.1822193.4512190.5894192.02030.2733290.9406290.9534290.94700.3644386.9019388.6348387.76840.5466581.2774579.8252580.5513表2濃度(mg)第一針峰面積第二針峰面積平均峰面積0.101389.863691.199190.53140.2026185.5257181.4935183.50960.3039282.7353281.9074282.32140.4052369.5435378.2917373.91760.6078574.6941568.6457571.6699表3濃度(mg)第一針峰面積第二針峰面積平均峰面積0.086849.030348.671448.85090.173596.817396.518196.66770.2603148.6210146.6620147.64150.3470200.9043204.7011202.80270.5205320.7283317.2293318.97883.2精密度試驗(yàn)取人參皂苷rg1(濃度：0.1822mg/ml)、人參皂苷re(濃度：0.2026mg/ml)及人參皂苷rb1(濃度：0.1735mg/ml)對(duì)照品混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，人參皂苷rg1、人參皂苷re及人參皂苷rb1峰面積rsd分別為0.5％，1.1％，0.5％表明儀器精密度良好。3.3重復(fù)性試驗(yàn)取相同批號(hào)的樣品1g，共3份，精密稱定，按4.2.2ase提取方法提取供試品溶液，進(jìn)樣量為1μl，以上述的色譜條件平行試驗(yàn)，測(cè)得樣品中人參皂苷的含量見表4，rg1、re、和rb1的rsd分別為1.3％、0.9％和2.7％，試驗(yàn)表明ase提取方法重復(fù)性良好。表43.4樣品不同儀器提取結(jié)果及與藥典方法結(jié)果比較(1批)樣品使用不同儀器提取的結(jié)果見表5，使用ase法提取的樣品含量與使用藥典方法提取的樣品含量的結(jié)果比較見表6。表5表64討論：4.1ase提取溶劑的選擇：試驗(yàn)中曾對(duì)甲醇、正己烷飽和的甲醇、50％乙醇等提取溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果顯示采用正己烷飽和的甲醇提取樣品雜質(zhì)最少，但人參皂苷含量偏低，而采用50％乙醇和甲醇提取人參皂苷含量與使用藥典方法提取的含量較一致，但50％乙醇提取后雜質(zhì)峰比使用甲醇高很多，故采用操作簡(jiǎn)單的、成本低的甲醇作為提取溶劑。4.2ase凈化步驟的選擇：實(shí)驗(yàn)中曾對(duì)凈化條件進(jìn)行考察，包括在萃取池底部加入適量的中性氧化鋁和硅膠作為凈化劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在萃取池中添加凈化劑提取出的雜質(zhì)與未添加無(wú)明顯差別，實(shí)驗(yàn)中還考察了在提取完樣品后，使用提取液添加適量的c18、psa、gcb進(jìn)行凈化再上機(jī)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)psa和c18凈化對(duì)樣品的含量基本無(wú)影響而gcb會(huì)對(duì)皂苷有吸附，而psa凈化效果最好，故采用psa進(jìn)行凈化。4.3ase提取條件的優(yōu)化我們采用3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)方案l9(33)安排實(shí)驗(yàn)，考察了萃取溫度、靜態(tài)萃取時(shí)間、循環(huán)次數(shù)，3個(gè)因素對(duì)加速溶劑萃取人參中人參皂苷的影響(見表7)。確定從人參中提取人參皂苷的最佳快速溶劑萃取工藝，結(jié)果見表8。表7表8因素溫度時(shí)間次數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)111110.91實(shí)驗(yàn)212221.005實(shí)驗(yàn)313330.986實(shí)驗(yàn)421231.033實(shí)驗(yàn)522311.1實(shí)驗(yàn)623121.064實(shí)驗(yàn)731320.946實(shí)驗(yàn)832131.071實(shí)驗(yàn)933211.13均值10.9670.9631.0151.047均值21.0661.0591.0561.005均值31.0491.0601.0111.030極差0.0990.0970.0450.042由極差分析可以看出，提取溫度對(duì)人參皂苷的含量影響最大，其次是靜態(tài)萃取時(shí)間和提取次數(shù)。最終確定最佳提取工藝組合為提取溫度120℃，提取時(shí)間8min，提取次數(shù)3次。以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12