本發(fā)明涉及一種甘露聚糖含量的測定方法，具體涉及一種酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖含量的測定方法。

背景技術(shù)：

酵母培養(yǎng)物是一種微生態(tài)制劑，是指在特定工藝條件控制下，在特定培養(yǎng)基上經(jīng)充分厭氧發(fā)酵后所形成的微生態(tài)制品。其主要作用成分是酵母利用固體基質(zhì)發(fā)酵所產(chǎn)生的細(xì)胞外代謝產(chǎn)物、發(fā)酵后變性的固體基質(zhì)、酵母細(xì)胞內(nèi)容物以及酵母細(xì)胞壁等。該產(chǎn)品成分復(fù)雜，主要包括小肽、有機(jī)酸、維生素、增味物質(zhì)、甘露寡糖、β-葡聚糖和氨基酸以及“未知促生長因子”等，這些物質(zhì)是動(dòng)物胃腸道內(nèi)微生物的絕好營養(yǎng)底物，可以有效刺激有益菌的生長，激發(fā)它們的代謝活性，穩(wěn)定體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。酵母培養(yǎng)物能夠發(fā)揮功效，其中酵母細(xì)胞壁是一個(gè)不可忽視的部分，酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)(圖1)堅(jiān)韌，主要構(gòu)成為葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)、脂類等，像三明治，外層為甘露聚糖，內(nèi)層為葡聚糖，中間夾有一層蛋白質(zhì)分子，細(xì)胞壁的少量組分幾丁質(zhì)并不是所有的酵母菌中都有，其含量也因種而已。而甘露聚糖是酵母細(xì)胞壁重要的多糖成分之一，占細(xì)胞壁干重的40％左右，賦予細(xì)胞生物學(xué)活性和控制細(xì)胞壁孔徑。甘露聚糖以共價(jià)鍵形式與蛋白質(zhì)連在一起，由5％～20％蛋白質(zhì)，80％～90％甘露糖組成，因此又稱之為甘露聚糖蛋白，其相對分子量為20000～200000，主鏈為單鏈，糖苷鍵形式為α-1,6連接，主鏈上連有豐富的支鏈，是由甘露糖、甘露二糖、甘露三糖和甘露四糖組成，糖苷鍵形式為α-1,2或α-1,3連接。甘露聚糖是免疫功能最強(qiáng)的酵母細(xì)胞壁多糖，它能增加動(dòng)物體液免疫和細(xì)胞免疫能力，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，結(jié)合吸附外源性病原菌，并具有抗輻射、抗氧化、抗腫瘤等活性功能，是酵母培養(yǎng)物中的重要的功效成分之一。因此，酵母甘露聚糖的含量被認(rèn)為是評(píng)價(jià)酵母培養(yǎng)物品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

目前，對甘露糖含量的測定一般采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，但采用上述方法用于測定酵母培養(yǎng)物中的甘露聚糖含量時(shí)，得到的結(jié)果是總的還原糖，不能排除其他糖類的干擾，專一性差，測定結(jié)果不能準(zhǔn)確反映樣品中甘露聚糖的實(shí)際含量。另外，單糖類物質(zhì)也可使用糖分析柱結(jié)合利用示差檢測器檢測，但糖柱不耐用，對應(yīng)的示差檢測器靈敏度較低，不適合檢測酵母培養(yǎng)物中的甘露聚糖。而同時(shí)由于在測定酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖含量時(shí)，甘露聚糖所在酵母細(xì)胞壁較厚，不能直接利用上述方法。

鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種適用于酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖含量的綜合分析檢測方法，為酵母培養(yǎng)物的開發(fā)和應(yīng)用提供技術(shù)保障。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖含量的測定方法，包括以下步驟：

(1)將酵母培養(yǎng)物進(jìn)行預(yù)處理使其中的酵母細(xì)胞壁破壁；

(2)將步驟(1)中所述預(yù)處理后的樣品在酸性條件下進(jìn)行水解反應(yīng)，使酵母細(xì)胞壁多糖水解為單糖，其中的甘露聚糖水解成甘露糖；

(3)將步驟(2)中所述水解反應(yīng)后溶液的酸堿度調(diào)成中性后，與相應(yīng)的衍生化試劑在一定條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)，使其中的單糖衍生化；然后以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)品，將其標(biāo)準(zhǔn)品溶液在相同條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)；

(4)將步驟(3)中所述衍生化后的樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)反相高效液相色譜進(jìn)行分析檢測；

(5)根據(jù)步驟(4)中所得到的色譜數(shù)據(jù)計(jì)算出樣品中甘露糖的質(zhì)量，再換算成甘露聚糖的含量。

進(jìn)一步，步驟(1)中，所述酵母細(xì)胞壁破壁是采用均質(zhì)處理、超聲處理或酶解處理。

進(jìn)一步，均質(zhì)處理是將酵母培養(yǎng)物和超純水以1:3～1:7的比例混勻后，用均質(zhì)機(jī)經(jīng)轉(zhuǎn)速3000～12000r/min條件下均質(zhì)處理5～12min；所述超聲處理是將酵母培養(yǎng)物和超純水以1:10～1:20的比例混勻后，在超聲功率100～150w條件下超聲30～50min；所述酶解處理是是將酵母培養(yǎng)物和超純水以1:4～1:10的比例混勻后，β-葡聚糖酶和蝸牛酶按比例3:1添加，添加量在5～13mg/ml，酶解ph4.0～6.0，酶解溫度40～60℃，酶解時(shí)間2～8h。

進(jìn)一步，步驟(2)中，在硫酸或鹽酸條件進(jìn)行水解反應(yīng)。

進(jìn)一步，所述硫酸水解是按照樣品和72％硫酸的使用比例為每20mg酵母培養(yǎng)物用70～100ul的72％硫酸，在耐壓玻璃密封管樣品和硫酸混合后靜置1～3h，之后加入5～8倍體積的超純水，密封耐壓玻璃密封管后在100℃下水解3～8h，水解完成用冰水冷卻之后用6m氫氧化鈉溶液調(diào)為中性；所述鹽酸水解是按照樣品和2mol/l鹽酸的使用比例為每20mg酵母培養(yǎng)物用的2～5ml的2mol/l鹽酸，將樣品和鹽酸混合均勻后在密封管中100℃下水解1～10h，水解完成后用冰水冷卻之后用2m氫氧化鈉溶液調(diào)為中性。

進(jìn)一步，步驟(3)中，所述衍生化試劑為1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮。

進(jìn)一步，將等體積的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液、0.5mol/l現(xiàn)配現(xiàn)用的pmp甲醇溶液、0.3mol/lnaoh溶液，置于具塞離心管中，充分混勻后于60～90℃水浴衍生化反應(yīng)30～90min，放冷后加入過量的0.3mol/l鹽酸溶液，混勻，用三氯甲烷萃取出過量的pmp，最后將水層液離心后，取上清液待測。

進(jìn)一步，步驟(4)中，所述反相高效液相色譜的色譜條件是以0.1mol/lph5.5乙酸銨緩沖液與乙腈按照體積比80/20～60/40組成流動(dòng)相洗脫，流速為0.5～1.5ml/min，反相色譜柱選用c18柱分離，紫外檢測器在紫外波長250nm下檢測。每份樣品平行檢測3次。

進(jìn)一步，步驟(5)中，所述樣品中甘露聚糖的含量按式ⅰ計(jì)算：

式ⅰ中：

x：甘露聚糖含量％；

a1：衍生化反應(yīng)后的標(biāo)樣溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

a2：衍生化反應(yīng)后的樣品溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

m1：甘露糖標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

m2：樣品溶液中酵母培養(yǎng)物的質(zhì)量，g；

p：甘露糖標(biāo)樣中甘露糖的質(zhì)量百分含量；

0.9：甘露糖和甘露聚糖的換算系數(shù)；

計(jì)算結(jié)果精確至0.1％。

本發(fā)明通過預(yù)處理使酵母細(xì)胞充分破壁，無需外在成分的影響，干擾小，使得甘露聚糖能在酸性條件下充分水解，然后單糖衍生化后利用反相色譜柱進(jìn)行分離，并選用紫外檢測器能更加靈敏的檢測出單糖衍生物。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于以外標(biāo)法計(jì)算能夠準(zhǔn)確地測定酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖的含量，干擾小，專一性高且測定方法簡便，適用于酵母培養(yǎng)物及類似樣品中甘露聚糖的含量測定。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明測定方法中甘露糖濃度在1.0～100mg/l范圍內(nèi)與對應(yīng)峰面積呈線性關(guān)系(r²＝0.99)，甘露聚糖添加回收率可達(dá)96.3％～102.6％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2.5％，甘露聚糖最低檢出限可達(dá)0.11mg/l。

附圖說明

通過閱讀下文優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述，各種其他的優(yōu)點(diǎn)和益處對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得清楚明了。附圖僅用于示出優(yōu)選實(shí)施方式的目的，而并不認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。而且在整個(gè)附圖中，用相同的參考符號(hào)表示相同的部件。在附圖中：

圖1為酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)圖。

圖2為酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖測定流程。

圖3為甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的hplc色譜圖。

圖4為樣品甘露糖pmp衍生物的hplc色譜圖。

圖5為甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下面將參照附圖更詳細(xì)地描述本公開的示例性實(shí)施方式。雖然附圖中顯示了本公開的示例性實(shí)施方式，然而應(yīng)當(dāng)理解，可以以各種形式實(shí)現(xiàn)本公開而不應(yīng)被這里闡述的實(shí)施方式所限制。相反，提供這些實(shí)施方式是為了能夠更透徹地理解本公開，并且能夠?qū)⒈竟_的范圍完整的傳達(dá)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。

1、儀器

島津lc-20a高效液相色譜儀；高速均質(zhì)機(jī)(昂尼ad200l-p)；pb-10型ph計(jì)(賽多利斯)；臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；超聲波破碎儀(新芝jy92-iin)。

2、實(shí)驗(yàn)試劑

甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、氯仿(分析純)、鹽酸(分析純)、乙酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、乙酸銨(分析純)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(分析純)、超純水、甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品(含量98％，上海源葉生物)、甘露聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(含量98％，上海源葉生物)、β-葡聚糖酶和蝸牛酶(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)。

3、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品0.05g(精確到0.0001g)于100ml容量瓶中，加水溶解后定容到100ml容量瓶中，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。用前取10ml儲(chǔ)備溶液定容到100ml容量瓶中作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

實(shí)施例1

1、酵母培養(yǎng)物樣品均質(zhì)預(yù)處理、硫酸水解

準(zhǔn)確稱取酵母培養(yǎng)物樣品4.5g于燒杯中，加水至30g(準(zhǔn)確至0.0001g)，然后采用高速均質(zhì)機(jī)10000r/min條件下處理10min；接著準(zhǔn)確稱取所得均質(zhì)液中的0.5g作為試樣，放入25ml耐壓反應(yīng)管中，加入72％硫酸2.5ml，搖勻靜置1～3h，加超純水15ml后，密封耐壓反應(yīng)管在100℃下攪拌水解4h，水解完成后將反應(yīng)管用冰水冷卻，然后將水解液移入容量瓶中，定容到100ml；接著取其中10ml試樣溶液用6m的naoh溶液調(diào)為中性，再定容到100ml，作為待測樣品溶液。

2、衍生化

取甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品溶液、0.5mol/lpmp甲醇溶液(須現(xiàn)配現(xiàn)用)、0.3mol/lnaoh溶液各400μl，置于10ml具塞離心管中，充分混勻后于70℃水浴衍生化反應(yīng)30min，放冷后加入0.3mol/l鹽酸溶液500μl，混勻，用三氯甲烷萃取出過量的pmp，每次用2.5ml三氯甲烷洗滌4次，最后將水層液離心后，取上清液待測。

3、樣品的測定

(1)色譜條件

色譜柱c18bondapak300mm×4.9mm；流動(dòng)相：0.1mol/l乙酸銨緩沖液ph5.5-乙腈(v/v,70:30)；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：250nm；進(jìn)樣量：20μl。

(2)樣品測定

在同樣的色譜條件下，將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分別注入色譜儀中，記錄各色譜峰的峰面積，每份樣品重復(fù)三次結(jié)果取平均值。

試樣中甘露聚糖的含量按式(ⅰ)計(jì)算：

式ⅰ中：

x：甘露聚糖含量％；

a1：衍生化反應(yīng)后的標(biāo)樣溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

a2：衍生化反應(yīng)后的樣品溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

m1：甘露糖標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

m2：樣品溶液中酵母培養(yǎng)物的質(zhì)量，g；

p：甘露糖標(biāo)樣中甘露糖的質(zhì)量百分含量；

以上酵母培養(yǎng)物中甘露聚糖測定流程見圖2。

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

(1)色譜分離

以實(shí)施例1方法及色譜條件下所得甘露糖和酵母培養(yǎng)物hplc色譜圖，如圖3、4所示，圖3中峰1表示甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)的色譜峰，圖4中峰1表示樣品甘露糖對應(yīng)的色譜峰。由圖4可知，甘露糖pmp衍生物的分離度大于1.5(當(dāng)分離度r＝1.5時(shí)，兩組分分離程度可以達(dá)到99.7％，通常r＝1.5作為相鄰兩組分完全分離的指標(biāo))，分離效果良好，基線呈水平狀，峰形對稱。

(2)線性相關(guān)度和標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照實(shí)施例1方法及色譜條件下，測定一系列濃度梯度的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。以甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mg/l)為橫坐標(biāo)x，以對應(yīng)的色譜峰面積(v·s)為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖5。

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可知(圖5)，甘露糖濃度在1.0～100mg/l范圍內(nèi)與對應(yīng)峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程y＝0.014x+0.006及相關(guān)系數(shù)(r²＝0.99)。

(3)方法精密度、添加回收率和最低檢測限

取酵母培養(yǎng)物樣品，按上述處理方法和色譜條件進(jìn)行5次平行測定，測得結(jié)果,并通過統(tǒng)計(jì)求出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，通過實(shí)施例1方法測定的所選取的酵母培養(yǎng)物樣品的甘露聚糖的含量為0.80％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2.5％。

取已知準(zhǔn)確含量的酵母培養(yǎng)物樣品，加入一定量的甘露聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，然后按照實(shí)施例1處理方法和色譜條件進(jìn)行測定，重復(fù)處理5次，測得結(jié)果以(測定值－本底值)/添加值＝回收率，計(jì)算得到其添加回收率為96.3～102.6％。按照3倍信噪比通過換算得到甘露聚糖最低檢測限(s/n＝3)為0.11mg/l。

實(shí)施例2

1、酵母培養(yǎng)物樣品超聲預(yù)處理、硫酸水解

準(zhǔn)確稱取酵母培養(yǎng)物樣品4.5g于燒杯中，加水至30g(準(zhǔn)確至0.0001g)，然后在超聲功率100w條件下超聲35min；接著準(zhǔn)確稱取所得超聲液中的0.5g作為試樣，放入25ml耐壓反應(yīng)管中，加入72％硫酸2.5ml，搖勻靜置1～3h，加超純水18ml后，密封耐壓反應(yīng)管在100℃下攪拌水解5h，水解完成后將反應(yīng)管用冰水冷卻，然后將水解液移入容量瓶中，定容到100ml；接著取其中10ml試樣溶液用6m的naoh溶液調(diào)為中性，再定容到100ml，作為待測樣品溶液。

2、衍生化

取甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品溶液、0.5mol/lpmp甲醇溶液(須現(xiàn)配現(xiàn)用)、0.3mol/lnaoh溶液各400μl，置于10ml具塞離心管中，充分混勻后于75℃水浴衍生化反應(yīng)35min，放冷后加入0.3mol/l鹽酸溶液500μl，混勻，用三氯甲烷萃取出過量的pmp，每次用2.5ml三氯甲烷洗滌4次，最后將水層液離心后，取上清液待測。

3、樣品的測定

(1)色譜條件

色譜柱c18bondapak300mm×4.9mm；流動(dòng)相：0.1mol/l乙酸銨緩沖液ph5.5-乙腈(v/v,80:20)；流速：1.1ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：250nm；進(jìn)樣量：20μl。

(2)樣品測定

在同樣的色譜條件下，將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分別注入色譜儀中，記錄各色譜峰的峰面積，每份樣品重復(fù)兩次結(jié)果取平均值。

試樣中甘露聚糖的含量按式(ⅰ)計(jì)算：

式ⅰ中：

x：甘露聚糖含量％；

a1：衍生化反應(yīng)后的標(biāo)樣溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

a2：衍生化反應(yīng)后的樣品溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

m1：甘露糖標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

m2：樣品溶液中酵母培養(yǎng)物的質(zhì)量，g；

p：甘露糖標(biāo)樣中甘露糖的質(zhì)量百分含量；

計(jì)算得到酵母培養(yǎng)物樣品的甘露聚糖的含量為0.86％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2.0％，添加回收率為96.6～101.9％。按照3倍信噪比通過換算得到甘露聚糖最低檢測限(s/n＝3)為0.12mg/l。

實(shí)施例3

1、酵母培養(yǎng)物樣品酶解預(yù)處理、鹽酸水解

準(zhǔn)確稱取酵母培養(yǎng)物樣品4.5g于燒杯中，加水至30g(準(zhǔn)確至0.0001g)，然后將β-葡聚糖和木瓜蛋白酶復(fù)合酶按比例3:1添加量，酶解ph6.0，酶解溫度60℃，酶解時(shí)間3h；接著準(zhǔn)確稱取所得酶解液中的0.5g作為試樣，放入100ml耐壓反應(yīng)管中，加入2mol/l鹽酸50ml,混合均勻后，密封耐壓反應(yīng)管在100℃下攪拌水解4h，水解完成后將反應(yīng)管用冰水冷卻，然后將水解液移入容量瓶中，定容到100ml；接著取其中10ml試樣溶液用6m的naoh溶液調(diào)為中性，再定容到100ml，作為待測樣品溶液。

2、衍生化

取甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品溶液、0.5mol/lpmp甲醇溶液(須現(xiàn)配現(xiàn)用)、0.3mol/lnaoh溶液各400μl，置于10ml具塞離心管中，充分混勻后于60℃水浴衍生化反應(yīng)40min，放冷后加入0.3mol/l鹽酸溶液500μl，混勻，用三氯甲烷萃取出過量的pmp，每次用2.5ml三氯甲烷洗滌4次，最后將水層液離心后，取上清液待測。

3、樣品的測定

(1)色譜條件

色譜柱c18bondapak300mm×4.9mm；流動(dòng)相：0.1mol/l乙酸銨緩沖液ph5.5-乙腈(v/v,78:22)；流速：0.9ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：250nm；進(jìn)樣量：20μl。

(2)樣品測定

在同樣的色譜條件下，將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分別注入色譜儀中，記錄各色譜峰的峰面積，每份樣品重復(fù)兩次結(jié)果取平均值。

試樣中甘露聚糖的含量按式(ⅰ)計(jì)算：

式ⅰ中：

x：甘露聚糖含量％；

a1：衍生化反應(yīng)后的標(biāo)樣溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

a2：衍生化反應(yīng)后的樣品溶液中，甘露糖峰面積的平均值；

m1：甘露糖標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

m2：樣品溶液中酵母培養(yǎng)物的質(zhì)量，g；

p：甘露糖標(biāo)樣中甘露糖的質(zhì)量百分含量；

計(jì)算得到酵母培養(yǎng)物樣品的甘露聚糖的含量為0.85％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差3.0％，添加回收率為95.6～102.1％。按照3倍信噪比通過換算得到甘露聚糖最低檢測限(s/n＝3)為0.10mg/l。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。