本發(fā)明涉及利用磁性納米材料和時(shí)間分辨熒光納米材料結(jié)合核酸適配體識(shí)別對(duì)玉米赤霉烯酮進(jìn)行檢測(cè),特點(diǎn)在于利用玉米赤霉烯酮適配體功能化的磁性納米材料對(duì)玉米小麥等樣品中玉米赤霉烯酮分離富集,使得檢測(cè)方便快捷，同時(shí)利用時(shí)間分辨熒光納米材料作為標(biāo)記物通過(guò)檢測(cè)時(shí)間分辨熒光信號(hào)進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度,該方法屬于納米材料與分子生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)，又稱f-2毒素，是主要由禾谷鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生的一種非甾體雌激素樣作用真菌毒素。該毒素的化學(xué)名稱為6-(10-羥基-6-氧基-十一碳烯基)-β-雷鎖酸，分子式：c18h22o5，相對(duì)分子質(zhì)量318.4，難溶于水，易溶于堿性水溶液和醇類，其甲醇溶液在紫外光下呈綠-藍(lán)熒光。zen廣泛存在于谷物中，主要污染玉米、大麥、小麥、燕麥、高粱和大米等作物，在面粉、麥芽、啤酒及奶制品、肉制品等產(chǎn)品中也有一定程度的分布。zen對(duì)人類及動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重威脅，危害僅次于黃曲霉毒素。zen對(duì)動(dòng)物具有較強(qiáng)的生殖發(fā)育毒性和免疫毒性，可引起動(dòng)物雌激素亢進(jìn)癥，導(dǎo)致不孕不育、胎兒畸形和生長(zhǎng)發(fā)育不良，特別對(duì)豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)人類食用被污染的作物或肉、蛋奶等制品后，zen進(jìn)入人體主要危害表現(xiàn)為生殖發(fā)育毒性、免疫毒性、基因毒性、肝腎毒性，致腫瘤(子宮瘤、乳腺癌、睪丸癌)毒性。

目前，zen檢測(cè)方法主要有薄層色譜法(tlc)、高效液相色譜法(hplc)、高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法(hplc-ms/ms)及基于抗原-抗體免疫識(shí)別建立的免疫法等。薄層層析法操作步驟較繁瑣，靈敏度及特異性低，已不能滿足現(xiàn)代檢測(cè)的需要。而常用的色譜分析法，樣品前處理方法復(fù)雜、繁瑣，且需要熟練掌握儀器操作技術(shù)，不便基層推廣。免疫法檢測(cè)zen雖具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但是小分子抗原zen的制備過(guò)程繁瑣耗時(shí)、成本昂貴，不同批次間抗體存在差異性，儲(chǔ)存及使用條件嚴(yán)苛，導(dǎo)致假陽(yáng)性率高、重復(fù)性差。所以開(kāi)發(fā)一種快速方便，穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低廉的檢測(cè)方法很有必要。

核酸適配體(aptamer)是從體外合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中通過(guò)指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)技術(shù)篩選得到的與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的一簇小分子dna或rna片段。核酸適配體能夠識(shí)別與之對(duì)應(yīng)的任何類型的蛋白和低分子等靶物質(zhì)，并與靶物質(zhì)具有高度親和力。與抗體相較，核算適配體有諸多優(yōu)點(diǎn)，比如體外合成周期短，制備成本低，無(wú)需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；穩(wěn)定性好，對(duì)溫度不敏感；易于修飾等等，而且適配體作為識(shí)別分子已經(jīng)在臨床診斷、臨床治療、藥物運(yùn)輸、蛋白質(zhì)組研究和食品安全中得到廣泛應(yīng)用。

時(shí)間分辨熒光是一種特殊的熒光現(xiàn)象，是利用物質(zhì)的熒光壽命長(zhǎng)短進(jìn)行時(shí)間分辨，即采用適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光源和檢測(cè)體系，可以得到在固定波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度-時(shí)間曲線和在固定時(shí)間的熒光發(fā)射光譜，用于對(duì)混合物中光譜重疊但壽命差異的組分實(shí)現(xiàn)分辨，并可分別進(jìn)行測(cè)定；通過(guò)設(shè)置合理的延遲時(shí)間(delaytime)和門控時(shí)間(gatetime，也稱檢測(cè)時(shí)間)消除了檢測(cè)環(huán)境中雜質(zhì)自發(fā)熒光和背景熒光對(duì)信噪比的干擾，從而提高分析方法靈敏度。時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵在于鑭系元素?zé)晒馓结樅头治瞿Ｊ降挠行ч_(kāi)發(fā)和結(jié)合利用。隨著納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展，具有良好水分散性的鑭系納米材料作為一類新型發(fā)光標(biāo)記物，其固有的時(shí)間分辨光學(xué)特性逐漸被開(kāi)發(fā)并利用起來(lái)。鑭系摻雜納米材料本身具有諸多優(yōu)越的理化特性，比如水分散性好、熒光壽命長(zhǎng)、耐光漂白、斯托克斯位移寬、生物兼容性好、細(xì)胞毒性低、多色可調(diào)控(摻雜元素種類和比例)，有利于生物體系中多組分同時(shí)檢測(cè)。鑒于上述優(yōu)點(diǎn)，新型鑭系摻雜的熒光納米材料具備了良好的時(shí)間分辨熒光分析應(yīng)用前景。磁性納米材料的物理長(zhǎng)度恰好處于納米量級(jí)且具有制備方法簡(jiǎn)單、原料低廉、獨(dú)特的超順磁性、表面易于修飾、生物相容性好等特點(diǎn)，使得其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明首先合成得到了表面生物功能化的磁性納米材料和時(shí)間分辨熒光納米材料,再通過(guò)磁性納米材料結(jié)合的目標(biāo)核酸適配體和時(shí)間分辨熒光納米材料結(jié)合的核酸適配體互補(bǔ)鏈之間的雜交將兩者組裝構(gòu)成復(fù)合納米結(jié)構(gòu),以紫外光進(jìn)行激發(fā)，誘導(dǎo)時(shí)間分辨熒光為檢測(cè)信號(hào),通過(guò)對(duì)不同濃度玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,達(dá)到對(duì)含玉米赤霉烯酮樣品進(jìn)行定量檢測(cè)的目的。該發(fā)明可以用于玉米、小麥、谷物、飼料及其制品等樣品中玉米赤霉烯酮含量的檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一種時(shí)間分辨熒光標(biāo)記-適配體識(shí)別檢測(cè)玉米赤霉烯酮的方法：分別制備得到氨基化的fe3o4磁性納米材料和時(shí)間分辨熒光納米材料nayf4:ce/tb,對(duì)磁性納米材料和時(shí)間熒光分辨納米材料進(jìn)行表面親和素(avidin)修飾，隨后通過(guò)親和素(avidin)與生物素(biotin)之間的作用與生物素(biotin)修飾的適配體dna和適配體互補(bǔ)鏈(cdna)特異性結(jié)合分別構(gòu)成熒光探針和捕獲探針。將兩者經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的孵育,通過(guò)互補(bǔ)雜交使得兩者組裝成復(fù)合納米材料。利用外界磁場(chǎng)對(duì)納米材料進(jìn)行分離并且利用紫外光(273nm)激發(fā),記錄此時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度為最大值，當(dāng)加入目標(biāo)分析物玉米赤霉烯酮時(shí),適配體的空間構(gòu)象發(fā)生變化,與玉米赤霉烯酮發(fā)生特異性結(jié)合,使得適配體dna與互補(bǔ)單鏈(cdna)解鏈,從而導(dǎo)致時(shí)間分辨熒光納米材料與磁性納米顆粒分離,此時(shí)再富集后檢測(cè),得到熒光信號(hào)強(qiáng)度減小。在一定范圍內(nèi)玉米赤霉烯酮的含量與熒光信號(hào)強(qiáng)度減小的數(shù)值相關(guān),基于此對(duì)玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,以達(dá)到對(duì)實(shí)際樣品中玉米赤霉烯酮進(jìn)行定量檢測(cè)的目的；步驟為：

1、采用一步溶劑熱法合成nayf4:ce/tb并對(duì)其做表面修飾

稱取1mmol的磷酸乙醇胺(aep)和1mmol的nacl溶于30ml乙二醇中并不斷攪拌，隨后加入0.9mmoly(no3)3·6h2o、0.05mmolce(no3)3·6h2o、0.05mmoltb(no3)3·6h2o。然后，將含有4mmolnh4f的10ml乙二醇溶液(45℃水浴攪拌充分溶解)逐滴加入上述透明溶液中，于室溫下繼續(xù)攪拌30min后轉(zhuǎn)移至50ml鐵氟龍高壓反應(yīng)釜內(nèi)，195℃反應(yīng)4h。反應(yīng)后，取出冷卻至室溫，以乙醇、超純水交替洗滌三次，溶于超純水中于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2、制備氨基化fe3o4磁性納米顆粒

稱取2.0g無(wú)水醋酸鈉和1.0g六水合三氯化鐵加入30ml乙二醇，將6.5g溫浴的1,6-己二胺加入前者的混合液中，加熱至50℃，并不斷攪拌形成酒紅色透亮的均質(zhì)膠體溶液。將該溶液轉(zhuǎn)移至100ml反應(yīng)釜中，198℃高溫反應(yīng)6h。反應(yīng)完成后取出反應(yīng)釜自然冷卻至室溫全部倒入燒杯(分批沖洗轉(zhuǎn)移殘留粉末)，然后利用磁鐵分離收集，棄去上層混合液體，將磁分離獲得的黑色粉末用超純水，超聲分散，然后磁分離棄去溶液，收集粉末。采用超純水和無(wú)水乙醇輪流洗滌三次，所得黑色粉末在50℃下干燥12h，取出研缽研磨至細(xì)粉末，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

3、利用戊二醛方法將時(shí)間分辨熒光納米材料和磁性納米材料與親和素(avidin)進(jìn)行偶聯(lián)

由于時(shí)間分辨熒光納米材料和磁性納米材料表面含有氨基基團(tuán)，因此可以通過(guò)戊二醛法將親和素共價(jià)結(jié)合到材料表面。將時(shí)間熒光分辨納米材料和磁性納米材料用10mm磷酸鹽緩沖液(pbs)重懸，制成1mg/ml溶液，超聲15min使其充分分散于緩沖液中。將材料與5％的戊二醛在室溫下避光輕微震蕩活化2h，時(shí)間分辨熒光納米材料用離心的方法去除未反應(yīng)的戊二醛，磁性材料通過(guò)外加磁場(chǎng)去除未反應(yīng)的戊二醛，接著用pbs清洗三次，然后加入親和素(1mg/ml)37℃震蕩過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后清洗數(shù)次，棄上清。

4、親和素修飾的磁性納米材料和時(shí)間分辨熒光納米材料分別與適配體和適配體互補(bǔ)鏈進(jìn)行偶聯(lián)

利用通過(guò)親和素(avidin)與生物素(biotin)之間的特異性結(jié)合將表面修飾親和素(avidin)的磁性納米材料和時(shí)間分辨熒光納米材料與生物素(biotin)修飾的玉米赤霉烯酮適配體dna單鏈和適配體互補(bǔ)鏈cdna連接。具體方法為：將5mg親和素修飾的磁性納米材料和時(shí)間分辨熒光納米材料分散于5ml(10mm)磷酸鹽緩沖液中，分別加入一定量的生物素化的玉米赤霉烯酮適配體和適配體互補(bǔ)鏈，在37℃搖床中孵育12h，離心收集材料，用磷酸鹽緩沖液清洗三次，分散于磷酸鹽緩沖液中。

5、玉米赤霉烯酮適配體dna單鏈和適配體互補(bǔ)鏈cdna雜交

將時(shí)間分辨熒光納米顆粒與磁性納米材料連接起來(lái)構(gòu)成一個(gè)納米復(fù)合物，具體實(shí)施方法：取400μl時(shí)間分辨熒光納米材料標(biāo)記的互補(bǔ)dna單鏈溶液，與100μl適配體功能化磁性納米材料混合，在磷酸緩沖液體系中37℃反應(yīng)1h，之后在外加磁場(chǎng)作用1min，收集組裝好的納米材料復(fù)合物，并用磷酸鹽緩沖液清洗3次。

6、玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

將組裝好的納米材料復(fù)合物溶解在的磷酸鹽緩沖液中,配制不同濃度的玉米赤霉烯酮加入復(fù)合物體系中，于37℃條件下孵育40min，再經(jīng)過(guò)磁分離棄上清,清洗三遍以保證解離脫落的時(shí)間分辨熒光納米材料不在磁性納米材料表面附著,從而保證檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，最后將富集到的混合物重懸到200μl的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。采用酶標(biāo)儀synergyh1,biotek在時(shí)間分辨熒光模式下，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為273nm，延遲時(shí)間為100μs，檢測(cè)時(shí)間為1000μs，在544nm處有時(shí)間分辨熒光信號(hào),用于檢測(cè)玉米赤霉烯酮。隨著玉米赤霉烯酮濃度的增加，時(shí)間分辨熒光信號(hào)逐步減小。根據(jù)熒光值與對(duì)應(yīng)的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在0.001～10ng/ml區(qū)間內(nèi)得到良好的線性關(guān)系。

7、對(duì)玉米赤霉烯酮樣品進(jìn)行檢測(cè)

對(duì)樣品做簡(jiǎn)單的處理，隨后直接加入到上述納米復(fù)合體系中，37℃條件下孵育40min，采用酶標(biāo)儀時(shí)間分辨熒光模式下，273nm下激發(fā)得到544nm處的熒光信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得對(duì)應(yīng)的玉米赤霉烯酮的濃度。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

1、利用鑭系摻雜納米材料熒光壽命長(zhǎng)的特點(diǎn)，通過(guò)時(shí)間分辨使得檢測(cè)背景的熒光衰減，從而大大的提高了檢測(cè)的靈敏度。

2、利用適配體對(duì)檢測(cè)物質(zhì)的特異性結(jié)合，有效的提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

3、利用磁性納米材料作為捕獲探針，將目標(biāo)檢測(cè)物進(jìn)行富集，可以有效縮短檢測(cè)周期，操作簡(jiǎn)單。

附圖說(shuō)明

圖1是基于時(shí)間分辨熒光標(biāo)記-適配體識(shí)別檢測(cè)玉米赤霉烯酮的原理圖

圖2是時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度隨玉米赤霉烯酮濃度變化疊加圖(a)；玉米赤霉烯酮檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(b)。

具體實(shí)施方式：

本發(fā)明包括但不限于以下實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則下進(jìn)行的任何等同替換或者拒不改進(jìn)，都將視為在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1：玉米實(shí)際樣品中玉米赤霉烯酮的檢測(cè)及加標(biāo)回收

樣品預(yù)處理：玉米高速粉碎過(guò)篩，稱取5g于100ml燒瓶中，加入5gnacl，甲醇(7:3)水溶液，充分混勻后置于均質(zhì)器中高速攪拌提取2min，靜止片刻，過(guò)濾，取10ml濾液置于50ml燒瓶中，再次在均質(zhì)器中高速攪拌提取2min，靜止后用超細(xì)玻璃纖維過(guò)濾紙過(guò)濾，直至濾液澄清，收集濾液備用。分別選取0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10ng/ml濃度的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品添加到待測(cè)物中，同樣利用本發(fā)明方法再次檢測(cè)其中玉米赤霉烯酮的含量，得到檢測(cè)值?；厥章剩ィ?檢測(cè)值-本底值)/添加量×100％。從表一的結(jié)果來(lái)看，回收率在80.76～122.36％，說(shuō)明本發(fā)明穩(wěn)定，靈敏，準(zhǔn)確，適合用于玉米實(shí)際樣品中玉米赤霉烯酮的檢測(cè)。

表一：玉米實(shí)際樣品中玉米赤霉烯酮的檢測(cè)和加標(biāo)回收率

實(shí)施例2：小麥實(shí)際樣品中玉米赤霉烯酮的檢測(cè)及加標(biāo)回收

樣品預(yù)處理同實(shí)例1。分別選取0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10ng/ml濃度的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品添加到待測(cè)物中，同樣利用本發(fā)明方法再次檢測(cè)其中玉米赤霉烯酮的含量，得到檢測(cè)值?；厥章剩ィ?檢測(cè)值-本底值)/添加量×100％。從表二的結(jié)果來(lái)看，回收率在90.04～114.75％，說(shuō)明本發(fā)明同樣適合用于小麥實(shí)際樣品中玉米赤霉烯酮的檢測(cè)。

表二：小麥實(shí)際樣品中玉米赤霉烯酮的檢測(cè)和加標(biāo)回收率