本發(fā)明屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用分子模板增強(qiáng)試劑提升sers基底檢測靈敏度的方法，實(shí)現(xiàn)了待測分子在傳統(tǒng)表面增強(qiáng)拉曼光譜(sers)基底上提升2個(gè)數(shù)量級的超痕量檢測，使sers的檢測靈敏度大幅度提高，具有廣泛的應(yīng)用前景。

背景技術(shù)：

1928年印度物理學(xué)家拉曼(c.v.raman)首次發(fā)現(xiàn)拉曼散射效應(yīng)，榮獲1930年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。拉曼光譜的頻率、強(qiáng)度和偏振等標(biāo)志著物質(zhì)指紋信息，從這些信息中可以得到物質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成成分的信息，因而拉曼光譜得到了廣泛的應(yīng)用。拉曼光譜是研究分子結(jié)構(gòu)的一種重要手段，但是隨著拉曼光譜的實(shí)際應(yīng)用，它的缺點(diǎn)也逐漸體現(xiàn)出來。拉曼散射的強(qiáng)度非常弱，一般只有入射光強(qiáng)度的10^-10左右，所以想要得到強(qiáng)度很弱的拉曼光譜迫切需要一種方法來增強(qiáng)拉曼光譜信號的強(qiáng)度。

fleischmann等人于1974年對光滑銀電極表面進(jìn)行粗糙化處理后，首次獲得吸附在銀電極表面上單分子層吡啶分子的高質(zhì)量的拉曼光譜。但fleishmann認(rèn)為這是由于電極表面的粗糙化，電極真實(shí)表面積增加而使吸附的吡啶分子的量增加引起的，而沒有意識(shí)到粗糙表面對吸附分子的拉曼光譜信號的增強(qiáng)作用。一直到1977年，vanduyne和creighton兩個(gè)研究組各自獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)，吸附在粗糙銀電極表面的每個(gè)吡啶分子的拉曼信號要比溶液中單個(gè)吡啶分子的拉曼信號大約強(qiáng)10⁶倍，指出這是一種與粗糙表面相關(guān)的表面增強(qiáng)效應(yīng)，被稱為表面增強(qiáng)拉曼光譜(sers)效應(yīng)。10⁶倍這一數(shù)量級的sers信號增強(qiáng)意味著表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)表面單分子層的研究，所以新型sers活性基底成為了sers技術(shù)最重要的研究領(lǐng)域，而且對于擴(kuò)大sers的研究范圍和應(yīng)用領(lǐng)域起著重要的作用。利用日益成熟的納米材料的制備技術(shù)，已經(jīng)可以獲得顆粒形狀和大小可以很好控制的納米顆粒，并將其作為模型材料來研究sers的增強(qiáng)機(jī)理。雖然在sers基底制備領(lǐng)域涌現(xiàn)出了大量新材料，但在某些實(shí)際應(yīng)用體系中，sers技術(shù)的檢測靈敏度仍然不盡如人意，實(shí)現(xiàn)超靈敏檢測仍是一個(gè)亟待于解決的技術(shù)問題。

表面選擇定則是表面增強(qiáng)拉曼光譜學(xué)中的一個(gè)重要概念。當(dāng)分子吸附在sers基底表面時(shí)，得到的sers光譜強(qiáng)度與分子與基底之間的鍵合方式有關(guān)，當(dāng)分子垂直于sers基底或在垂直方向上有分量時(shí)，能夠得到比較好的sers增強(qiáng)效果。當(dāng)極低濃度的待測物分子吸附在sers基底上時(shí)，由于各種作用力的綜合影響，待測物分子將隨機(jī)的以近似平行于基底的接觸角與sers基底相結(jié)合，這種隨機(jī)的且近似平行的接觸方式不利于得到增強(qiáng)拉曼信號。盡管表面選擇定則在理論上得到解釋和證實(shí)，但是現(xiàn)實(shí)中能夠根據(jù)表面選擇定則進(jìn)行調(diào)整待測分子取向的方法還未見報(bào)道。本專利利用表面選擇定則的理論，以創(chuàng)新的分子模板技術(shù)策略對基底上極低濃度的待測物分子的分子構(gòu)象進(jìn)行約束，使之以垂直的鍵合方式與sers基底進(jìn)行結(jié)合，創(chuàng)造有利于得到良好增強(qiáng)效果的條件，成為一種大幅提升sers基底檢測靈敏度的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述問題，我們發(fā)明了一種專用的、具有特殊組成的分子模板增強(qiáng)試劑，首次采用傳統(tǒng)金或銀sers基底與分子模板增強(qiáng)試劑相結(jié)合的方法，來大幅提高sers檢測靈敏度。該方法具有操作簡單、增強(qiáng)效果好、具有廣泛應(yīng)用前景等優(yōu)點(diǎn)，解決目前sers檢測的重大困難。

本發(fā)明的目的是提供一種利用分子模板增強(qiáng)試劑提升sers基底檢測靈敏度的方法，本發(fā)明在傳統(tǒng)sers基底的基礎(chǔ)上將探針分子最低檢出濃度降低了100倍左右，實(shí)現(xiàn)了對待測探針分子的超痕量檢測，目前為止沒有利用該方法提高sers檢測靈敏度的相關(guān)報(bào)道。

本發(fā)明采用吡啶、對巰基苯甲酸(mba)、對巰基苯胺(patp)、羅丹明b、羅丹明6g(r6g)、葡萄糖等作為探針分子，吸附在金或銀納米粒子基底表面，并首次使用分子模板增強(qiáng)試劑對吸附在基底上的探針分子構(gòu)象進(jìn)行約束，形成優(yōu)化的增強(qiáng)條件。使用該方法得到的sers信號相比于沒有使用分子模板增強(qiáng)試劑有很明顯的增強(qiáng)，增強(qiáng)因子在10⁸左右。這項(xiàng)工作證明了分子模板增強(qiáng)試劑對表面增強(qiáng)拉曼光譜信號有很高的增強(qiáng)效果，并提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。該方法的增強(qiáng)機(jī)理是通過調(diào)整極低濃度時(shí)吸附在sers基底上探針分子平行于基底的構(gòu)象，形成有利于得到sers信號的垂直于基底的分子構(gòu)象，從而實(shí)現(xiàn)探針分子檢測靈敏度的提高。

本發(fā)明通過制備傳統(tǒng)的金或銀納米粒子自組裝的sers基底并吸附探針分子，之后采用分子模板增強(qiáng)試劑對極低濃度時(shí)探針分子的分子構(gòu)象進(jìn)行調(diào)整，與傳統(tǒng)方法相比較，sers信號有很大的增強(qiáng)。

本發(fā)明所述的一種利用分子模板增強(qiáng)試劑提升sers基底檢測靈敏度的方法，其步驟如下：

1.表面吸附探針分子的sers基底的制備

1.1金納米粒子溶膠的制備：采用檸檬酸鈉還原法，即frens法。這種方法制備的膠體金的顆粒大小一致，通過控制檸檬酸鈉和氯金酸的比例可以制備出粒子直徑從16～147nm范圍內(nèi)的金納米粒子溶膠。

具體方法如下：把氯金酸先配制成質(zhì)量濃度為0.01％的水溶液(實(shí)驗(yàn)所用水均為超純水，下同)，取100ml水溶液加熱至沸；攪拌下向其中加入0.5～8.5ml、質(zhì)量濃度1％的檸檬酸鈉水溶液，繼續(xù)煮沸10～20分鐘；此時(shí)可以觀察到溶液從淡黃色很快變成灰色，繼而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色，冷卻至室溫得到金納米粒子溶膠。檸檬酸在開始的作用是還原劑。后來，帶負(fù)電荷的檸檬酸根吸附到金納米粒子表面，由于表面電荷的排斥作用使得金納米粒子免于聚集。

1.2銀納米粒子溶膠的制備：檸檬酸鈉還原的銀溶膠的制備，將36mg硝酸銀溶入200ml水中，快速加熱至沸騰，在劇烈攪拌下迅速加入0.2～7.5ml、質(zhì)量濃度1％的檸檬酸鈉水溶液，保持微沸騰狀態(tài)繼續(xù)反應(yīng)1～2小時(shí)，然后自然冷卻至室溫，得到褐灰色的銀納米粒子溶膠；該方法合成的銀納米粒子的直徑范圍為30～120nm。

1.3sers基底的制備

基片的預(yù)處理：把玻璃或硅片分別在水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇、水中依次超聲處理3～8分鐘，然后放在質(zhì)量濃度30％的h2o2水溶液和質(zhì)量濃度98％的濃h2so4水溶液的混合液(兩種溶液的體積比為3：7)中煮15～30分鐘，冷卻后用水洗凈；

聚二烯丙基二甲基氯化銨(pdda)/銀(金)薄膜的自組裝方法：將預(yù)處理后的基片首先浸入0.01～0.1mol/l的pdda水溶液中10～20分鐘，取出后用水清洗，再浸入前面制備的金納米粒子溶膠或銀納米粒子溶膠中5～8小時(shí)，取出后用水清洗，再用氮?dú)獯蹈?，從而得到表面自組裝有金或銀納米粒子(納米粒子層厚度為50～100nm)的sers基底。

另外一種制備sers基底的方法是，把預(yù)處理后的基片置于真空鍍膜機(jī)中真空蒸鍍上5～10nm厚的金或銀薄膜，從而得到表面蒸鍍有金或銀納米粒子的sers基底。

1.4表面吸附探針分子的sers基底的制備

將上述兩種方法任一種方法制備的sers基底置于探針分子的乙醇溶液(探針分子的濃度為10^-6～10^-9m)中浸泡20～30小時(shí)后取出，然后用乙醇清洗掉未被吸附的探針分子后氮?dú)獯蹈?，得到表面吸附探針分子的sers基底；

上述方法所述的探針分子為能夠吸附在sers基底表面的分子，如吡啶、對巰基苯甲酸(mba)、對巰基苯胺(patp)、羅丹明b、羅丹明6g(r6g)、葡萄糖等。

2.在表面吸附探針分子的sers基底上使用增強(qiáng)試劑；

配置10^-4～10^-6m的正己硫醇的乙醇溶液，將上述吸附探針分子的sers基底浸泡在正己硫醇的乙醇溶液中4～10小時(shí)后用乙醇清洗，氮?dú)獯蹈?，得到?gòu)筑有分子模板的sers基底。

3.增強(qiáng)試劑技術(shù)結(jié)合金或銀納米粒子sres基底后的sers測試

將前面制備得到的構(gòu)筑有分子模板的sers基底進(jìn)行sers測試，測試結(jié)果表明利用分子模板增強(qiáng)試劑有效地提升了sers基底檢測靈敏度。

本發(fā)明使用的儀器是bruker公司的ftraman光譜儀，激發(fā)源波長為633nm。

sers光譜結(jié)果結(jié)合掃描電子顯微鏡(sem)，原子力顯微鏡(afm)，x射線光電子能譜(xps)，初步判斷引起信號明顯增強(qiáng)的原因是化學(xué)增強(qiáng)，屬于取向電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理。

本發(fā)明中，采用金或銀納米材料作為基底，結(jié)合新型的增強(qiáng)試劑技術(shù)，對探針分子進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜(sers)檢測。進(jìn)一步提高了sers基底的增強(qiáng)效果，實(shí)現(xiàn)了對待測物分子的超痕量檢測。通過新方法的使用，得到更多探針分子與基底相互作用的信息。為進(jìn)一步研究sers的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為發(fā)展sers成為材料表面特殊性質(zhì)的表征工具奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1：實(shí)施例1所述的未使用增強(qiáng)試劑時(shí)不同濃度patp分子(曲線1，探針分子濃度10^-7m；曲線2，探針分子濃度10^-8m；曲線3，探針分子濃度10^-9m。)吸附在銀基底上的sers光譜；

圖2：實(shí)施例1所述的增強(qiáng)試劑使用前(曲線1)和使用后(曲線2)10^-9m的patp分子的sesr光譜；

圖3：實(shí)施例2所述的增強(qiáng)試劑使用前(曲線1)和使用后(曲線2)10^-9m的mba分子的sesr光譜；

圖4：實(shí)施例3所述的增強(qiáng)試劑使用前(曲線1)和使用后(曲線2)10^-9m的r6g分子的sers光譜；

圖5：實(shí)施例4所述的增強(qiáng)試劑使用前(曲線1)和使用后(曲線2)10^-6m的葡萄糖分子的sers光譜。

具體實(shí)施方案

實(shí)施例1：以表面自組裝有銀納米粒子的sers基底結(jié)合增強(qiáng)試劑技術(shù)在檢測對巰基苯胺(patp)分子中的應(yīng)用

1.銀溶膠的制備：將36mg硝酸銀溶入200ml水中，快速加熱至沸騰，在劇烈攪拌下迅速加入4ml、質(zhì)量濃度1％的檸檬酸鈉水溶液，保持微沸騰狀態(tài)繼續(xù)反應(yīng)1.5小時(shí)，然后自然冷卻，攪拌至室溫，所得溶膠是褐灰色。得到粒徑大小為70nm的銀納米粒子溶膠。銀納米粒子在玻璃基片上的組裝：把玻璃基片分別在水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇、水中超聲清洗5分鐘，然后放在質(zhì)量濃度30％的h2o2水溶液和質(zhì)量濃度98％的h2so4水溶液(體積比為3:7)混合液中煮20分鐘，冷卻后用水洗凈待用。pdda/銀薄膜的組裝方法：把玻璃基片首先浸入0.01mol/l的pdda水溶液中15分鐘，取出后用水清洗，再浸入銀納米粒子溶膠中6小時(shí)，取出用水清洗后氮?dú)獯蹈伞?/p>

2.探針分子的吸附：將上述方法制備的sers基底置于探針分子對巰基苯胺的乙醇溶液(探針分子濃度分別為10^-7m、10^-8m和10^-9m)中浸泡24小時(shí)后取出，乙醇清洗掉未吸附的探針分子后氮?dú)獯蹈伞?/p>

3.基底表面使用增強(qiáng)試劑：配置10^-5m的正己硫醇的乙醇溶液，將上述吸附有探針分子對巰基苯胺的sers基底浸泡在正己硫醇的乙醇溶液中4小時(shí)后用乙醇清洗基底，氮?dú)獯蹈纱谩?/p>

4.探針分子的sers檢測：如圖1所示，沒有使用增強(qiáng)試劑時(shí)，吸附在sers基底上的對巰基苯胺分子sers信號強(qiáng)度隨濃度降低而降低，當(dāng)patp濃度降低至10^-9m時(shí)，sers信號消失。這是由于當(dāng)探針分子濃度極低時(shí)其在sers基底上的構(gòu)象發(fā)生變化，由高濃度時(shí)的直立狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫杏诨椎臉?gòu)象。根據(jù)sers表面選擇定則原理，這種構(gòu)象不利于得到比較好的sers增強(qiáng)效果。針對這個(gè)問題，我們提出了利用增強(qiáng)試劑技術(shù)改變極限濃度時(shí)patp在sers基底上的構(gòu)象來達(dá)到增強(qiáng)sers信號的效果。如圖2所示，當(dāng)在傳統(tǒng)sers基底上使用增強(qiáng)試劑后，得到了10^-9m的patp分子的信號，且在峰形和峰位置方面與增強(qiáng)試劑使用前沒有明顯變化，說明該方法具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

實(shí)施例2：以金納米粒子作為sers基底結(jié)合增強(qiáng)試劑技術(shù)在檢測對巰基苯甲酸(mba)分子時(shí)的應(yīng)用

1.金納米粒子溶膠的制備：把氯金酸先配制成質(zhì)量濃度0.01％的水溶液，取100ml加熱至沸。攪拌下準(zhǔn)確加入2.5ml、質(zhì)量濃度1％的檸檬酸鈉水溶液，繼續(xù)煮沸15分鐘。此時(shí)可以觀察到溶液從淡黃色很快變成灰色，繼而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。冷卻至室溫后得到金納米粒子溶膠。

2.金納米粒子在玻璃基片上的組裝：把實(shí)驗(yàn)所用的玻璃基片分別在水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇、水中超聲清洗5分鐘，然后放在質(zhì)量濃度30％的h2o2水溶液和質(zhì)量濃度98％的濃h2so4水溶液(體積比為3:7)的混合液中煮20分鐘左右，冷卻后用水洗凈待用。pdda/金薄膜的組裝方法是，把基片首先浸入0.01mol/l的pdda水溶液中15分鐘，取出后用水清洗，再浸入金納米粒子溶膠中6小時(shí)，取出用水清洗后氮?dú)獯蹈伞?/p>

3.探針分子的吸附：將上述方法制備的sers基底置于探針分子對巰基苯甲酸(mba)的乙醇溶液中(探針分子的濃度為10^-9m)浸泡24小時(shí)后取出，乙醇溶液清洗掉未吸附的探針分子后氮?dú)獯蹈伞?/p>

4.基底表面使用增強(qiáng)試劑：配置10^-5m的正己硫醇的乙醇溶液，將上述吸附有探針分子的sers基底浸泡在正己硫醇的乙醇溶液中4小時(shí)后用乙醇清洗基底，氮?dú)獯蹈纱谩?/p>

5.探針分子的sers檢測如圖3所示，使用增強(qiáng)試劑前在傳統(tǒng)sers基底上不能得到10^-9m的mba分子的sers信號，但在增強(qiáng)試劑使用之后可以得到信噪比非超高的sers譜圖，原理同實(shí)施例1，這里不在贅述。

實(shí)施例3：以銀納米粒子作為sers基底結(jié)合增強(qiáng)試劑技術(shù)在檢測羅丹明6g(r6g)分子時(shí)的應(yīng)用

1.銀溶膠的制備：將36mg硝酸銀溶入200ml水中，快速加熱至沸騰，在劇烈攪拌下迅速加入4ml、質(zhì)量濃度1％的檸檬酸鈉水溶液，保持微沸騰狀態(tài)繼續(xù)反應(yīng)1.5小時(shí)，然后自然冷卻，攪拌至室溫。所得溶膠是褐灰色，得到了粒徑大小為70nm的銀納米粒子溶膠。

2.銀納米粒子在玻璃基片上的組裝：把實(shí)驗(yàn)所用的玻璃基片分別在水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇、水中超聲清洗5分鐘，然后放在質(zhì)量濃度30％的h2o2水溶液和質(zhì)量濃度98％的濃h2so4水溶液(體積比為3:7)的混合液中煮20分鐘左右，冷卻后用水洗凈待用。pdda/銀薄膜的組裝方法是，把基片首先浸入0.01mol/l的pdda水溶液中15分鐘，取出后用水清洗，再浸入銀溶膠中6小時(shí)，取出用水清洗后氮?dú)獯蹈伞?/p>

3.探針分子的吸附：將上述方法制備的sers基底置于羅丹明6g分子的乙醇溶液(探針分子濃度為10^-9m)中浸泡24小時(shí)后取出，乙醇溶液清洗掉未吸附的探針分子后氮?dú)獯蹈伞?/p>

4.基底表面使用增強(qiáng)試劑：配置10^-5m的正己硫醇乙醇溶液，將上述吸附有待測物分子的sers基底浸泡在正己硫醇乙醇溶液中4小時(shí)后用乙醇清洗基底，氮?dú)獯蹈纱谩?/p>

5.如圖4所示，在檢測羅丹明6g(r6g)時(shí)使用增強(qiáng)試劑，得到了與patp分子和mba分子同樣的結(jié)論，充分說明本方法具有普遍性。

實(shí)施例4：以真空蒸鍍金薄膜作為sers基底結(jié)合增強(qiáng)試劑技術(shù)在檢測葡萄糖分子時(shí)的應(yīng)用

1.真空蒸鍍金薄膜的制備：將實(shí)驗(yàn)所用的玻璃基片分別在水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇、水中超聲清洗5分鐘后置于蒸鍍膜機(jī)中真空蒸鍍上5nm厚的金薄膜，備用。

2.葡萄糖分子的吸附：將上述金基底浸泡在配置好的10^-6m葡萄糖水溶液中8小時(shí)，取出后用水清洗氮?dú)獯蹈伞?/p>

3.增強(qiáng)試劑的使用：配置10^-5m的正己硫醇乙醇溶液，將上述吸附有待測物分子的sers基底浸泡在正己硫醇乙醇溶液中4小時(shí)后用乙醇清洗基底，氮?dú)獯蹈纱谩?/p>

4.樣品sers檢測：如圖5所示，使用增強(qiáng)試劑前后，葡萄糖樣品的sers強(qiáng)度有明顯提高，證明增強(qiáng)試劑在檢測葡萄糖分子時(shí)起到了巨大作用。