本發(fā)明屬于中藥飲片質(zhì)量控制領(lǐng)域，具體涉及一種醋狼毒的質(zhì)量控制方法。

背景技術(shù)：

狼毒為大戟科大戟屬月腺大戟(euphorbiaebracteolatahayata)或狼毒大戟(euphorbiafischerianasteud)的干燥根，具有逐水祛痰，破積殺蟲(chóng)之功效，藥性峻猛?！侗静菥V目》將其列入毒草類，臨床使用不當(dāng)可對(duì)皮膚、口腔及胃腸道粘膜產(chǎn)生強(qiáng)烈刺激，臨床主要可引起劇烈的腹痛、腹瀉、便血等消化道刺激，故應(yīng)用時(shí)需炮制。

醋狼毒臨床應(yīng)用廣泛，且有腸道毒副作用，但目前尚無(wú)統(tǒng)一的質(zhì)量控制方法，難以保證臨床安全及療效穩(wěn)定。狼毒屬于大戟科有毒中藥。大戟科有毒中藥中的二萜類成分被認(rèn)為既是有毒成分又是藥效成分。狼毒中也含有二萜類成分，包括西松烷型及巴豆烷型二萜類成分。

本發(fā)明采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定該藥中prostratin、pekinening兩種既是毒性成分又是藥效成分的二萜類指標(biāo)性成分的含量，制定了最高和最低限量，解決了醋狼毒質(zhì)量控制的難題，本發(fā)明針對(duì)醋狼毒提供了一種實(shí)用的質(zhì)量控制方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問(wèn)題：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)尚無(wú)統(tǒng)一的醋狼毒質(zhì)量控制方法，本發(fā)明提供一種醋狼毒的質(zhì)量控制方法。

技術(shù)方案：二萜類成分prostratin和pekinening在醋狼毒質(zhì)量控制中的應(yīng)用。

具體方法為通過(guò)測(cè)定醋狼毒中二萜類成分prostratin和pekinening的含量來(lái)判定醋狼毒的質(zhì)量。

測(cè)定方法為采用高效液相色譜法測(cè)定：

色譜條件：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫25～35℃；雙波長(zhǎng)檢測(cè)：prostratin的檢測(cè)波長(zhǎng)236nm，pekinening的檢測(cè)波長(zhǎng)為273nm；以乙腈-0.1％甲酸的水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫；梯度洗脫程序：0～25min，75wt.％～85wt.％乙腈；25～30min，85wt.％～100wt.％乙腈；30～31min，100wt.％～75wt.％乙腈；31～35min，75wt.％～75wt.％乙腈；流速：1ml·min^-1；

對(duì)照品溶液的制備：分別取相同重量的prostratin、pekinening對(duì)照品各2.0～10.0mg，精密稱定，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)品母液；精密移取prostratin、pekinening單標(biāo)母液0.2～0.5ml混合，體積比1:1，并定容至10ml容量瓶中，配制為混標(biāo)溶液，備用；

供試品溶液的制備：取醋狼毒粉末0.5～2.0g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷，加熱回流提取至提取液無(wú)色，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得；

含量測(cè)定：精密吸取對(duì)照品及供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得醋狼毒中prostratin、pekinening含量。

醋狼毒中prostratin的含量范圍在0.055wt.％～0.020wt.％；pekinening的含量范圍在0.050wt.％～0.020wt.％。

有益效果：本發(fā)明對(duì)醋狼毒建立了質(zhì)量控制方法，該方法提供了利用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定醋狼毒中prostratin、pekinening兩種毒性及藥效成分含量的質(zhì)量控制方法，該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)便，且能更好地控制藥品的質(zhì)量。本發(fā)明的質(zhì)量控制方法，具有較強(qiáng)的專屬性和良好的重現(xiàn)性，真正體現(xiàn)藥品安全有效、質(zhì)量可控。

附圖說(shuō)明

圖1為混合對(duì)照品及12個(gè)炮制品的三氯甲烷提取物的hplc色譜圖；狼毒生品a)；狼毒醋品b)；對(duì)照品c)；prostratin1)；對(duì)照品pekinening2)；對(duì)照品pekineninsa3)

圖2狼毒中二萜類成分改變ht-29細(xì)胞中aqp3mrna水平變化圖與空白組比較，1)p<0.05

圖3狼毒中二萜類成分刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子的變化圖與空白組比較，1)p<0.05。

具體實(shí)施方式

結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明如下：

實(shí)施例1

1.兩種成分同時(shí)測(cè)定的含量測(cè)定方法為：

1.1藥材、儀器與試劑

自制的醋狼毒：稱取100g狼毒飲片(ld)，160℃條件下不斷均勻翻炒10min(cld1)、20min(cld2)、30min(cld3)、40min(cld4)至藥物表面呈棕黃色。炮制三批。獲得的樣品名分別為cld11、cld21、cld31、cld41、cld12、cld22、cld32、cld42、cld13、cld23、cld33、cld43。

waters2695-2489pda高效液相色譜系統(tǒng)；milli-q純水儀；bp211d電子天平(德國(guó)sartorius公司)；kq-500de型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

分析用對(duì)照品：prostratin純度均大于98％，購(gòu)自sigma；pekinening自制(wangkl,yuhl,wuh,wangxz,panyz,chenyq,liulp,jinyp,zhangcc.anewcasbanediterpenefromeuphorbiapekinensis.natprodres.natprodres.2015；29(15):1456-60.)，純度大于92％。hplc用甲醇、乙腈及甲酸均為色譜純，超純水；其余試劑均為分析純。

1.2方法與結(jié)果

1.2.1色譜條件

色譜條件：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫25～35℃；雙波長(zhǎng)檢測(cè)：prostratin的檢測(cè)波長(zhǎng)236nm，pekinening的檢測(cè)波長(zhǎng)為273nm；以乙腈-0.1％甲酸的水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫；梯度洗脫程序：0～25min，75wt.％～85wt.％乙腈；25～30min，85wt.％～100wt.％乙腈；30～31min，100wt.％～75wt.％乙腈；31～35min，75wt.％～75wt.％乙腈；流速：1ml·min^-1。對(duì)照品及醋狼毒樣品的hplc圖見(jiàn)圖1。

對(duì)照品溶液的制備：

含量測(cè)定：精密吸取對(duì)照品及供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得醋狼毒中prostratin、pekinening含量。

1.2.2對(duì)照品溶液的制備

分別取相同重量的prostratin、pekinening對(duì)照品各2.0mg，精密稱定，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)品母液。精密移取prostratin、pekinening單標(biāo)母液0.2ml混合，體積比1:1，并定容至10ml容量瓶中，配制為混標(biāo)溶液，備用。

1.2.3供試品溶液的制備

供試品溶液的制備：取醋狼毒粉末1.0g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷，加熱回流提取至提取液無(wú)色?；厥杖軇┲粮?，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4線性關(guān)系考察

取1.2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，精密稀釋至母液的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32，制備6個(gè)濃度水平的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，以峰面積和進(jìn)樣濃度建立每個(gè)目標(biāo)分析物的回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表1，所有化合物在檢測(cè)范圍內(nèi)有較好的線性。線性回歸分析結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)值>0.9990。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)良好的重現(xiàn)性。

表1兩種化合物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

1.2.6精密度試驗(yàn)

精密吸取1.2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察日內(nèi)精密度，連續(xù)分析3天，考察日間精密度。用于目標(biāo)分析物定量的精密度結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果顯示所有的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(rsd)值不超過(guò)5.0％。

1.2.7穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取1.2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液適量，于0h、4h、8h、12h、24h及48h測(cè)定樣品，考察定量分析的穩(wěn)定性。按照1.2.3項(xiàng)下供試品制備的方法制備6份樣品，分別進(jìn)樣，考察定量分析的重復(fù)性。用于目標(biāo)分析物定量的重復(fù)性、穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果顯示所有的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(rsd)值不超過(guò)5.0％。

1.2.8加樣回收率

取已知被測(cè)成分含量的樣品6份，精密稱定，分別精密加入一定量的被測(cè)成分對(duì)照品(加入量與所取樣品含量之比為1:1)，按1.2.3項(xiàng)下的方法制備樣品后進(jìn)樣。按回收率(％)＝(加標(biāo)樣品測(cè)定值-樣品測(cè)定值)/加標(biāo)量×100％計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2，所有待測(cè)成分的回收率值在95.00％～105.00％范圍內(nèi)，符合要求。

表2醋狼毒樣品重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度及加樣回收率的測(cè)定結(jié)果

1.2.9樣品含量測(cè)定

取1.2.2項(xiàng)下各藥物的混合對(duì)照品溶液及1.2.3項(xiàng)下各藥物供試品溶液，進(jìn)樣10μl，各批次醋狼毒色譜圖見(jiàn)圖1。將得到的各藥物中待測(cè)成分的峰面積代入線性方程中計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3狼毒及12批醋狼毒中兩種二萜類成分定量分析結(jié)果

2.狼毒生醋品對(duì)腸道腹瀉的影響

2.1方法

參考《中國(guó)藥典》2015版狼毒的人用劑量，以人一天所用劑量3g/天的等效量作為小鼠的劑量組，生醋品的劑量為0.45生藥/kg(低劑量)、4.5g生藥/kg(高劑量)。空白組灌胃給藥0.5％cmc-na溶液0.03ml·g^-1；給藥組參照各部位得率，分別稱取生、醋品的95％乙醇提取物適量，再以0.5％cmc-na溶液溶解，配成合適的濃度，作為小鼠灌胃給藥的備用液。

取icr小鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水24h，隨機(jī)分為空白組、生品組、醋品組；除空白外，各給藥組均設(shè)立高、低劑量?jī)蓚€(gè)組，每組6只。灌胃給藥3小時(shí)期間收集小鼠糞便，3小時(shí)后脫勁椎處死，立即剪開(kāi)腹部皮膚和腹膜，暴露腸管，分離腸系膜，截取部分十二指腸、結(jié)腸，用電子天平稱取各腸道濕重，及烘干后各腸道干重，計(jì)算腸道含水量；并截取部分各部位腸道，置于凍存管中，液氮急速冷凍后放置于-80℃冰箱保存。糞便放置干燥器中干燥后測(cè)量干重，計(jì)算糞便含水量。

2.2結(jié)果

由表4可見(jiàn)，狼毒炮制不同時(shí)間對(duì)小鼠糞便含水量有顯著差異。醋制20min后狼毒產(chǎn)生腹瀉的毒副作用顯著降低。

表4狼毒及4批不同炮制時(shí)間醋狼毒對(duì)小鼠糞便含水量的影響

注：與空白組相比，**p<0.01，*p<0.05

3.狼毒生醋品對(duì)利尿作用的影響

3.1方法

參考《中國(guó)藥典》2015版狼毒的人用劑量，以人一天所用劑量3g/天的等效量作為大鼠的劑量，生醋品的劑量為0.45g生藥/kg。分別取生、醋狼毒飲片，打粉過(guò)4號(hào)篩，再用0.5％cmc-na生理鹽水溶液混懸。每100g大鼠給藥1ml。

將sd大鼠稱重，放入大鼠代謝籠喂養(yǎng)2d，自由飲水，期間觀察大鼠的尿量是否穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)前24h禁食不禁水。取上述合格sd大鼠按照體重隨機(jī)分為8組，每組6只。生理鹽水組，陽(yáng)性藥組，生、醋狼毒組以及模型組。用藥前先以蒸餾水2.5ml/100g給大鼠灌胃，半小時(shí)后給藥。收集其后5h內(nèi)的尿量。

3.2結(jié)果

狼毒炮制10～30min，其利尿作用并未降低，但炮制到40min其利尿作用顯著下降。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5狼毒炮制前后大鼠利尿作用的影響

注：與生理鹽水組相比，**p<0.01，*p<0.05。

依據(jù)狼毒醋制前后毒性、藥效作用，及醋制前后兩種二萜類成分含量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)prostratin的含量的高于0.055％或pekinening高于0.050％時(shí)，狼毒仍然具有腸道毒性。當(dāng)prostratin的含量的低于0.020％或pekinening低于0.020％時(shí)，狼毒利尿作用降低。故本發(fā)明限定prostratin的含量范圍在0.055wt.％～0.020wt.％；pekinening的含量范圍在0.050wt.％～0.020wt.％。