本發(fā)明涉及抗體片段修飾的微懸臂梁(以下也簡(jiǎn)稱(chēng)為微梁)，及其制備方法。本發(fā)明還公開(kāi)了基于所述抗體片段修飾的微梁的免疫傳感檢測(cè)系統(tǒng)和檢測(cè)方法，所述系統(tǒng)和方法可應(yīng)用于食品安全、環(huán)境污染、生物醫(yī)學(xué)、科學(xué)研究和生產(chǎn)制造等領(lǐng)域的監(jiān)控和檢測(cè)。

背景技術(shù)：

免疫傳感技術(shù)的原理是基于檢測(cè)抗原抗體的特異性配對(duì)反應(yīng)，即針對(duì)需要檢測(cè)的某種靶標(biāo)分子(抗原)，通過(guò)生物免疫(把抗原注入小動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的)方法，產(chǎn)生出相應(yīng)的探針?lè)肿?抗體)，提取、純化出這種探針?lè)肿樱倮每乖贵w的特異性結(jié)合去檢測(cè)樣品中的靶分子。已有的免疫傳感技術(shù)如：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA，原理是利用抗原與抗體的特異性反應(yīng)與酶標(biāo)的催化放大來(lái)進(jìn)行)和免疫熒光法(IF，原理是用熒光片段標(biāo)記抗原或抗體)，均需要標(biāo)記物來(lái)示蹤抗原抗體的反應(yīng)結(jié)果，就是說(shuō)僅有抗體，并不能建立相應(yīng)的檢測(cè)方法，還需要有酶標(biāo)物或熒光標(biāo)記物或蛋白復(fù)合物。而一些難制備的靶標(biāo)分子的標(biāo)記物價(jià)格昂貴，或幾乎不可能制備或購(gòu)買(mǎi)。同時(shí)酶聯(lián)免疫試劑盒和蛋白芯片的檢測(cè)從原理操作上都要求每一步反應(yīng)完后進(jìn)行清洗，標(biāo)記過(guò)程繁瑣耗時(shí)，是事后的檢測(cè)，不能實(shí)時(shí)，原位、在線的檢測(cè)。

基于表面應(yīng)力檢測(cè)的微懸臂梁免疫傳感技術(shù)是近年出現(xiàn)的一種新的免疫生化傳感方法^[1]，其原理是：把探針(抗原或抗體)分子用直接或間接的方式固定(修飾)到微梁一側(cè)的鍍金層上，當(dāng)被檢測(cè)樣品液中的靶分子與微梁金表面上的探針?lè)肿影l(fā)生免疫生化反應(yīng)時(shí)，會(huì)使微梁表面應(yīng)力改變，從而導(dǎo)致微梁彎曲變形，通過(guò)光學(xué)或電學(xué)方法檢測(cè)這種變形的過(guò)程，可得到免疫生化反應(yīng)的實(shí)時(shí)信息?；诿庖咛禺愋宰R(shí)別建立的微梁免疫傳感技術(shù)與傳統(tǒng)的需要標(biāo)記物的免疫傳感方法相比，它無(wú)需使用任何酶標(biāo)、熒光物質(zhì)和放射性作為反應(yīng)示蹤劑，消除了標(biāo)記過(guò)程的影響，靈敏度高(比酶聯(lián)免疫試驗(yàn)高數(shù)倍^[2-4])，還可以通過(guò)監(jiān)測(cè)微梁變形來(lái)實(shí)時(shí)、定量的監(jiān)測(cè)抗原抗體的反應(yīng)過(guò)程，得到更豐富的免疫生化反應(yīng)的信息。經(jīng)過(guò)這些年的發(fā)展，微梁傳感被作為一種新興技術(shù)，在生物工程和環(huán)境污染監(jiān)測(cè)技術(shù)等方面與傳統(tǒng)的方法進(jìn)行對(duì)比研究，如RNA轉(zhuǎn)錄因子、酶、汞排放及揮發(fā)性化合物等，優(yōu)于常規(guī)的酶聯(lián)免疫方法。但即使如此，微懸臂梁免疫傳感技術(shù)的檢測(cè)靈敏度還不足以在成本方面獲得相對(duì)于常規(guī)酶聯(lián)免疫法的巨大優(yōu)勢(shì)，即如果微懸臂梁免疫傳感技術(shù)的靈敏度或檢測(cè)極限只比酶聯(lián)免疫法高數(shù)倍，而微懸臂梁免疫傳感技術(shù)的設(shè)備成本與酶聯(lián)免疫相對(duì)較高，使得微懸臂梁免疫傳感技術(shù)難以商業(yè)化。

目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的方法主要是利用具有雙功能基團(tuán)的疏基化試劑的疏基(-SH)抓住微梁表面的金表面，和另一功能團(tuán)抓住抗體，實(shí)現(xiàn)抗體在微梁鍍金層上的固定。例如先將巰基化試劑11-羧酸硫醇結(jié)合到微梁的金表面，活化其上的羧基，使之與抗體上的氨基結(jié)合來(lái)固定抗體(圖2)?；蛴靡环N巰基化試劑鹽酸硫醇亞胺，通過(guò)與抗體反應(yīng)，使抗體連接一個(gè)帶巰基的分子基團(tuán)，再通過(guò)這個(gè)巰基將抗體聯(lián)結(jié)到微梁的金表面上(中國(guó)專(zhuān)利CN101407548)(見(jiàn)圖3)。這些方法固定抗體，存在如下共同的問(wèn)題，(1)Y字形抗體(見(jiàn)圖1)的Fc段或Fab段的頂端部，會(huì)等概率的被固定在金表面上(見(jiàn)圖2、3)，沒(méi)有方向性^[5]。而當(dāng)Fab段的頂端被固定在金表面上時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)被遮擋，限制了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)與抗原的充分結(jié)合，從而降低了微梁傳感靈敏度；(2)抗體與微梁之間存在不同數(shù)目C原子的單鏈分子，降低了抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生的應(yīng)力傳遞到梁上的效率。由此可見(jiàn)，中國(guó)專(zhuān)利CN101407548中公開(kāi)的方法的靈敏度與酶聯(lián)免疫法相比僅提高數(shù)倍，還無(wú)法達(dá)到商業(yè)化或用于極微量被分析物的檢測(cè)。

因此，在本領(lǐng)域中存在著改進(jìn)微梁表面與抗體的結(jié)合和設(shè)計(jì)從而進(jìn)一步提高微梁免疫傳感靈敏度和效率的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

綜上所述，在已有的微梁免疫傳感技術(shù)報(bào)道中，最突出的問(wèn)題就是檢測(cè)靈敏度。影響微梁免疫傳感器靈敏度的因素主要有三個(gè)方面：①抗體的靈敏度(或抗體與抗原結(jié)合的親和性)、②微梁上抗體的固定方法和③微梁的設(shè)計(jì)與信號(hào)讀出。由于抗體的靈敏度和微梁的規(guī)格與信號(hào)讀出方式在微梁免疫傳感器系統(tǒng)成型之后就無(wú)法改變，唯一可變的是微梁表面抗體的固定方法。一種合適的微梁表面抗體的修飾方法，能使固定在微梁表面的抗體與樣品溶液中的抗原充分結(jié)合，并能高效地將抗原抗體結(jié)合所產(chǎn)生的應(yīng)力變化傳遞到微梁表面?？贵w在微梁表面固定的方向性、密度、活性以及抗體與微梁表面之間的聯(lián)接分子的長(zhǎng)度與剛性都有可能影響最終檢測(cè)的靈敏度。

鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明用于解決上述問(wèn)題的技術(shù)方案是通過(guò)1)減少抗體分子結(jié)合位點(diǎn)以外的抗體分子質(zhì)量和體積，2)取消使用連接微梁鍍金表面與抗體分子的過(guò)渡分子層(巰基化試劑)，3)提供一種制備鍍金表面上定向固定有抗體片段的微梁的方法，達(dá)到提高微梁免疫檢測(cè)方法的靈敏度目的。

抗體Ig分子的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1，包括兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段(Fab)和一個(gè)可結(jié)晶片段(Fc)，F(xiàn)ab和Fc通過(guò)中間的鉸鏈區(qū)連接，構(gòu)成Y字形結(jié)構(gòu)。Fab的頂端為與抗原分子的結(jié)合位點(diǎn)。在免疫球蛋白抗體分子的“Y”字形四肽鏈結(jié)構(gòu)(圖1)中，由兩條完全相同的重鏈和兩條完全相同的輕鏈以二硫鍵連接而成。對(duì)于Fc段修飾在微梁的鍍金表面上時(shí)(抗體修飾的定向性好)，抗體對(duì)稱(chēng)(Fab段)的兩個(gè)上端部抗原結(jié)合位點(diǎn)與抗原結(jié)合后產(chǎn)生的應(yīng)力，通過(guò)抗體Y字型的腿部(Fc段)傳遞到鍍金微梁表面?？贵w(IgG)的分子量約150kDa，如果被檢測(cè)的抗原分子分子量為數(shù)百Da，抗體抗原質(zhì)量比近1000。參與抗原分子結(jié)合的位點(diǎn)由重鏈和輕鏈的高變區(qū)(VH和VL)構(gòu)成，其與抗原分子的質(zhì)量比約150，而抗體分子上不參加與抗原分子結(jié)合的Fc段，其與抗原分子的質(zhì)量比近400。因此我們?cè)O(shè)想，如果能夠減少結(jié)合位點(diǎn)以外的抗體分子質(zhì)量和體積，保持抗體的結(jié)合位點(diǎn)朝向固定表面的外法線方向，就能夠提高應(yīng)力的傳遞效率和抗體在微梁表面的有效修飾密度，從而提高微梁免疫傳感的靈敏度。

為此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制備微懸臂梁的方法，包括以下步驟：

1)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁；

2)二硫鍵還原步驟：使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個(gè)對(duì)稱(chēng)的帶有巰基的半抗體片段；

3)固定步驟：將步驟2)獲得的半抗體片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金表面上固定有所述半抗體片段的微懸臂梁。

在第二個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種制備微懸臂梁的方法，包括以下步驟：

1)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁；

2)酶解步驟：用蛋白酶將所述抗體裂解成F(ab’)₂片段和多個(gè)小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合；

3)二硫鍵還原步驟：使用二硫鍵還原劑處理所述F(ab’)₂片段，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個(gè)對(duì)稱(chēng)的帶有巰基的Fab’片段；

4)固定步驟：將步驟3)獲得的Fab’片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金表面上固定有所述Fab’片段的微懸臂梁。

在第三個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種制備微懸臂梁的方法，包括以下步驟：

1)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁；

2)二硫鍵還原步驟：使用二硫鍵還原劑處理所抗體，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個(gè)對(duì)稱(chēng)的帶有巰基的半抗體片段；

3)酶解步驟：用蛋白酶將所述半抗體片段裂解成Fab’片段和多個(gè)小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合；

4)固定步驟：將步驟3)獲得的Fab’片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金層上固定有所述Fab’片段的微懸臂梁。

在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種應(yīng)力傳感元件，其包括基于應(yīng)力的微懸臂梁，所述微懸臂梁的鍍金層上固定有抗體的半抗體片段或Fab’片段。所述微懸臂梁優(yōu)選通過(guò)本發(fā)明的方法制備而成。

在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種基于應(yīng)力的微懸臂梁免疫傳感檢測(cè)系統(tǒng)，其包括本發(fā)明的應(yīng)力傳感元件。

在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種使用微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)免疫傳感檢測(cè)待測(cè)樣品的方法，包括以下步驟：

1)提供對(duì)靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)，所述微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)包括反應(yīng)池和帶有鍍金層的基于應(yīng)力的微懸臂梁；

2)使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個(gè)對(duì)稱(chēng)的帶有巰基的半抗體片段；

3)將步驟2)獲得的半抗體片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金層上固定有所述半抗體片段的微懸臂梁；

4)將步驟3)獲得的固定有所述半抗體片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)的反應(yīng)池中；

5)將待測(cè)樣品加入至步驟4)獲得的微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)中，檢測(cè)待測(cè)樣品中是否存在所述靶抗原。

在第七個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種使用微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)免疫傳感檢測(cè)待測(cè)樣品的方法，包括以下步驟：

1)提供對(duì)靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)，所述微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)包括反應(yīng)池和帶有鍍金層的基于應(yīng)力的微懸臂梁；

2)用蛋白酶將所述抗體裂解成F(ab’)₂片段和多個(gè)小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合；

3)使用二硫鍵還原劑處理所述F(ab’)₂片段，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個(gè)對(duì)稱(chēng)的帶有巰基的Fab’片段；

4)將步驟3)獲得的Fab’片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金層上固定有所述Fab’片段的微懸臂梁；

5)將步驟4)獲得的固定有所述Fab’片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)的反應(yīng)池中；

6)將待測(cè)樣品加入至步驟5)獲得的微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)中，檢測(cè)待測(cè)樣品中是否存在所述靶抗原。

在第八個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種使用微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)免疫傳感檢測(cè)待測(cè)樣品的方法，包括以下步驟：

1)提供對(duì)靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)，所述微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)包括反應(yīng)池和帶有鍍金層的基于應(yīng)力的微懸臂梁；

2)使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個(gè)對(duì)稱(chēng)的帶有巰基的半抗體片段；

3)用蛋白酶將所述半抗體片段裂解成Fab’片段和多個(gè)小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合；

4)將步驟3)獲得的Fab’片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金層上固定有所述Fab’片段的微懸臂梁；

5)將步驟4)獲得的固定有所述Fab’片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)的反應(yīng)池中；

6)將待測(cè)樣品加入至步驟5)獲得的微懸臂梁傳感檢測(cè)系統(tǒng)中，檢測(cè)待測(cè)樣品中是否存在所述靶抗原。

本發(fā)明的有益效果：

鑒于微梁免疫傳感檢測(cè)技術(shù)中抗體固定的重要性及巰基化試劑參與抗體固定的復(fù)雜性，本發(fā)明用二硫鍵還原劑將抗體拆分成帶有巰基的對(duì)稱(chēng)的半抗體片段，或在拆分之前或之后通過(guò)蛋白酶消化從而獲得Fab’片段，然后將獲得的半抗體片段或Fab’片段通過(guò)自帶的雙巰基固定到微梁的金表面上。結(jié)果表明，本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的微梁免疫方法相比較具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1)半抗體片段或Fab’片段通過(guò)自帶的雙巰基，直接固定到微梁鍍金表面，一步完成，操作簡(jiǎn)單；

2)半抗體片段或Fab’片段與微梁表面之間沒(méi)有附加的其它的分子，有利于應(yīng)力傳遞；

3)減少了抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)以外的抗體分子質(zhì)量和體積；

4)減小了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)到梁表面距離，提高應(yīng)力的傳遞效率；

5)半抗體片段或Fab’片段與微梁表面之間的雙巰基固定的較單巰基分子鏈聯(lián)結(jié)的剛性要大，更有益于抗原抗體反應(yīng)的作用力傳遞到梁上；

6)通過(guò)自身雙巰基一步完成固定，固定的抗原結(jié)合位點(diǎn)密度高，穩(wěn)定性好；

7)鍍金表面上固定的抗體的方向性好，易于與抗原結(jié)合。

附圖說(shuō)明

圖1為典型的抗體分子結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為羧酸硫醇類(lèi)化合物和雙功能交聯(lián)劑法固定抗體示意圖。

圖3為鹽酸硫醇亞胺法固定抗體示意圖。

圖4為基于自身巰基(-SH)定向固定半抗體片段示意圖。

圖5胃蛋白酶水解抗體形成抗體F(ab’)₂片段示意圖。

圖6為通過(guò)自身巰基(-SH)定向固定抗體Fab’片段示意圖。

圖7為先用巰基乙胺將抗體拆分成半抗體，再用胃蛋白酶水解半抗體形成抗體Fab’片段，最后通過(guò)自身巰基(-SH)定向固定抗體Fab’片段示意圖。

圖8為抗人參皂苷GS-Re巰基化抗體修飾微梁，檢測(cè)不同濃度抗原時(shí)微梁尖端的時(shí)間位移曲線。

圖9為抗人參皂苷GS-Re半抗體片段修飾微梁，檢測(cè)不同濃度抗原時(shí)微梁尖端的時(shí)間位移曲線。

具體實(shí)施方式

定義

抗體：抗體(antibody)指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。典型的抗體分子具有4條多肽鏈的對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，包括2條較長(zhǎng)、相對(duì)分子量較大的相同的重鏈(H鏈)；2條較短、相對(duì)分子量較小的相同的輕鏈(L鏈)。鏈間由二硫鍵和非共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)形成一個(gè)由4條多肽鏈構(gòu)成的單體分子。輕鏈有κ和λ兩種，重鏈有μ、δ、γ、ε和α五種。整個(gè)抗體分子可分為恒定區(qū)和可變區(qū)兩部分。在給定的物種中，不同抗體分子的恒定區(qū)都具有相同的或幾乎相同的氨基酸序列。可變區(qū)位于″Y″的兩臂末端。在可變區(qū)內(nèi)有一小部分氨基酸殘基變化特別強(qiáng)烈，這些氨基酸的殘基組成和排列順序更易發(fā)生變異區(qū)域稱(chēng)高變區(qū)。高變區(qū)位于分子表面，最多由17個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，少則只有2～3個(gè)。高變區(qū)氨基酸序列決定了該抗體結(jié)合抗原的特異性。一個(gè)抗體分子上的兩個(gè)抗原結(jié)合部位是相同的，位于兩臂末端稱(chēng)抗原結(jié)合片段(antigen-binding fragment，F(xiàn)ab)?！錣″的柄部稱(chēng)結(jié)晶片段(crystalline fragment，F(xiàn)c)，糖結(jié)合在Fc上。

從結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明中，提及抗體時(shí)均指全抗體，即包括4條鏈和Fc段的抗體結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)。此外，從功能上來(lái)說(shuō)，本發(fā)明中的“抗體”或“抗體片段”是指對(duì)靶抗原特異的抗體或抗體片段，即與抗原具有特異結(jié)合能力的抗體或抗體片段，如未特別說(shuō)明，本發(fā)明中的抗體一般指單克隆抗體，抗體片段包括半抗體片段、F(ab’)₂片段、Fab’片段和Fab等。

半抗體片段：如圖4中所示，通過(guò)二硫鍵還原劑將全抗體拆分成各自帶有巰基的對(duì)稱(chēng)的片段，每個(gè)半抗體片段包含一條完整的輕鏈和一條完整重鏈以及Fc片段。

F(ab’)₂：如圖5中所示，Ig(immunoglobulin，免疫球蛋白)被胃蛋白酶水解在鉸鏈區(qū)重鏈間二硫鍵近C處切斷，形成一個(gè)雙價(jià)抗原結(jié)合片段簡(jiǎn)稱(chēng)F(ab’)₂片段和一些小片段pFc′。由于F(ab’)₂片段保留了結(jié)合相應(yīng)抗原的生物學(xué)活性，又避免了Fc片段的抗原性可能引起的副作用，因而被廣泛用作生物制品。如白喉抗霉素和破傷風(fēng)抗霉素，經(jīng)胃蛋白酶水解后，因去掉了Fc片段的抗原性而減少了超敏反應(yīng)的發(fā)生。pFc′片段最終被降解，無(wú)生物學(xué)活性。

Fab(fragment of antigen binding)：木瓜蛋白酶使Ig在鉸鏈區(qū)重鏈間二硫鍵近N端處切斷，形成兩個(gè)相同的單價(jià)抗原結(jié)合片段簡(jiǎn)稱(chēng)Fab段(如圖1中所示)，一個(gè)可結(jié)晶的片段簡(jiǎn)稱(chēng)Fc(fragment crystallizable)段。

Fab’：是帶巰基的單價(jià)抗原結(jié)合片段(如圖6中所示，F(xiàn)(ab’)₂被二硫鍵還原劑拆分的各自帶有巰基的片段)。

抗原結(jié)合位點(diǎn)：如圖1中所示，抗體分子與抗原相結(jié)合的部位，由Ig輕、重鏈的CDR1、CDR2和CDR3組成。

抗原：是一類(lèi)能誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物(抗體或效應(yīng)細(xì)胞)發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)?？乖哂忻庖咴院头磻?yīng)原性?xún)煞N性質(zhì)。根據(jù)抗原性質(zhì)分為兩類(lèi)：完全抗原和不完全抗原。完全抗原(complete antigen)是一類(lèi)既有免疫原性，又有免疫反應(yīng)性的物質(zhì)。如大多數(shù)蛋白質(zhì)、細(xì)菌、病毒、細(xì)菌外毒素等都是完全抗原。不完全抗原，即半抗原(hapten)是只具有免疫反應(yīng)性，而無(wú)免疫原性的物質(zhì)，故又稱(chēng)不完全抗原。

二硫鍵還原劑：二硫鍵又稱(chēng)S-S鍵，是2個(gè)SH基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子間的鍵。在巰基乙胺(2-MEA)、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等的硫化合物存在下能與之發(fā)生作用，還原成巰基(-SH)。這些硫化物就是本發(fā)明中所說(shuō)的二硫鍵還原劑。在微量的二硫鍵還原劑存在的情況下抗體的重鏈間的二硫鍵被還原而其它的二硫鍵不被破壞。

微懸臂梁(微梁)：典型的微懸臂梁由氮化硅制成，如商品化的三角形微懸臂梁(Veeco Instruments)(尺寸：長(zhǎng)200um，腿寬20um，厚0.6um)，單側(cè)鍍有60nm的金；抗體通常通過(guò)巰基化試劑的巰基(-SH)與金的共價(jià)結(jié)合以及巰基化試劑的另外一端(含有-COOH或-NH₂等活性基團(tuán))與抗體結(jié)合來(lái)固定到微梁表面。

基于表面應(yīng)力檢測(cè)的微懸臂梁免疫傳感系統(tǒng)：微懸臂梁免疫傳感系統(tǒng)主要由激光器、分光鏡、微懸臂梁、光電位置敏感器(PSD)、溫度控制系統(tǒng)、蠕動(dòng)泵、以及數(shù)據(jù)分析處理裝置組成。典型的微懸臂梁免疫檢測(cè)方法的步驟如下：將微懸臂梁固定到反應(yīng)池中，以蠕動(dòng)泵控制流動(dòng)緩沖液通過(guò)反應(yīng)池，待反應(yīng)池中氣泡排凈后以0.1mL/min的速度流動(dòng)緩沖液通過(guò)反應(yīng)池。反應(yīng)池的溫度控制在37±0.01℃，室溫控制在27±0.01℃。激光器發(fā)出一束激光經(jīng)分光鏡后照射在微懸臂梁的尖端，經(jīng)微懸臂梁反射后再經(jīng)分光鏡反射后照在PSD的靶面上。當(dāng)微懸臂梁的位移信號(hào)穩(wěn)定后，加入緩沖液稀釋的樣品溶液，PSD實(shí)時(shí)記錄微懸臂梁的尖端位移。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案

在本發(fā)明中，抗體類(lèi)型可以包括IgM、IgG、IgA、IgD、IgE。此外，抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何方法制備，包括但不限于免疫法、雜交瘤法、化學(xué)合成法、基因工程法等。所述抗體還可以是基因工程修飾的雜合抗體，諸如人源化抗體，駱駝源化抗體等針對(duì)某種哺乳動(dòng)物改造的抗體，例如人-鼠雜合抗體等。

本發(fā)明中提到的待測(cè)樣品可以是生物樣品，例如來(lái)自于哺乳動(dòng)物尤其是人的樣品，包括組織樣品(如病理組織切片、活檢、毛發(fā)、拭子等)、細(xì)胞樣品(如細(xì)胞涂片、血液涂片等)、體液樣品(如血液、尿液、腦脊液、唾液等)、排泄物(例如嘔吐物、汗液、糞便等)。所述待測(cè)樣品還可以是環(huán)境樣品，諸如土壤樣品、水樣、浮塵等；其他生產(chǎn)領(lǐng)域中獲得的樣品，諸如污水樣品、食品樣品等。

本發(fā)明中所提及的抗原包括但不限于完全抗原和半抗原，其可以是本領(lǐng)域中所知曉的在本發(fā)明中所提到的待測(cè)樣品中可能存在的需要檢測(cè)的任何類(lèi)型的抗原。

本發(fā)明中提到的二硫鍵還原劑可以是巰基乙胺(2-MEA)、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。使用二硫鍵還原劑還原二硫鍵從而拆分抗體的方法和條件是本領(lǐng)域中公知的，例如，可以根據(jù)靶抗原的類(lèi)型、大小和性質(zhì)等，遵照本領(lǐng)域中的已知方法或市售的相關(guān)試劑盒的說(shuō)明書(shū)來(lái)選擇具體的二硫鍵還原劑和濃度、抗體濃度，兩者的用量和質(zhì)量比，溫育條件和溫育時(shí)間等。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，在用二硫鍵還原劑處理抗體或抗體片段之后，可以進(jìn)行透析去除未反應(yīng)的二硫鍵還原劑，以免影響帶巰基的抗體片段與微梁鍍金層的結(jié)合和固定。

在本發(fā)明中，在酶解步驟中使用的蛋白酶可以根據(jù)要被水解的抗體的種類(lèi)或其他因素任意地選擇，只要其水解產(chǎn)物中包括帶有巰基的抗原抗體結(jié)合片段從而可以直接固定在微梁金表面上，所述抗原抗體結(jié)合片段包括不限于單價(jià)或二價(jià)的抗原抗體結(jié)合片段，諸如F(ab’)₂、Fab’等?？蛇x的蛋白酶諸如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶等，也可以使用兩者的組合。

在本發(fā)明中，采用蛋白酶水解抗體Ig的方法和反應(yīng)條件是本領(lǐng)域公知的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)要水解的抗體的種類(lèi)來(lái)確定合適的蛋白酶和相應(yīng)的水解條件。

例如，當(dāng)選擇胃蛋白酶時(shí)，胃蛋白酶可以發(fā)揮其活性的環(huán)境，一般是指pH 2～5和在25～60℃下的環(huán)境。胃蛋白酶的最適pH和最適溫度根據(jù)其來(lái)源而定，一般為pH 2左右和37℃左右(可以根據(jù)市售產(chǎn)品的要求來(lái)確定)。在本發(fā)明中可以使用的胃蛋白酶的來(lái)源不受限制，只要其可以將抗體分子裂解為F(ab’)₂片段或?qū)肟贵w片段裂解為Fab’片段。在本發(fā)明中，抗體或抗體片段與胃蛋白酶的質(zhì)量比不受限制，只要足以將抗體或抗體片段充分地水解為Fab’片段。兩者的質(zhì)量比可以根據(jù)常規(guī)方法來(lái)選擇，也可以同時(shí)參考所選擇胃蛋白酶的活性、所選擇的抗體類(lèi)型等因素，一般可以在10∶1～200∶1的范圍內(nèi)選擇。

另外，還可以選擇木瓜蛋白酶。在合適的條件下木瓜蛋白酶也可以將抗體水解為F(ab’)₂片段，例如，在文獻(xiàn)^[6]中在偏酸性(pH5.5)的環(huán)境中在37℃下18小時(shí)木瓜蛋白酶可以將小鼠IgG₁水解成F(ab’)₂片段。在本發(fā)明中，抗體或抗體片段與木瓜蛋白酶的質(zhì)量比不受限制，只要足以將抗體或抗體片段充分地水解為Fab’片段。兩者的質(zhì)量比可以根據(jù)常規(guī)方法來(lái)選擇，也可以同時(shí)參考所選擇木瓜蛋白酶的活性、所選擇的抗體類(lèi)型等因素，一般可以在10∶1～200∶1的范圍內(nèi)選擇。

當(dāng)使用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物時(shí)，由于兩者的活性環(huán)境均為酸性，因此根據(jù)具體的應(yīng)用適當(dāng)?shù)卣{(diào)整兩者的質(zhì)量比，從而可以根據(jù)需要調(diào)整所需的水解活性和水解時(shí)間。在本發(fā)明中，酶解步驟可以在拆分抗體之前或之后進(jìn)行。當(dāng)在拆分抗體之前用蛋白酶水解時(shí)，即用蛋白酶水解抗體時(shí)，得到一個(gè)帶有兩個(gè)Fab’片段的F(ab’)₂片段和多個(gè)小分子片段。當(dāng)在拆分抗體之后用蛋白酶水解時(shí)，即用蛋白酶水解半抗體片段時(shí)，得到了一個(gè)Fab’片段和多個(gè)小分子片段。兩種處理方式最終均可以得到帶有雙巰基的Fab’片段。

在本發(fā)明中，抗體或抗體片段與微梁的鍍金層的結(jié)合可以使用本領(lǐng)域公知的方法和條件，例如在適于兩者結(jié)合的條件下溫育一段時(shí)間來(lái)結(jié)合(參見(jiàn)下面的實(shí)施例或市售產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū))。在本發(fā)明中使用的微梁可以根據(jù)本領(lǐng)域中的公知方法自行制備，也可以購(gòu)買(mǎi)市售商品，對(duì)此在本發(fā)明中并無(wú)任何限制。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但需要說(shuō)明的是下面的實(shí)施例不限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1固定半抗體片段的微梁

實(shí)驗(yàn)1利用巰基乙胺將抗體拆分成帶巰基的半抗體片段

1.準(zhǔn)確稱(chēng)取人參皂苷GS-Re單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)USBiological公司)7.0mg溶于1.0mL PBS(含0.15M NaCl和5.0mM EDTA，pH 6.5)中得到濃度為7.0g/L的抗體溶液；

2.稱(chēng)取1mg巰基乙胺(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)溶于1.0mL水中得到濃度為1.0g/L的抗體拆分試劑；

3.將1.0mL上述步驟1的抗體溶液和291.2μL上述步驟2的抗體拆分試劑混合，室溫下反應(yīng)1.5小時(shí)。

4.用20mM的PBS緩沖液(含0.15M NaCl和5.0mM EDTA，pH 6.5)對(duì)上述步驟3的反應(yīng)液透析48小時(shí)，期間每3小時(shí)更換一次透析液，得到帶巰基的半抗體片段。用甘油等體積稀釋后-20℃保存。

實(shí)驗(yàn)2半抗體片段與微梁金表面的結(jié)合

將洗凈并用氮?dú)獯蹈傻腻冇薪饘拥奈⒘?購(gòu)自美國(guó)Veeco公司)放入酶標(biāo)板小孔中，加入150μL濃度為5.0mg/mL的實(shí)驗(yàn)1步驟1獲得的抗人參皂苷GS-Re單克隆抗體片段，37℃溫育1小時(shí)，即得到固定有半抗體片段的微梁。

實(shí)驗(yàn)3直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法評(píng)價(jià)半抗體片段與微梁金表面的結(jié)合情況具體步驟如下：

1.清洗：用鑷子小心取出上述固定了半抗體片段的微梁，用洗滌液(每1L洗滌液中含有8.0g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.96g Na₂HPO₄·12H₂O、1.0mL Tween-20，其余為水)沖洗數(shù)次，氮?dú)獯蹈桑?/p>

2.封閉：將氮?dú)獯蹈珊蟮奈⒘悍謩e放入酶標(biāo)板中，加入100μL質(zhì)量百分含量為5％的BSA溶液(用PBS溶解)封閉，37℃溫育30分鐘；

3.清洗：用鑷子小心取出微梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，氮?dú)獯蹈桑?/p>

4.競(jìng)爭(zhēng)：將氮?dú)獯蹈珊蟮奈⒘悍謩e放入酶標(biāo)板的兩個(gè)小孔中(做好標(biāo)記，抑制孔與非抑制孔)，抑制孔加入50μL經(jīng)樣品稀釋液(含有終濃度為0.1mol/L pH7.5的PBS、0.1％體積百分含量的吐溫-20和0.1％質(zhì)量百分含量的明膠)稀釋的濃度為100mg/L的人參皂苷GS-Re溶液(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，非抑制孔加入50μL樣品稀釋液作為對(duì)照；然后再分別加入濃度為1.0mg/L的人參皂苷GS-Re過(guò)氧化物酶聯(lián)結(jié)物(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，37℃溫育30分鐘；

5.清洗：用鑷子小心取出上述抑制孔與非抑制孔中的微梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，氮?dú)獯蹈伞?/p>

6.顯色：將氮?dú)獯蹈珊蟮膬筛⒘悍謩e放入酶標(biāo)板的兩個(gè)小孔中，每孔加入100μL顯色溶液(TMB底物使用液與底物緩沖液按1∶9的體積比混勻，每10mL上述混合液中加入4.0mg過(guò)氧化脲)，室溫顯色；

7.終止：15分鐘后，每孔加入50μL終止液(2.0M的硫酸溶液)終止反應(yīng)，取出微梁，450nm波長(zhǎng)處分別讀取OD值。

實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，抑制孔和非抑制孔的450nm波長(zhǎng)下的吸光度值分別為0.121和0.727，說(shuō)明抗人參皂苷GS-Re半抗體片段能有效結(jié)合微梁的金表面上并具有活性。

實(shí)驗(yàn)4微梁傳感器效果監(jiān)測(cè)

1.清洗：無(wú)水乙醇、丙酮和PBS分別流經(jīng)微梁傳感系統(tǒng)，流速0.5mL/min；

2.固定微梁：將步驟2中固定有抗人參皂苷GS-Re抗體片段的微梁固定到微梁傳感系統(tǒng)的反應(yīng)池中，流動(dòng)PBS通過(guò)反應(yīng)池子。排除反應(yīng)池中的氣泡后以0.1mL/min流動(dòng)PBS。

3.調(diào)節(jié)光路：調(diào)節(jié)激光器與PSD(光電位置敏感器)的位置使激光器發(fā)出的激光照在微梁的尖端反射后被PSD接收。

4.樣品測(cè)定：當(dāng)PSD接收的微梁偏轉(zhuǎn)信號(hào)穩(wěn)定后，加入2mL PBS稀釋的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品。通過(guò)PSD實(shí)時(shí)記錄微梁尖端位移信息。

圖9為抗人參皂苷GS-Re半抗體片段修飾微梁，檢測(cè)不同濃度抗原時(shí)微梁尖端的時(shí)間位移曲線。檢測(cè)了三個(gè)濃度1.0ng/mL、0.1ng/mL、0.02ng/mL的樣品得到的微梁尖端位移幅值分別為77、58和32nm。不同濃度的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品可以產(chǎn)生不同程度的微梁位移，說(shuō)明抗人參皂苷GS-Re半抗體片段能有效結(jié)合到微梁的金表面上并能對(duì)人參皂苷GS-Re進(jìn)行定量檢測(cè)。并且具有很高的檢測(cè)靈敏度(圖8為利用鹽酸硫醇亞胺做為巰基化試劑來(lái)巰基化抗體后將抗體固定到微梁上(中國(guó)專(zhuān)利CN101407548)對(duì)人參皂苷進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果)。

結(jié)論：

用本發(fā)明的半抗體片段修飾的微梁和完整抗體修飾的微梁進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試對(duì)比，檢測(cè)不同濃度的人參皂苷GS-Re抗原時(shí)，微梁尖端的時(shí)間位移響應(yīng)曲線(圖9和圖8)顯示，在微梁位移響應(yīng)為20納米左右時(shí)，半抗體片段修飾和巰基化抗體修飾的檢測(cè)人參皂苷GS-Re抗原濃度分別為0.02ng/mL和0.5ng/mL，靈敏度提高了約20倍。

實(shí)施例2抗體Fab’片段修飾的微梁

實(shí)驗(yàn)1抗體F(ab’)₂片段的制備

1.用0.1mol/L檸檬酸緩沖液(pH3.5)溶解人參皂苷GS-Re單克隆抗體(IgG)(購(gòu)自美國(guó)USBiological公司)至10mg/ml；

2.用0.1mol/L檸檬酸緩沖液(pH3.5)溶解胃蛋白酶(pepsin)(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)至1mg/ml；

3.將IgG：胃蛋白酶按質(zhì)量比100∶1混合，放在37℃水浴箱中2小時(shí)，然后加入3mol/L Tris使pH在7左右以終止反應(yīng)。

4.用20mM的PBS緩沖液(含0.15M NaCl和5.0mM EDTA，pH 6.5)對(duì)上述步驟3的反應(yīng)混合液透析48小時(shí)，期間每3小時(shí)更換一次透析液，得到抗體F(ab’)₂片段。

實(shí)驗(yàn)2抗體片段Fab’的制備

1.用去離子水溶解巰基乙胺(2-MEA)(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)至1mg/ml；

2.將步驟1中制備的F(ab’)₂：2-MEA按質(zhì)量比20∶1進(jìn)行混合，放在37℃水浴箱中2小時(shí)；

3.用20mM的PBS緩沖液(含0.15M NaCl和5.0mM EDTA，pH 6.5)對(duì)上述步驟2的反應(yīng)混合液透析48小時(shí)，期間每3小時(shí)更換一次透析液，得到抗體Fab’片段。用甘油等體積稀釋后保存在-20℃環(huán)境下。

實(shí)驗(yàn)3將Fab’抗體片段修飾到微梁金表面上

將洗凈并用氮?dú)獯蹈傻腻冇薪鹉さ奈⒘?購(gòu)自美國(guó)Veeco公司)放入酶標(biāo)板小孔中，加入150μL濃度為5.0mg/mL的上述步驟2制得的Fab’抗體片段溶液，放在37℃水浴箱中2小時(shí)，即得到固定有抗體Fab’片段的微梁。

實(shí)驗(yàn)4 ELISA直接競(jìng)爭(zhēng)法效果檢測(cè)

1.清洗：用鑷子小心取出上述固定了抗體Fab’片段的微懸臂梁，用洗滌液(每1L洗滌液中含有8.0g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.96g Na₂HPO₄·12H₂O、1.0mL Tween-20，其余為水)沖洗數(shù)次，氮?dú)獯蹈桑?/p>

2.封閉：將氮?dú)獯蹈珊蟮奈冶哿悍謩e放入酶標(biāo)板中，加入100μL質(zhì)量百分含量為5％的BSA溶液(用PBS溶解)封閉，37℃溫育30分鐘；

3.清洗：用鑷子小心取出微懸臂梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，氮?dú)獯蹈桑?/p>

4.競(jìng)爭(zhēng)：將氮?dú)獯蹈珊蟮奈冶哿悍謩e放入酶標(biāo)板的兩個(gè)小孔中(做好標(biāo)記，抑制孔與非抑制孔)，抑制孔加入50μL經(jīng)樣品稀釋液(含有終濃度為0.1mol/L pH7.5的PBS、0.1％體積百分含量的吐溫-20和0.1％質(zhì)量百分含量的明膠)稀釋的濃度為100mg/L的人參皂苷GS-Re溶液(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，非抑制孔加入50μL樣品稀釋液作為對(duì)照；然后再分別加入濃度為1.0mg/L的人參皂苷GS-Re過(guò)氧化物酶聯(lián)結(jié)物(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，37℃溫育30分鐘；

5.清洗：用鑷子小心取出上述抑制孔與非抑制孔中的微懸臂梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，氮?dú)獯蹈桑?/p>

6.顯色：將氮?dú)獯蹈珊蟮膬筛冶哿悍謩e放入酶標(biāo)板的兩個(gè)小孔中，每孔加入100μL顯色溶液(TMB底物使用液與底物緩沖液按1∶9的體積比混勻，每10mL上述混合液中加入4.0mg過(guò)氧化脲)，室溫顯色；

7.終止：15分鐘后，每孔加入50μL終止液(2.0M的硫酸溶液)終止反應(yīng)，取出微懸臂梁，450nm波長(zhǎng)處分別讀取OD值。

實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，抑制孔和非抑制孔的450nm波長(zhǎng)下的吸光度值分別為0.178和0.853，說(shuō)明抗人參皂苷GS-Re抗體Fab’片段能有效結(jié)合微懸臂梁的金表面上。

實(shí)驗(yàn)5微梁傳感器效果檢測(cè)

1.清洗：無(wú)水乙醇、丙酮和PBS分別流經(jīng)微梁傳感系統(tǒng)，流速0.5mL/min；

2.固定微梁：將實(shí)驗(yàn)3中修飾有抗人參皂苷GS-Re抗體片段Fab’的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感系統(tǒng)的反應(yīng)池中，流動(dòng)PBS通過(guò)反應(yīng)池子。排除反應(yīng)池中的氣泡后以0.1mL/min流動(dòng)PBS。

3.調(diào)節(jié)光路：調(diào)節(jié)激光器與PSD(光電位置敏感器)的位置使的激光器發(fā)出的激光照在微梁的尖端并被PSD接收。

4.樣品測(cè)定：當(dāng)PSD接收的微梁偏轉(zhuǎn)信號(hào)穩(wěn)定后，加入2mL PBS稀釋的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品。通過(guò)PSD實(shí)時(shí)記錄微梁尖端位移信息。

檢測(cè)了三個(gè)濃度1.0ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL的樣品得到的微梁尖端位移幅值分別為79、61和21nm；不同濃度的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品可以產(chǎn)生不同程度的微懸臂梁位移，說(shuō)明抗人參皂苷GS-Re抗體Fab’片段能有效結(jié)合到微懸臂梁的金表面上并能對(duì)人參皂苷GS-Re進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)論：

用本發(fā)明的抗體Fab’片段修飾的微梁和完整抗體修飾的微梁進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試對(duì)比，檢測(cè)不同濃度的人參皂苷GS-Re抗原時(shí)，在微梁位移響應(yīng)為20納米左右時(shí)，抗體Fab’片段修飾和巰基化抗體修飾檢測(cè)人參皂苷GS-Re抗原濃度分別為0.01ng/mL和0.5ng/mL，靈敏度提高了近40倍。

實(shí)施例3抗體Fab’片段修飾的微梁

實(shí)驗(yàn)1利用巰基乙胺將抗體拆分成帶巰基的半抗體片段

1.準(zhǔn)確稱(chēng)取人參皂苷GS-Re單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)USBiological公司)7.0mg溶于1.0mL PBS(含0.15M NaCl和5.0mM EDTA，pH 6.5)中得到濃度為7.0g/L的抗體溶液；

2.稱(chēng)取1mg巰基乙胺(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)溶于1.0mL水中得到濃度為1.0g/L的抗體拆分試劑；

3.將1.0mL上述步驟1的抗體溶液和291.2μL上述步驟2的抗體拆分試劑混合，室溫下反應(yīng)1.5小時(shí)。

4.用20mM的PBS緩沖液(含0.15M NaCl和5.0mM EDTA，pH 6.5)對(duì)上述步驟3的反應(yīng)液透析48小時(shí)，期間每3小時(shí)更換一次透析液，得到帶巰基的半抗體片段。用甘油等體積稀釋后-20℃保存。

實(shí)驗(yàn)2抗體Fab’片段的制備

1.用0.1mol/L檸檬酸緩沖液(pH3.5)溶解胃蛋白酶(pepsin)(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)至1mg/ml；

2.將步驟1中制備的半抗體片段與胃蛋白酶按質(zhì)量比100∶1混合反應(yīng)，放在37℃水浴箱中2小時(shí)，然后加入3mol/L Tris使pH在7左右以終止反應(yīng)。

3.用20mM的PBS緩沖液(含0.15M NaCl和5.0mM EDTA，pH 6.5)對(duì)上述步驟2的反應(yīng)混合液透析48小時(shí)，期間每3小時(shí)更換一次透析液，得到抗體Fab’片段。用甘油等體積稀釋后保存在-20℃環(huán)境下。

實(shí)驗(yàn)3將抗體Fab’片段修飾到微梁金表面上

將洗凈并用氮?dú)獯蹈傻腻冇薪鹉さ奈⒘?購(gòu)自美國(guó)Veeco公司)放入酶標(biāo)板小孔中，加入150μL濃度為5.0mg/mL的上述步驟2制得的抗體Fab’片段溶液，放在37℃水浴箱中2小時(shí)，即得到固定有抗體Fab’片段的微梁。

實(shí)驗(yàn)4 ELISA直接競(jìng)爭(zhēng)法效果檢測(cè)

1.清洗：用鑷子小心取出上述固定了抗體Fab’片段的微懸臂梁，用洗滌液(每1L洗滌液中含有8.0g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.96g Na₂HPO₄·12H₂O、1.0mL Tween-20，其余為水)沖洗數(shù)次，氮?dú)獯蹈桑?/p>

2.封閉：將氮?dú)獯蹈珊蟮奈冶哿悍謩e放入酶標(biāo)板中，加入100μL質(zhì)量百分含量為5％的BSA溶液(用PBS溶解)封閉，37℃溫育30分鐘；

3.清洗：用鑷子小心取出微懸臂梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，氮?dú)獯蹈桑?/p>

4.競(jìng)爭(zhēng)：將氮?dú)獯蹈珊蟮奈冶哿悍謩e放入酶標(biāo)板的兩個(gè)小孔中(做好標(biāo)記，抑制孔與非抑制孔)，抑制孔加入50μL經(jīng)樣品稀釋液(含有終濃度為0.1mol/L pH 7.5的PBS、0.1％體積百分含量的吐溫-20和0.1％質(zhì)量百分含量的明膠)稀釋的濃度為100mg/L的人參皂苷GS-Re溶液(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，非抑制孔加入50μL樣品稀釋液作為對(duì)照；然后再分別加入濃度為1.0mg/L的人參皂苷GS-Re過(guò)氧化物酶聯(lián)結(jié)物(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，37℃溫育30分鐘；

5.清洗：用鑷子小心取出上述抑制孔與非抑制孔中的微懸臂梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，氮?dú)獯蹈桑?/p>

6.顯色：將氮?dú)獯蹈珊蟮膬筛冶哿悍謩e放入酶標(biāo)板的兩個(gè)小孔中，每孔加入100μL顯色溶液(TMB底物使用液與底物緩沖液按1∶9的體積比混勻，每10mL上述混合液中加入4.0mg過(guò)氧化脲)，室溫顯色；

7.終止：15分鐘后，每孔加入50μL終止液(2.0M的硫酸溶液)終止反應(yīng)，取出微懸臂梁，450nm波長(zhǎng)處分別讀取OD值。

實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，抑制孔和非抑制孔的450nm波長(zhǎng)下的吸光度值分別為0.152和0.763，說(shuō)明抗人參皂苷GS-Re抗體Fab’片段能有效結(jié)合微懸臂梁的金表面上。

實(shí)驗(yàn)5微梁傳感器效果檢測(cè)

1.清洗：無(wú)水乙醇、丙酮和PBS分別流經(jīng)微梁傳感系統(tǒng)，流速0.5mL/min；

2.固定微梁：將實(shí)驗(yàn)3中修飾有抗人參皂苷GS-Re抗體Fab’片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感系統(tǒng)的反應(yīng)池中，流動(dòng)PBS通過(guò)反應(yīng)池子。排除反應(yīng)池中的氣泡后以0.1mL/min流動(dòng)PBS。

3.調(diào)節(jié)光路：調(diào)節(jié)激光器與PSD(光電位置敏感器)的位置使的激光器發(fā)出的激光照在微梁的尖端并被PSD接收。

4.樣品測(cè)定：當(dāng)PSD接收的微梁偏轉(zhuǎn)信號(hào)穩(wěn)定后，加入2mL PBS稀釋的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品。通過(guò)PSD實(shí)時(shí)記錄微梁尖端位移信息。

檢測(cè)三個(gè)濃度1.0ng/mL、0.1ng/mL、0.015ng/mL的樣品得到的微梁尖端位移幅值分別為68、42和22nm；不同濃度的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品可以產(chǎn)生不同程度的微懸臂梁位移，說(shuō)明抗人參皂苷GS-Re抗體Fab’片段能有效結(jié)合到微懸臂梁的金表面上并能對(duì)人參皂苷GS-Re進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)論：

通過(guò)先拆分后酶解的方法制備的本發(fā)明的抗體Fab’片段修飾的微梁和完整抗體修飾的微梁進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試對(duì)比，檢測(cè)不同濃度的人參皂苷GS-Re抗原時(shí)，在微梁位移響應(yīng)為20納米左右時(shí)，抗體Fab’片段修飾和巰基化抗體修飾檢測(cè)人參皂苷GS-Re抗原濃度分別為0.015ng/mL和0.5ng/mL，靈敏度提高了近33倍。

通過(guò)上述非限制性的實(shí)施例，可以看出，本發(fā)明的方法和通過(guò)本發(fā)明的方法制備的微懸臂梁在免疫傳感檢測(cè)技術(shù)中與現(xiàn)有技術(shù)的微梁法相比可以提高20-40倍，相當(dāng)于常規(guī)酶聯(lián)免疫法的200-400倍，實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的，即在食品安全、環(huán)境污染、生物醫(yī)學(xué)、科學(xué)研究和生產(chǎn)制造等領(lǐng)域中監(jiān)控和檢測(cè)極微量被分析物的可能性和實(shí)用性，完全可以實(shí)現(xiàn)實(shí)際的商業(yè)化應(yīng)用。

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