本發(fā)明涉及一種軟x射線冷凍成像樣品的制備方法，屬于冷凍細胞樣品顯微成像技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

軟x射線冷凍成像是一種研究細胞自然狀態(tài)下超微結(jié)構(gòu)的重要方法，可以為細胞生物學(xué)提供重要的信息。在波長為2.34-4.37nm的水窗區(qū)域，富含碳和氮的生物成分對x射線的吸收強度比水大一個數(shù)量級，因此樣品無需脫水和染色即可得到高襯度成像。此外，不同生物結(jié)構(gòu)中，各種元素的含量比例不同，因此吸收襯度也不同，重構(gòu)后獲得的不同結(jié)構(gòu)的線性吸收系數(shù)分布就會不一樣。根據(jù)該性質(zhì)可區(qū)分樣品中的不同結(jié)構(gòu)，如細胞中的核糖體、液泡、線粒體等(uchidam.,yeast.28,2011:227-236)，它提供了高信噪比、分辨率為幾十納米的吸收襯度成像。通過x射線斷層掃描技術(shù)(ct成像)能夠獲得更加豐富的結(jié)構(gòu)信息，實現(xiàn)細胞的三維成像。

冷凍細胞樣品的制備是軟x射線冷凍成像的重要環(huán)節(jié)，良好的制樣是獲得高質(zhì)量成像的必要前提?，F(xiàn)有的軟x射線冷凍成像樣品制備大多采用電鏡用銅網(wǎng)，制樣過程相對簡單。但是，當(dāng)樣品旋轉(zhuǎn)到高角度時使用的銅網(wǎng)會限制樣品信息的采集，造成樣品信息的角度缺失。由于角度受限，三維圖像重構(gòu)效果往往不理想，重構(gòu)的樣品結(jié)構(gòu)形態(tài)和線性吸收系數(shù)都有偏差，在角度缺失的方向會形成楔形偽跡，這給樣品數(shù)據(jù)的后期定量計算和分析帶來困難(z.liang.,synchrotronrad.23,2016:606-616)。為了解決角度缺失問題，出現(xiàn)了基于毛細管的樣品制備方法。薄壁玻璃毛細管可以實現(xiàn)完整角度的數(shù)據(jù)收集，因此消除了使用銅網(wǎng)所造成的角度缺失問題，可以給出較好的三維重構(gòu)結(jié)果。但是，這種制樣方法又會帶來其他問題。毛細管細胞樣品由石英玻璃管制做，管壁約幾百納米，而軟x射線水窗波段內(nèi)石英的吸收系數(shù)比較大，毛細管會吸收超過一半的光子，這大大降低了光子的利用率和成像襯度，增長了曝光時間，給提高軟x射線冷凍成像的分辨率帶來了困難。為了進一步克服毛細管對于成像的限制，有人采用碳納米管進行制樣，在冷凍電鏡成像上取得了一定的效果。但在軟x射線冷凍成像中，碳納米管的引入會對生物成像造成極大干擾(colinm.palmer,ultramicroscopy,137,2014:20-29)。因此，對于軟x射線冷凍成像樣品的制備，始終沒有較好的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的軟x射線冷凍樣品制備方法中的成像角度缺失以及能量損失問題，提出一種軟x射線冷凍成像樣品的制備方法，通過制作自支撐結(jié)構(gòu)的冷凍樣品來解決上述問題，可以滿足完整角度x射線成像且減少光子能量損耗，有效地提高軟x射線冷凍成像能力。

本發(fā)明要實現(xiàn)的自支撐冷凍細胞樣品如圖1所示。圖1中包括細胞樣品模具和在快速冷凍后從細胞樣品模具中脫離形成的自支撐冷凍細胞樣品。其中，1為細胞樣品模具：灰色邊框的用途為將細胞樣品限制在所設(shè)計的結(jié)構(gòu)中，中間凹陷的區(qū)域為細胞樣品的填充區(qū)域。自支撐冷凍細胞樣品分為兩部分：凸字形的成冰區(qū)和連接機構(gòu)。成冰區(qū)為低溫速凍后形成的以冰為主體的脫離細胞樣品模具的部分，分為細小頂部的成像區(qū)(2)和底部的連接區(qū)(3)。其中，頂部的微米尺寸部位為進行軟x射線冷凍成像的細胞樣品區(qū)，底部尺寸較大的區(qū)域為實現(xiàn)自支撐冰結(jié)構(gòu)與外界連接的連接區(qū)。連接機構(gòu)(4)的功能是為了將成冰區(qū)連接到軟x射線冷凍成像設(shè)備的樣品座上。

獲得自支撐冷凍細胞樣品的關(guān)鍵是：細胞樣品在經(jīng)低溫快速冷凍后如何從基片上脫離，形成自支撐結(jié)構(gòu)。通常，水在物體表面凍結(jié)成冰并連成一體的過程可以分為兩步：

1、水在物體的表面鋪展，填平表面上凹凸不平的結(jié)構(gòu)，形成液體膜薄層；

2、降溫后水分子固化，具有足夠的機械強度，與物體表面產(chǎn)生錨固作用，最終粘接成一體。

要實現(xiàn)細胞樣品在經(jīng)低溫快速冷凍后從基片上脫離，就必須破壞水的這種粘接過程。從上述的兩個步驟來看，降溫固化是冷凍細胞樣品制備的必然環(huán)節(jié)，因此要實現(xiàn)樣品從基片表面的脫離就只能改變步驟1，破壞水在物體表面的鋪展。基片的表面能是影響水在基片表面鋪展的主要因素，因此，可以通過在基片表面加工一層低表面能物質(zhì)，使得水不能在其表面有效鋪展，降低水在冷凍成冰之后與基片表面的機械錨固作用，實現(xiàn)低溫冷凍后形成的冰塊從基片表面脫離形成自支撐結(jié)構(gòu)。

為了實現(xiàn)上述的自支撐冷凍細胞樣品，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種軟x射線成像樣品的制備方法，如圖2所示，步驟如下：

(1)在基片上沉積低表面能材料；

(2)根據(jù)細胞樣品的特征以及軟x射線冷凍成像設(shè)備的樣品座進行掩模設(shè)計；

(3)在沉積有低表面能材料的基片上制作細胞樣品模具結(jié)構(gòu)；

(4)將需要與軟x射線冷凍成像設(shè)備樣品座相連接的部件放入細胞樣品模具結(jié)構(gòu)中，滴加細胞樣品水溶液，并快速浸入到低溫液體中進行冷凍；

(5)速凍形成的無定形冰與細胞樣品模具發(fā)生分離，獲得自支撐冷凍細胞樣品。

所述第1步中，低表面能層對于水的接觸角應(yīng)大于80度。可以選擇對水的接觸角大于80度的材料通常選擇聚合物材料，如有機玻璃、聚苯乙烯等，根據(jù)材料的不同可以采用旋涂或濺射等工藝來實現(xiàn)，通常選擇的厚度小于2微米。

所述第2步中，為了實現(xiàn)360度無遮擋軟x射線細胞冷凍成像，所述掩模結(jié)構(gòu)設(shè)計為頂部細小的凸字形結(jié)構(gòu)。其中，進行軟x射線冷凍成像的細胞樣品區(qū)為微米尺寸的細小頂部結(jié)構(gòu)，其尺寸為：橫向小于20微米，縱向尺寸小于100微米；實現(xiàn)與外界連接的是毫米尺寸的底部結(jié)構(gòu)，其尺寸為：橫向尺寸小于4毫米，縱向尺寸小于10毫米。

所述第3步中，細胞樣品模具結(jié)構(gòu)通過以下方法制作：(a)基于光刻工藝制作光刻膠微通道，利用微結(jié)構(gòu)的高度來限制生物液體樣品的形狀；為了提高成像樣品在軟x射線冷凍成像中對軟x射線吸收的吸收均勻性，細胞樣品模具結(jié)構(gòu)的高度與掩模中細小頂部結(jié)構(gòu)的橫向尺寸相等。(b)選擇表面能比步驟(1)中材料更小的疏水材料，通常為含氟聚合物或超疏水材料，基于lift-off工藝或軟壓印工藝加工細胞樣品模具結(jié)構(gòu)的疏水涂層，利用材料表面能的差異來限制細胞樣品水溶液的形狀。

所述第4步中，需要與軟x射線冷凍成像設(shè)備樣品座相連接的部件應(yīng)選擇導(dǎo)熱性比較好的金屬材料制作，如銅、鋁等。其橫向尺寸略小于掩模中底部結(jié)構(gòu)的橫向尺寸，長度和厚度尺寸應(yīng)配合相應(yīng)的軟x射線冷凍成像設(shè)備樣品座來設(shè)計，滿足軟x射線冷凍成像需求。

所述第4步中，低溫液體為-100℃以下液體，常用有液氮、液態(tài)乙烷等。為了獲得無定形冰，浸入低溫液體的速度應(yīng)不小于1m/s。

本發(fā)明通過采用微納加工工藝將所需要的細胞樣品模具結(jié)構(gòu)加工到低表面能材料上，然后在該結(jié)構(gòu)中滴加待成像的細胞樣品，將帶有細胞樣品的細胞樣品模具快速插入到低溫液體中，速凍后冰層從基片表面脫離，獲得可以進行軟x射線冷凍成像的自支撐冷凍細胞樣品。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點在于：本發(fā)明可以制備自支撐冷凍細胞樣品。由于沒有銅網(wǎng)邊緣對于軟x射線的遮擋，可以滿足全角度軟x射線成像，避免了銅網(wǎng)法所導(dǎo)致的成像角度缺失，從而解決了成像過程中產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)信息缺失偽影等問題。同時，相對于毛細管樣品方法，沒有多余的管壁，僅有冰層包裹。由于水窗波段冰對軟x射線的吸收率較低，因此無多余的光子能量損耗，可以提高水窗波段軟x射線的光子利用率，增強成像的襯度。

附圖說明

圖1加工的自支撐冷凍細胞樣品和細胞樣品模具示意圖；1細胞樣品模具，2細胞成像區(qū)，3連接區(qū)，4連接機構(gòu)；

圖2本發(fā)明方法的實現(xiàn)流程圖。

具體實施方法

以下結(jié)合實例對軟x射線細胞冷凍樣品的制備具體過程進一步加以說明。

實例1利用正性光刻膠在低溫下的材料特性來實現(xiàn)軟x射線細胞冷凍成像樣品的制備。

正性光刻膠的主要成分是線性酚醛樹脂，遇到急速冷凍后會從基底脫落。利用正性光刻膠制作微通道來限制包含細胞的液體樣品的形狀，在速凍后有助于實現(xiàn)冰樣品從基底脫離，獲得可無遮擋、無吸收的軟x射線冷凍細胞成像樣品。

具體制作如下：

(1)在基片上沉積低表面能材料：首先清洗基片，將基片放入丙酮中超聲5min，然后用超純水沖洗。在熱臺上熱烘20min后，用反應(yīng)離子刻蝕機處理6min，氧氣20sccm，功率30w。然后旋涂有機玻璃pmma,轉(zhuǎn)速3000rpm，180度烘兩個小時，冷卻后得到800nm厚的pmma涂層。

(2)設(shè)計細胞樣品模具掩模：細胞成像區(qū)域的尺寸為橫向20微米、縱向50微米，連接區(qū)尺寸為橫向2毫米、縱向5毫米，加工出相應(yīng)的掩模。

(3)在沉積有低表面能材料的基片上制作細胞樣品模具結(jié)構(gòu)：首先旋涂正性光刻膠az9260，2000rpm,110℃烘10min,冷卻后得到10微米厚的az9260的光刻膠層。利用設(shè)計好的掩模進行紫外曝光，曝光劑量1800mj/cm²，用6‰的naoh顯影120s，用超純水漂洗后，利用n2吹干，得到細胞樣品模具結(jié)構(gòu)。

(4)將連接用銅片放置在成冰區(qū)的連接區(qū)，將待成像細胞水溶液樣品滴加到制作的細胞樣品模具中，然后以1.2m/s的速度浸入液氮中進行速凍。

(5)速凍后，成冰區(qū)的冰層和連接用銅片與基底脫開，獲得軟x射線冷凍成像所需的自支撐冷凍細胞樣品。

制備的冷凍細胞樣品是自支撐結(jié)構(gòu)，細胞成像區(qū)域為包含細胞的微米尺寸的冰柱。對本發(fā)明制備的冷凍細胞樣品進行軟x射線冷凍成像，既沒有銅網(wǎng)邊緣對于軟x射線的遮擋，也沒有多余的管壁對軟x射線的吸收，可以滿足完整角度x射線成像且減少光子能量損耗，能有效地提高軟x射線冷凍成像能力。

實例2利用聚四氟乙烯的超低表面能實現(xiàn)軟x射線細胞冷凍成像樣品的制備。

聚四氟乙烯的表面能較低，其接觸角大于120度，加工的聚四氟乙烯結(jié)構(gòu)能夠?qū)D形中的液體實現(xiàn)無側(cè)邊束縛，控制包含細胞的水溶液樣品的形狀，在速凍后有助于實現(xiàn)冰樣品從基底脫離，獲得可無遮擋、無吸收的軟x射線冷凍細胞成像樣品。

具體制作如下：

(1)在基片上沉積低表面能材料：首先清洗基片，將基片放入丙酮中超聲5min，然后用超純水沖洗。在熱臺上烘20min后，用反應(yīng)離子刻蝕機處理6min，氧氣20sccm，功率30w。然后旋涂有機玻璃pmma,轉(zhuǎn)速3000rpm，180度烘兩個小時，冷卻后得到800nm厚的pmma涂層。

(2)設(shè)計細胞樣品模具掩模：細胞成像區(qū)域的尺寸為橫向10微米、縱向40微米，連接區(qū)尺寸為橫向2毫米、縱向5毫米，加工出相應(yīng)的掩模。

(3)在沉積有低表面能材料的基片上制作細胞樣品模具結(jié)構(gòu)：首先旋涂正性光刻膠ar5260，2000rpm,100℃烘10min，冷卻后得到1微米厚的az5260的光刻膠層。利用設(shè)計好的掩模進行紫外光刻，g線曝光劑量45mj/cm²，用4‰的naoh溶液顯影20s，用超純水漂洗后利用n2吹干。然后，對樣品進行二次紫外曝光，曝光劑量100mj/cm²-150mj/cm²。在二次曝光過的樣品上旋涂濃度為0.66％的聚四氟乙烯溶液,轉(zhuǎn)速3000rpm,后烘溫度100℃，時間5min。烘干后進行l(wèi)ift-off工藝，將樣品放到乙醇溶液中浸泡50s，去除光刻膠，取出后用n2吹干。

(4)將連接用銅片放置在成冰區(qū)的連接區(qū)，將待成像細胞水溶液滴加到制作的細胞樣品模具結(jié)構(gòu)里，然后以1.4m/s的速度浸入液態(tài)乙烷中進行速凍。

(5)速凍后，成冰區(qū)的冰層和連接用銅片與基底脫開，獲得軟x射線成像所需的自支撐冷凍細胞樣品。

制備的冷凍細胞樣品是自支撐結(jié)構(gòu)，細胞成像區(qū)域為包含細胞的微米尺寸的冰柱。對本發(fā)明制備的冷凍細胞樣品進行軟x射線冷凍成像，既沒有銅網(wǎng)邊緣對于軟x射線的遮擋，也沒有多余的管壁對軟x射線的吸收，可以滿足完整角度x射線成像且減少光子能量損耗，能有效地提高軟x射線冷凍成像能力。

提供以上實施例僅僅是為了描述本發(fā)明的目的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求限定。不脫離本發(fā)明的精神和原理而做出的各種等同替換和修改，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。