本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種茶葉鮮樣中游離氨基酸含量的快速分析方法，該快速分析方法能夠同時(shí)分離、分析茶葉鮮樣中18種游離氨基酸。

背景技術(shù)：

茶是世界三大天然飲料之一，具有獨(dú)特的香氣、豐富的營(yíng)養(yǎng)和保健功效，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。茶葉中含有豐富的氨基酸，它們是構(gòu)成茶葉滋味的重要成分，直接影響茶葉的品質(zhì)。茶葉中的氨基酸主要有兩種存在形式，一種以游離態(tài)形式存在；另一種以結(jié)合態(tài)存在于肽和蛋白質(zhì)中。其中，游離氨基酸，如茶氨酸、谷氨酸、精氨酸、絲氨酸等，是茶葉中一類重要的含氮物質(zhì)，它們不僅是合成茶葉蛋白的基本單位，還是合成許多與代謝有關(guān)的生理活性物質(zhì)的基質(zhì)，其組成、含量及在加工過(guò)程中的降解產(chǎn)物和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物以及這些組分間的含量變化均直接影響到茶葉香氣和滋味，對(duì)茶葉的品質(zhì)具有重要作用。因此，茶葉中游離氨基酸的分析研究對(duì)茶葉的開(kāi)發(fā)利用、工藝控制、品質(zhì)鑒定和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)都具有十分重要的意義。

現(xiàn)今對(duì)茶葉中游離氨基酸分析方法的研究中以干樣較多和較為成熟，如國(guó)標(biāo)gb/t8303-2013中規(guī)定，茶樣需磨碎后在電熱恒溫干燥箱中加熱、除去水分至恒重后再用于氨基酸含量的測(cè)定。由于干樣通常經(jīng)高溫殺青、烘干和粉碎而成，高溫過(guò)程中蛋白質(zhì)變性，其蛋白酶的生物活性喪失，易造成蛋白質(zhì)降解導(dǎo)致游離氨基酸含量增加，同時(shí)烘干等步驟可能會(huì)引起茶葉各種生化成分的轉(zhuǎn)化，使得測(cè)定的數(shù)據(jù)并不能反應(yīng)茶葉中氨基酸的真實(shí)水平，從而產(chǎn)生檢測(cè)誤差。

目前，茶葉中氨基酸的分析方法有很多，主要有茚三酮比色法、氣相色譜及其質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法等。經(jīng)典的氨基酸分析方法一般采用氨基酸分析儀，使用茚三酮作為衍生試劑柱后衍生測(cè)定。但氨基酸分析儀價(jià)格昂貴，分析時(shí)間長(zhǎng)，專屬性強(qiáng)，只能用于分析氨基酸，限制了其廣泛應(yīng)用。相對(duì)于其他幾種方法，柱前衍生-高效液相色譜法無(wú)需特殊反應(yīng)裝置，具有儀器普及率高、分析時(shí)間短、方法靈活多樣、靈敏度高、易于推廣的優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為氨基酸檢測(cè)的常規(guī)手段。中國(guó)發(fā)明專利“利用反相高效液相色譜檢測(cè)茶葉中游離氨基酸的方法”（cn104678044a）以6-氨基喹啉-n-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯為柱前衍生劑，使用氨基酸專用分析柱進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)合反相高效液相色譜，實(shí)現(xiàn)了對(duì)茶葉中谷氨酰胺等19種氨基酸的定量分析。但該發(fā)明采用氨基酸分離專用色譜柱，需要進(jìn)行復(fù)雜的梯度分離，使用成本高，運(yùn)行周期長(zhǎng)（1h左右），在大量樣品分析過(guò)程中，十分的費(fèi)時(shí)，不利于氨基酸的快速分析和推廣普及。更重要的是，該發(fā)明沒(méi)有對(duì)方法的準(zhǔn)確性、靈敏性、精密性等進(jìn)行必要的方法學(xué)檢驗(yàn)，技術(shù)效果無(wú)法得到有效保障。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種茶葉鮮樣中游離氨基酸含量的快速分析方法，其目的在于解決現(xiàn)有的茶葉氨基酸分析方法中存在的速度慢、效率低、成本高、基礎(chǔ)應(yīng)用推廣難等問(wèn)題。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種茶葉鮮樣中游離氨基酸含量的快速分析方法，包括以下兩部分：

第一部分，配制溶液，再用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法建立已知梯度濃度的被測(cè)的游離氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立由以下步驟組成：

步驟（1），準(zhǔn)備氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別為天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸；

步驟（2），分別配制0.14mol/l的磷酸鹽緩沖液、0.4mol/l的硼酸鹽緩沖液、0.8mg/ml的aqc衍生液、6種濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，6種濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各氨基酸的濃度為：

天冬氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

絲氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

谷氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

組氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

甘氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

精氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

蘇氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

丙氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

脯氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

茶氨酸25μmol/l、50μmol/l、250μmol/l、500μmol/l、1000μmol/l、1250μmol/l；

胱氨酸2.5μmol/l、5μmol/l、25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、125μmol/l；

酪氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

纈氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

蛋氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

賴氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

異亮氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

亮氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

苯丙氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

步驟（3），對(duì)所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)；

移取6種濃度的所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每種濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均取10μl，置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，分別加入70μl所述硼酸鹽緩沖液，渦旋混合；分別取20μl所述aqc衍生液，在渦旋狀態(tài)下加入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，渦旋混合，靜置后在50~55℃下加熱8~15min，取出冷卻至室溫，供分析用；

步驟（4），用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定衍生化的所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各氨基酸的色譜峰保留時(shí)間和色譜峰面積，以色譜峰保留時(shí)間定性，然后以所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的摩爾濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制出所述標(biāo)準(zhǔn)曲線；

其中，儀器分離條件為：

色譜柱：xbridgec18色譜柱（規(guī)格為3.9mm×15cm，4μm）；柱溫37℃；流速2.0ml/min；

熒光檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)250nm，發(fā)射波長(zhǎng)395nm；

流動(dòng)相：a為磷酸鹽緩沖液，按l:10的體積比用超純水稀釋；b為100%乙腈；c為100%超純水；梯度洗脫程序：0min，100%a；0.5min，98%a+2.0b%；0.5-9.0min，96.5%a+3.5%b；9.0-9.5min，95.0%a+5.0%b；9.5-11.5min，91.5%a+8.5%b；11.5-13.0min，83.0%a+17.0%b，保持4min；17.0min，60.0%b+40%c，保持2min；19-23min，100%a；進(jìn)樣量10μl；

第二部分，測(cè)定茶葉鮮樣中所述第一部分中的18種游離氨基酸含量，包括以下步驟：

步驟（1），樣品制備；

取茶葉鮮樣攪碎并混合均勻，向茶葉鮮樣中加入沸水，所述茶葉鮮樣與所述沸水的投入比為向每1g茶葉鮮樣中投入40ml沸水，在88~92℃條件下浸提18~22min，冷卻至室溫后，2500~3500r/min離心4~6min，上清液加水定容10ml，過(guò)0.45μm微孔濾膜后得到茶鮮葉樣品溶液；

步驟（2），對(duì)所述茶鮮葉樣品溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)；

移取10μl茶鮮葉樣品溶液，置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，加入70μl所述硼酸鹽緩沖液，渦旋混合；取20μl所述aqc衍生液，在渦旋狀態(tài)下加入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，渦旋混合，靜置后在50~55℃下加熱8~15min，取出冷卻至室溫，供分析用；

步驟（3），根據(jù)所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各氨基酸的色譜峰保留時(shí)間對(duì)所述茶鮮葉樣品溶液中游離氨基酸定性，使用外標(biāo)曲線法計(jì)算茶鮮葉樣品溶液中游離氨基酸的含量；其中，測(cè)定茶鮮葉樣品溶液中游離氨基酸的儀器分離條件與所述第一部分的步驟（4）中的儀器分離條件相同。

上述技術(shù)方案中的有關(guān)內(nèi)容解釋如下：

1、上述方案中，在所述第一部分的步驟（2）中，0.14mol/l的磷酸鹽緩沖液的配制方法為：稱取19.0g三水醋酸鈉、1.72g三乙胺溶于1000ml水，用磷酸調(diào)節(jié)ph至5.05，加edta，用0.45μm濾膜過(guò)濾；

0.4mol/l的硼酸鹽緩沖液的配制方法為：稱取12.36g硼酸，加400ml水溶解，用400g/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至8.8，然后加水稀釋至500ml；

0.8mg/ml的aqc衍生液的配制方法為：向1mgaqc粉末中加入1.25ml乙腈，渦旋混合，在55℃條件下加熱至溶解。aqc即指6-氨基喹啉基-n-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯，waters公司生產(chǎn)，乙腈為色譜純。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于25ml容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，得氨基酸單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中茶氨酸濃度為12.5μmol/l，于-20℃冰箱保存。

取17種氨基酸混合標(biāo)液（除胱氨酸濃度為1.25mmol/l外，其余濃度均為2.5mmol/l）40μl，再加入40μl濃度為12.5μmol/l的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水定容到1ml，得到含茶氨酸的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)母液，其中，茶氨酸濃度為500μmol/l、胱氨酸為50μmol/l，其余各氨基酸濃度均為100μmol/l。再用所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)母液配制成上述6種濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

本發(fā)明設(shè)計(jì)特點(diǎn)：本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有茶葉氨基酸分析技術(shù)中存在的速度慢、效率低、成本高、推廣難等問(wèn)題，通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新，建立了一種快速、實(shí)用、高效、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的茶葉鮮樣中18種游離氨基酸的分離分析的方法。將茶葉鮮樣攪碎混勻，以超純水作為萃取溶劑，在90℃條件下浸提20min，離心過(guò)濾后，以6-氨基喹啉-n-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯為衍生劑柱前衍生化，使用xbridgec18色譜柱梯度洗脫，用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器分離檢測(cè)。傳統(tǒng)方法均以茶葉干樣作為樣品來(lái)檢測(cè)氨基酸含量，這是由于茶葉鮮樣比茶葉干樣含有更多的水分、色素、水溶性灰分、茶多酚等干擾物質(zhì)，容易造成后續(xù)分離困難，也就是說(shuō)，現(xiàn)有的測(cè)定茶葉干樣中游離氨基酸的檢測(cè)方法，不適用于茶葉鮮樣的測(cè)定。本發(fā)明以茶葉鮮樣代替茶葉干樣作為樣品，為了解決分離困難的難題，創(chuàng)造性、針對(duì)性地選用6-氨基喹啉-n-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯為柱前衍生劑，聯(lián)合利用xbridgec18色譜柱以及高效液相色譜-熒光檢測(cè)器分離分析，發(fā)現(xiàn)能夠快速、高效、準(zhǔn)確地分離分析茶葉鮮樣中18種游離氨基酸。尤其是選用規(guī)格為4μm的高效xbridgec18色譜柱與aqc柱前衍生法聯(lián)用，在保證分析速度更快的同時(shí)，能夠很好地分離茶葉鮮樣中的各種游離氨基酸組分，從而保證了對(duì)茶葉鮮樣中18種游離氨基酸的定性定量分析。

與現(xiàn)有茶葉氨基酸分析技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果：

①首次建立了針對(duì)茶葉鮮樣中18種游離氨基酸的快速定量分析方法，優(yōu)點(diǎn)在于以茶葉鮮樣作為樣品，代替了傳統(tǒng)方法中以茶葉干樣作為樣品來(lái)檢測(cè)氨基酸含量，避免了高溫、烘干等步驟可能引起的茶葉各種生化成分間的轉(zhuǎn)化、導(dǎo)致游離氨基酸含量變化而產(chǎn)生的檢測(cè)誤差，測(cè)定數(shù)據(jù)更加精準(zhǔn)可靠，可真實(shí)地反應(yīng)茶葉中氨基酸的含量水平；

②選用xbridgec18色譜柱，代替氨基酸專用分析柱，對(duì)氨基酸進(jìn)行分離分析，通過(guò)技術(shù)優(yōu)化，成功實(shí)現(xiàn)了氨基酸組分的分離，達(dá)到了定量檢測(cè)茶葉中茶氨酸等18游離氨基酸的目的，而且整個(gè)分析周期只有23分鐘，大大提高了對(duì)氨基酸的分析效率，可滿足大批量樣品分析對(duì)進(jìn)度的要求。同時(shí)，xbridgec18色譜柱價(jià)格相對(duì)便宜，專屬性不強(qiáng)，可以用于其他物質(zhì)的檢測(cè)，在節(jié)省分析成本的前提下，彌補(bǔ)了目前基于高效液相色譜不能準(zhǔn)確對(duì)茶葉中茶氨酸等18種游離氨基酸進(jìn)行快速分析的空缺，特別適合在廣大基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)和單位推廣使用。

總之，本發(fā)明的樣品制備快速簡(jiǎn)單、成本低，精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性以及線性關(guān)系良好，整個(gè)分析過(guò)程快速、靈敏且重現(xiàn)性好，適用于茶葉鮮樣中游離氨基酸的快速分析，為開(kāi)展茶葉質(zhì)量評(píng)價(jià)、等級(jí)評(píng)定、指紋圖譜構(gòu)建提供了理想的方法，易于推廣應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

附圖1為本發(fā)明氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中18種氨基酸的hplc圖譜，按照出峰順序依次標(biāo)號(hào)，數(shù)字標(biāo)號(hào)分別表示：1.天冬氨酸；2.絲氨酸；3.谷氨酸；4.組氨酸；5.甘氨酸；6.精氨酸；7.蘇氨酸；8.丙氨酸；9.脯氨酸；10.茶氨酸；11.胱氨酸；12.酪氨酸；13.纈氨酸；14.蛋氨酸；15.賴氨酸；16.異亮氨酸；17.亮氨酸；18.苯丙氨酸。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實(shí)施例：一種茶葉鮮樣中游離氨基酸含量的快速分析方法

所述快速分析方法包括以下兩部分：

第一部分，配制溶液，再用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法建立已知梯度濃度的被測(cè)的游離氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立由以下步驟組成：

步驟（1），準(zhǔn)備氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別為天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸；

準(zhǔn)備儀器與設(shè)備：2695高效液相色譜儀，配2475熒光檢測(cè)器（waters公司）；tg16-ws臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器公司）；k600粉碎機(jī)（德國(guó)博朗公司）；le-3000電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司）；direct-q5uv超純水機(jī)（美國(guó)millipore公司）。

步驟（2），0.14mol/l的磷酸鹽緩沖液的配制：稱取19.0g三水醋酸鈉、1.72g三乙胺溶于1000ml水，用磷酸調(diào)節(jié)ph至5.05，加edta，用0.45μm濾膜過(guò)濾；

0.4mol/l的硼酸鹽緩沖液的配制：稱取12.36g硼酸，加400ml水溶解，用400g/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至8.8，然后加水稀釋至500ml；

0.8mg/ml的aqc衍生液的配制：向1mgaqc粉末中加入1.25ml乙腈，渦旋混合，在55℃條件下加熱至溶解。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于25ml容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，得氨基酸單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中茶氨酸濃度為12.5μmol/l，于-20℃冰箱保存。

取17種氨基酸混合標(biāo)液（除胱氨酸濃度為1.25mmol/l外，其余濃度均為2.5mmol/l）40μl，再加入40μl濃度為12.5μmol/l的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水定容到1ml，得到含茶氨酸的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)母液，其中，茶氨酸濃度為500μmol/l、胱氨酸為50μmol/l，其余各氨基酸濃度均為100μmol/l。再用所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)母液配制成6種濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。6種濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各氨基酸的濃度為：

天冬氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

絲氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

谷氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

組氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

甘氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

精氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

蘇氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

丙氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

脯氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

茶氨酸25μmol/l、50μmol/l、250μmol/l、500μmol/l、1000μmol/l、1250μmol/l；

胱氨酸2.5μmol/l、5μmol/l、25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、125μmol/l；

酪氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

纈氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

蛋氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

賴氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

異亮氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

亮氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

苯丙氨酸5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、250μmol/l；

步驟（3），對(duì)所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)；

移取6種濃度的所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每種濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均取10μl，置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，分別加入70μl所述硼酸鹽緩沖液，渦旋混合；分別取20μl所述aqc衍生液，在渦旋狀態(tài)下加入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，渦旋混合10～20s，靜置1min后在55℃下加熱10min，取出冷卻至室溫，供分析用；

步驟（4），用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定衍生化的所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各氨基酸的色譜峰保留時(shí)間和色譜峰面積，以色譜峰保留時(shí)間定性，然后以所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的摩爾濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制出所述標(biāo)準(zhǔn)曲線；

其中，儀器分離條件為：

色譜柱：xbridgec18色譜柱（規(guī)格為3.9mm×15cm，4μm，waters公司）；柱溫37℃；流速2.0ml/min；

熒光檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)250nm，發(fā)射波長(zhǎng)395nm；

流動(dòng)相：a為磷酸鹽緩沖液，按l:10的體積比用超純水（18.4mω）稀釋；b為100%乙腈；c為100%超純水；梯度洗脫程序：0min，100%a；0.5min，98%a+2.0b%；0.5-9.0min，96.5%a+3.5%b；9.0-9.5min，95.0%a+5.0%b；9.5-11.5min，91.5%a+8.5%b；11.5-13.0min，83.0%a+17.0%b，保持4min；17.0min，60.0%b+40%c，保持2min；19-23min，100%a；進(jìn)樣量10μl；

第二部分，測(cè)定茶葉鮮樣中所述第一部分中的18種游離氨基酸含量，包括以下步驟：

步驟（1），樣品制備；

取茶葉鮮樣攪碎并混合均勻，稱取0.25g，加入10ml沸水，在90℃的水浴鍋中浸提20min，冷卻至室溫后，3000r/min離心5min，上清液加水定容10ml，過(guò)0.45μm微孔濾膜后備用得到茶鮮葉樣品溶液；

步驟（2），對(duì)所述茶鮮葉樣品溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)；

移取10μl茶鮮葉樣品溶液，置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，加入70μl所述硼酸鹽緩沖液，渦旋混合；取20μl所述aqc衍生液，在渦旋狀態(tài)下加入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，渦旋混合10～20s，靜置1min后在55℃下加熱10min，取出冷卻至室溫，供分析用；

步驟（3），根據(jù)所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各氨基酸的色譜峰保留時(shí)間對(duì)所述茶鮮葉樣品溶液中游離氨基酸定性，使用外標(biāo)曲線法計(jì)算茶鮮葉樣品溶液中游離氨基酸的含量；其中，測(cè)定茶鮮葉樣品溶液中游離氨基酸的儀器分離條件與所述第一部分的步驟（4）中的儀器分離條件相同。

本實(shí)施例的試驗(yàn)結(jié)果：

1、氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜分離

從附圖1中可以看出，氨基酸各組分之間的分離度良好，出峰緊湊且峰形對(duì)稱，分析周期為23分鐘，在保證了分離效果的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了快速分析的目的和效果。18種氨基酸的出峰順序依次為：天冬氨酸-絲氨酸-谷氨酸-組氨酸-甘氨酸-精氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-脯氨酸-茶氨酸-胱氨酸-酪氨酸-纈氨酸-蛋氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸。

2、方法的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

將所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液衍生化后進(jìn)樣測(cè)定，以氨基酸溶液濃度（x）為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，在5～250μmol/l范圍內(nèi)，氨基酸的濃度與其峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9978～0.9999。以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限，結(jié)果見(jiàn)表1。

表118種氨基酸的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

3、方法回收率

精密稱取0.25g已知氨基酸含量的茶鮮葉樣品5份，向其中加入一定體積的氨基酸混和標(biāo)液，進(jìn)行樣品制備、衍生反應(yīng)后測(cè)定，采用外標(biāo)法定量，計(jì)算各氨基酸的回收率和rsd（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）（表2）。

18種氨基酸的回收率在86.25%～109.05%之間，rsd在6.03%～10.56%之間，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，方法可靠。

表2茶葉鮮樣加標(biāo)回收結(jié)果

4、方法精密度

取適量含18種氨基酸的混合標(biāo)液，按上述方法衍生后進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣5次，以色譜峰的保留時(shí)間和峰面積為指標(biāo)計(jì)算rsd，考察其精密度。各氨基酸保留時(shí)間rsd在0.09%～0.55%，峰面積rsd在1.12%～2.15%，說(shuō)明本方法精密度較高。

5、方法重復(fù)性

取同一茶鮮葉樣品5份，按上述方法提取、衍生、測(cè)定，以色譜峰峰面積超過(guò)1%的氨基酸的保留時(shí)間和峰面積為指標(biāo)分別計(jì)算rsd，考察方法的重復(fù)性。茶鮮葉所含氨基酸峰保留時(shí)間rsd在0.55%～1.98%之間，峰面積rsd在2.08%～3.71%之間，重復(fù)性較好。

6、方法穩(wěn)定性

取同一茶鮮葉樣品供試溶液，按照上述方法衍生，分別在0、4、8、12、24h進(jìn)樣，以色譜峰峰面積超過(guò)1.0%的氨基酸的保留時(shí)間和峰面積為指標(biāo)計(jì)算rsd，考察茶鮮葉中氨基酸衍生化溶液的穩(wěn)定性。各氨基酸衍生化產(chǎn)物保留時(shí)間rsd在0.23%～2.01%（n=5），峰面積rsd在1.18%～3.91%(n=5)。表明氨基酸衍生化溶液在室溫下可以穩(wěn)定24h。

7、方法應(yīng)用

應(yīng)用建立的方法，分別對(duì)取自蘇州洞庭東山和洞庭西山的2個(gè)碧螺春茶葉鮮樣中的游離氨基酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3所示，nd表示該種氨基酸含量低于檢出限。

表3茶葉鮮樣中游離氨基酸測(cè)定結(jié)果

上述實(shí)施例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。