本發(fā)明涉及表面等離子共振譜儀抗污染芯片制備領(lǐng)域，特別是涉及一種基于賴(lài)氨酸改性、粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片的制作方法。

背景技術(shù)：

表面等離子共振(surfaceplasmonresonance，簡(jiǎn)稱(chēng)spr)儀是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一種生物傳感器技術(shù)，當(dāng)入射光從高折射率介質(zhì)入射到低折射率介質(zhì)時(shí)，會(huì)發(fā)生全反射，此時(shí)若在介質(zhì)交界面處鍍一層金屬薄膜(金或銀)，入射光產(chǎn)生的漸逝波會(huì)引起金屬表面自由電子發(fā)生集體振蕩，進(jìn)而形成等離子體，當(dāng)漸逝波與表面等離子體振蕩的頻率和波數(shù)相等時(shí)，即產(chǎn)生共振現(xiàn)象(spr)，導(dǎo)致能量從漸逝波轉(zhuǎn)移到表面等離子波中，使反射光的強(qiáng)度大大減弱，呈現(xiàn)衰減全反射現(xiàn)象，當(dāng)反射光的強(qiáng)度為零時(shí)的入射角稱(chēng)為共振角。共振角與金屬薄膜界面介質(zhì)折射率有關(guān)，而折射率又隨結(jié)合在金屬薄膜表面的分子質(zhì)量而變化，故可通過(guò)分析共振角來(lái)獲得分子間相互作用的信息，由于其具有檢測(cè)快速且無(wú)需標(biāo)記等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物研發(fā)、臨床診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，并且顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

spr芯片是表面等離子共振儀最為核心的組件，提供產(chǎn)生spr信號(hào)的必須物理?xiàng)l件，主要包括耦合器件、金屬膜和表面基質(zhì)。然而，應(yīng)用表面等離子共振儀進(jìn)行分析測(cè)試時(shí)，傳感芯片的表面污染是一個(gè)普遍存在的問(wèn)題，來(lái)自樣品中的生物分子或微生物的非特異性吸附將降低定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。因此，開(kāi)發(fā)有效抵抗非特異性吸附的表面是提高表面等離子共振傳感器靈敏度和精確度的首要問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種基于賴(lài)氨酸改性的粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片的制作方法，該方法相對(duì)簡(jiǎn)便且制得的芯片具有較強(qiáng)的抗蛋白能力。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的：

一種基于賴(lài)氨酸改性、粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片的制作方法，包括以下步驟：

a)裸金芯片制備：采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在基底上涂覆一層2‐3nm厚鉻層和一層47‐48nm厚金膜，獲得裸金芯片；

b)裸金芯片預(yù)處理：將步驟a)獲得的裸金芯片浸入水、30wt％濃氨水與30wt％雙氧水按體積比3:1:1組成的混合溶液中，在70‐90℃下浸泡10‐20min，然后取出，用去離子水清洗3次，用氮?dú)獯蹈蓚溆茫?/p>

c)粘蛋白溶液預(yù)處理：用ph為7.4的磷酸緩沖液配制3‐5mg/ml粘蛋白溶液，所得的溶液以9000‐12000rpm離心10分鐘，去除聚集的蛋白；

d)粘蛋白修飾：將氮?dú)獯蹈珊蟮膕pr芯片用柏油貼合到spr系統(tǒng)的棱鏡上，以ph為6‐8的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，流速為50‐100μl/min持續(xù)流過(guò)spr芯片表面，待基線(xiàn)穩(wěn)定時(shí)，注入100μl預(yù)處理后的粘蛋白，并以30‐50μl/min的速度流過(guò)流通池，當(dāng)出現(xiàn)信號(hào)時(shí)，停止流速，孵育10‐20min，再以50‐100μl/min的流速走緩沖液10‐30min，用于清洗未結(jié)合牢固的粘蛋白；

e)賴(lài)氨酸改性：以ph為6‐8的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，流速為50‐100μl/min，待基線(xiàn)平穩(wěn)后，往定量環(huán)內(nèi)注入100μl1‐乙基‐3‐(3‐二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺)(edc)和n‐羥基硫代琥珀酰亞胺(nhs)的混合溶液，所述混合溶液中1‐乙基‐3‐(3‐二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺的濃度為0.2‐0.6m，n‐羥基硫代琥珀酰亞胺的濃度為0.1‐0.2m，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)所述混合溶液到達(dá)粘蛋白修飾后的芯片表面，10‐20min后注入100μl濃度為1‐4mg/ml的賴(lài)氨酸，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)賴(lài)氨酸溶液到達(dá)芯片表面，經(jīng)過(guò)乙醇胺封閉后，10‐30min后獲得賴(lài)氨酸改性的spr傳感芯片。

所述的基底為玻璃片或光纖，玻璃片基底優(yōu)選bk7玻璃片。

步驟1)中所述的金膜還可以是銀膜、硅烷膜或銀/金復(fù)合膜。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1)本發(fā)明制備的spr芯片在單一蛋白體系以及ph＝7.4的復(fù)雜體系均具有較強(qiáng)的抗污染性能，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)單一蛋白溶液如溶菌酶、牛血清蛋白、羊免疫球蛋白溶液中蛋白的非特異性吸附量分別為3.68ng/cm²、6.20ng/cm²、8.64ng/cm²，相比裸金對(duì)復(fù)雜體系如10％、50％人血漿中蛋白的非特異性吸附量分別降低了88.9％和84.7％。

2)本發(fā)明制備的spr芯片由于其組成為蛋白以及氨基酸，故具有良好的生物相容性。

3)本發(fā)明制備的spr芯片具有高穩(wěn)定性，干燥狀態(tài)下儲(chǔ)存2個(gè)月或室溫條件下儲(chǔ)存3個(gè)月后，抗污染性能無(wú)變化。

4)本發(fā)明的制備方法相對(duì)簡(jiǎn)便快速，有很好的可行性和普適性，解決了以往多步繁瑣的制備過(guò)程，極大地提高了芯片表面修飾的效率。

5)本發(fā)明制備的spr芯片表面的抗污染材料具有生物可降解性。

6)本發(fā)明制備的spr芯片易于自組裝到各種表面，形成穩(wěn)定規(guī)整的單分子層。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的方法制備的spr芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中賴(lài)氨酸改性的粘蛋白spr芯片對(duì)2mg/ml溶菌酶、2mg/ml牛血清蛋白(bsa)以及0.5mg/ml的羊免疫球蛋白(igg)溶液中蛋白的非特異性吸附量。

其中：

1-玻璃片基底2-鉻層3-金膜層4-賴(lài)氨酸改性的粘蛋白自組裝單分子層。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的方法制作的芯片包括基底(優(yōu)選bk7玻璃片)，上面鍍有2-3nm的鉻層和47-48nm的金膜層，兩親性的粘蛋白通過(guò)蛋白骨架的疏水基團(tuán)連接到金膜表面，然后利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺將粘蛋白側(cè)鏈上糖殘基的羧基基團(tuán)活化并用于偶聯(lián)賴(lài)氨酸，從而獲得基于賴(lài)氨酸改性的粘蛋白表面等離子共振儀芯片。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的制作方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

一種基于賴(lài)氨酸改性、粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片的制作方法，包括以下步驟：

a)采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在bk7玻璃基底上涂覆一層2nm厚的鉻層和一層48nm厚的金膜，獲得了裸金芯片。

b)裸金芯片預(yù)處理：將獲得的裸金芯片浸入水、30％濃氨水與30％雙氧水(體積比3:1:1)的混合溶液中，70℃下浸泡20min。然后取出，用去離子水清洗3次，用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

c)粘蛋白溶液預(yù)處理：用ph為7.4的磷酸緩沖液配制5mg/ml粘蛋白(從豬的胃部分泌得)溶液，所得的溶液以11000rpm離心10分鐘去除聚集的蛋白。

d)粘蛋白修飾將氮?dú)獯蹈珊蟮膕pr芯片用柏油貼合到spr系統(tǒng)的棱鏡上。以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，流速為100μl/min持續(xù)流過(guò)spr芯片表面，待基線(xiàn)穩(wěn)定時(shí)，注入100μl預(yù)處理后的粘蛋白，并以50μl/min的速度流過(guò)流通池，當(dāng)出現(xiàn)信號(hào)時(shí)，停止流速，孵育20min，再以100μl/min的流速走緩沖液10min，用于清洗未結(jié)合牢固的粘蛋白。

e)賴(lài)氨酸改性：以ph值為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，流速為100μl/min。待基線(xiàn)平穩(wěn)后，往定量環(huán)中內(nèi)注入100μl1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(edc，濃度為0.4m)和n-羥基硫代琥珀酰亞胺(nhs，濃度為0.1m)的混合溶液，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)edc/nhs溶液到達(dá)芯片表面。10min后注入100μl賴(lài)氨酸(lysine，2mg/ml)，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)賴(lài)氨酸溶液到達(dá)芯片表面，經(jīng)過(guò)乙醇胺封閉后，30min后獲得賴(lài)氨酸改性的spr傳感芯片。

以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，流速為100μl/min。待基線(xiàn)平穩(wěn)后，往定量環(huán)中注入100μl0.5mg/ml的羊免疫球蛋白(igg)或2mg/ml的牛血清白蛋白(bsa)或2mg/ml的溶菌酶(lysozyme)或10％人血漿或50％人血漿，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)蛋白溶液到達(dá)芯片表面，由spr系統(tǒng)測(cè)定共振角實(shí)時(shí)變化曲線(xiàn)，20min后讀取spr共振角變化值，并計(jì)算非特異性吸附量分別為：8.64ng/cm²、6.20ng/cm²、3.68ng/cm²，相比裸金對(duì)復(fù)雜體系如10％、50％人血漿中蛋白的非特異性吸附量分別降低了88.9％和84.7％。

該芯片在干燥狀態(tài)下儲(chǔ)存2個(gè)月或室溫條件下儲(chǔ)存3個(gè)月后，抗污染性能無(wú)變化。

實(shí)施例2

一種基于賴(lài)氨酸改性、粘蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片的制作方法，包括以下步驟：

a)采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在bk7玻璃基底上涂覆一層3nm厚鉻層和一層47nm厚金膜，獲得了裸金芯片。

b)裸金芯片預(yù)處理：將獲得的裸金芯片浸入水、30％濃氨水與30％雙氧水(體積比3:1:1)混合溶液中，80℃下浸泡10min。然后取出用去離子水清洗3次，用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

c)粘蛋白溶液預(yù)處理：用ph為7.4的磷酸緩沖液配制3mg/ml粘蛋白(從豬的胃部分泌得)溶液，所得的溶液以9000rpm離心十分鐘去除聚集的蛋白。

d)粘蛋白修飾：將清洗后的spr芯片用柏油貼合到spr系統(tǒng)的棱鏡上。以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，流速為50μl/min持續(xù)流過(guò)表面，待基線(xiàn)穩(wěn)定時(shí)，注入100μl的預(yù)處理后的粘蛋白，并以30μl/min的速度流過(guò)流通池，當(dāng)出現(xiàn)信號(hào)時(shí)，停止流速，孵育10min，再以50μl/min的流速走緩沖液20min，用于清洗未結(jié)合牢固的粘蛋白。

e)賴(lài)氨酸改性：以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，流速為50μl/min。待基線(xiàn)平穩(wěn)后，往定量環(huán)中內(nèi)注入100μl1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(edc，濃度為0.6m)和n-羥基硫代琥珀酰亞胺(nhs，濃度為0.2m)的混合溶液，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)edc/nhs溶液到達(dá)芯片表面。20min后注入100μl賴(lài)氨酸(lysine，1mg/ml)，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)賴(lài)氨酸溶液到達(dá)芯片表面，經(jīng)過(guò)乙醇胺封閉后，10min后獲得賴(lài)氨酸改性的spr傳感芯片。

以ph為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，流速為50μl/min。待基線(xiàn)平穩(wěn)后，往定量環(huán)中注入100μl0.5mg/ml的羊免疫球蛋白(igg)或2mg/ml的牛血清白蛋白(bsa)或2mg/ml溶菌酶或10％人血漿或50％人血漿，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)蛋白溶液到達(dá)芯片表面，由spr系統(tǒng)測(cè)定共振角實(shí)時(shí)變化曲線(xiàn)，20min后讀取spr共振角變化值，并計(jì)算非特異性吸附量分別為：9.81ng/cm²、7.52ng/cm²、3.96ng/cm²，相比裸金對(duì)復(fù)雜體系如10％、50％人血漿中蛋白的非特異性吸附量分別降低了85.6％和82.4％。

該芯片在干燥狀態(tài)下儲(chǔ)存2個(gè)月或室溫條件下儲(chǔ)存3個(gè)月后，抗污染性能無(wú)變化。