本申請涉及農(nóng)產(chǎn)品成分檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
：，特別是一種小麥面粉不溶性谷蛋白大聚體含量的近紅外測定方法。
背景技術(shù)：
：：近紅外光譜(near-infraredspectroscopy，nirs)基于分子振動的非諧振性，導(dǎo)致分子振動從基態(tài)向高能級躍遷時產(chǎn)生，波長范圍通常在800～2500nm，可以記錄含氫基團(tuán)c-h、o-h、n-h、s-h、p-h等振動的倍頻和合頻吸收，建立吸收光譜和物質(zhì)含量之間的關(guān)聯(lián)。非常適用于被檢物的水分含量分析和蛋白、碳水化合物、脂類等碳?xì)溆袡C(jī)物質(zhì)的含量分析。小麥籽粒及面粉中的谷蛋白通常以聚合體的形式存在，其中聚合度較高，在十二烷基硫酸鈉磷酸緩沖液中不易被提取的部分稱為不溶性谷蛋白大聚體(unextractablepolymericprotein，upp)。upp僅占小麥谷蛋白總量的約50％，貯藏蛋白總量的約5％，但與面筋強(qiáng)度呈極顯著的正相關(guān)，upp含量主要受基因型的影響，其對面筋質(zhì)量和食品品質(zhì)具有決定性的作用(zhangpp,hezh,xiaxc,etal.effectofpercentsds-unextractablepolymericprotein(％upp)onend-usequalityinchinesebreadwheatcultivars.cerealchemistry,2008,85:696-700；zhuj,khank.effectsofgenothpeandenvironmentongluteninpolymersandbreadmakingquality.cerealchem,2001,78:125-130；guptarb,khank,macritchief.biochemicalbasisofflourpropertiesinbreadwheats.i.effectsofvariationinthequantityandsizedistributionofpolymericprotein.jcerealsci,1993,18:23-41)。因此，如何快速準(zhǔn)確的定量分析upp成為小麥品種育種世代選擇的重要內(nèi)容。目前常用的谷蛋白大聚體分析方法包括：雙縮脲比色法(劉麗,周陽,何中虎,等.glu-1和glu-3等位變異對不溶性谷蛋白含量的影響.作物學(xué)報,2004,30:1086-1092)、丙醇分離法(beansr,lynerk,tilleyka,etal.arapidmethodforquantitationofinsolublepolymericproteinsinflour.cerealchem,1998,75:374-379；fubx,sapirsteinhd.procedureforisolatingmonomericproetinsandpolymericgluteninofwheatflour.cerealchem,1996,73:143-152)、多層凝膠電泳光密度掃描法(zhuj,khank.effectsofgenothpeandenvironmentongluteninpolymersandbreadmakingquality.cerealchem,2001,78:125-130)和凝膠色譜法(zhangpp,hezh,xiaxc,etal.effectofpercentsds-unextractablepolymericprotein(％upp)onend-usequalityinchinesebreadwheatcultivars.cerealchemistry,2008,85:696-700；guptarb,khank,macritchief.biochemicalbasisofflourpropertiesinbreadwheats.i.effectsofvariationinthequantityandsizedistributionofpolymericprotein.jcerealsci,1993,18:23-41)。雙縮脲比色法和丙醇分離法雖方法簡單，但其實際測定的并非谷蛋白大聚體的含量，而是谷蛋白聚合體的總量，并且雙縮脲比色法還存在平行樣本間的重復(fù)性差，費時費力的問題。多層凝膠電泳光密度掃描法測定過程和技術(shù)復(fù)雜，對凝膠的染色脫色要求嚴(yán)格，成本較高，費時費力。凝膠色譜法是目前最準(zhǔn)確的方法，但該方法設(shè)備和耗材昂貴，需要專門的技術(shù)人員，多用于要求較高的定量研究，但在育種輔助選擇中的應(yīng)用較少。目前，利用近紅外光譜技術(shù)對谷蛋白大聚體含量進(jìn)行測定的研究未見報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明建立了能夠測定小麥面粉谷蛋白大聚體含量的近紅外光譜測定方法(模型)，該方法樣品制備簡單，成本低廉，測定精度高。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：一種小麥面粉不溶性谷蛋白大聚體含量的近紅外測定方法，其具體步驟如下：1)制備谷蛋白大聚體樣品：利用sds-磷酸緩沖液提取液制備蛋白大聚體液體樣品，備用；具體提取方法為，分別稱取20mg面粉樣品于2.0ml離心管，加入1.6mlsds-磷酸緩沖液提取液震蕩10min，17000g離心5min，棄上清；在沉淀中再次加入1.6mlsds-磷酸緩沖液提取液，使用超聲波細(xì)胞粉碎儀提取20s，然后17000g離心5min，所獲得的上清液即為谷蛋白大聚體液體樣品；2)分別使用0.45μm尼龍膜(水系)針頭過濾器取步驟1)獲得的谷蛋白大聚體液體樣品200ul進(jìn)行色譜分析，獲得化學(xué)測定結(jié)果；3)分別取步驟1)獲得的谷蛋白大聚體液體待測樣品1.0～1.2ml，采集光譜數(shù)據(jù)；光譜掃描區(qū)間950-1650nm，掃描次數(shù)10次，溫度室溫，分辨率5nm；4)采用偏最小二乘方法，對步驟2)獲得的化學(xué)測定結(jié)果和步驟3)獲得的光譜數(shù)據(jù)計算分析，建立預(yù)測模型；該模型的決定系數(shù)為r2＝0.89，模型的定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)偏差為rmsecv＝36.40；5)采用unscrambler化學(xué)計量學(xué)軟件，結(jié)合偏最小二乘法方法建立預(yù)測的校準(zhǔn)模型；采用一階導(dǎo)數(shù)+s-g平滑的光譜預(yù)處理方式消除測量過程中光譜基線漂移對建立預(yù)測的校準(zhǔn)模型造成的影響，以交互驗證的標(biāo)準(zhǔn)偏差和所建模型的決定系數(shù)r2為評價預(yù)測的校準(zhǔn)模型效果的主要參數(shù)；6)采用與步驟1)相同的方法制備待測樣品的谷蛋白大聚體液體樣品，利用步驟5)獲得的預(yù)測的校準(zhǔn)模型，并按照步驟3)所述方法對待測樣品進(jìn)行近紅外光譜分析，即獲得待測樣品不溶性谷蛋白大聚體的含量。進(jìn)一步，本發(fā)明所述小麥面粉不溶性谷蛋白大聚體含量的近紅外測定方法中，步驟1)所述sds-磷酸緩沖液提取液是指，含質(zhì)量體積比0.5％sds的0.5m磷酸緩沖液，ph值6.90。進(jìn)一步，本發(fā)明所述小麥面粉不溶性谷蛋白大聚體含量的近紅外測定方法中，步驟1)所述超聲波細(xì)胞粉碎儀的提取參數(shù)為探頭，輸出功10w。進(jìn)一步，本發(fā)明所述小麥面粉不溶性谷蛋白大聚體含量的近紅外測定方法中，步驟2)所述色譜分析是指，采用高效液相色譜儀，bioseps4000凝膠色譜柱，流動相為含體積比0.05％三氟乙酸的50％乙腈水溶液(v/v)，流速0.5ml/min。進(jìn)一步，本發(fā)明所述小麥面粉不溶性谷蛋白大聚體含量的近紅外測定方法中，步驟3)所述采集光譜數(shù)據(jù)時，測定設(shè)備為pertenda7200二極管陣列近紅外光譜儀，裝樣硬件為液體石英樣品池，厚度為1mm。相較于現(xiàn)有測量方法，利用本申請?zhí)峁┑念A(yù)測模型對面粉不溶性谷蛋白大聚體的測定，具有精確、快速和低成本的突出特點，易于推廣應(yīng)用。附圖說明圖1為不溶性谷蛋白大聚體近紅外預(yù)測校準(zhǔn)模型中，化學(xué)值和光譜預(yù)測值的相關(guān)性分析圖。圖2為谷蛋白大聚體液體待測樣品(提取液)近紅外光譜圖。具體實施方式以下實施例詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，是用于舉例說明的目的，并非是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實施例中涉及的材料來源/配置方法/設(shè)備及工作參數(shù)：1、近紅外預(yù)測模型和模型使用的面粉樣本來源：申請人自行收集江蘇、安徽、山東、河南、陜西、四川等省份的小麥品種(系)120份，于2014-2015年度種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地。田間試驗采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，3行區(qū)，行長1.5m，2次重復(fù)，全生育期施氮量約225kg.hm-1，成熟后收獲籽粒樣品。將兩重復(fù)籽粒樣品等量混合后，使用brabenderquadrumatjuniorlaboratory按照標(biāo)準(zhǔn)程序制粉,出粉率約60％。這些樣本材料蛋白質(zhì)含量和不溶性谷蛋白大聚體含量變異豐富(見表1)，下述實施例中，隨機(jī)選取這些樣本中100份用于建模(實施例1)，20份用于模型驗證(實施例2)。表1建模樣品集的凝膠色譜化學(xué)值和光譜預(yù)測值基本統(tǒng)計分析參數(shù)平均值最大值最小值蛋白質(zhì)含量(％,干基)11.2515.038.54不溶性谷蛋白大聚體含量化學(xué)值(au/mg)1108.371805.57854.552、下述實施例近紅外光譜采集或測定主設(shè)備為pertenda7200二極管陣列近紅外光譜儀(瑞典波通儀器公司)，測定時裝樣硬件為液體石英樣品池，厚度為1mm。3、下述實施例化學(xué)值測定主設(shè)備為dionexultimate3000高效液相色譜儀，色譜柱為bioseps4000凝膠色譜柱。測定時的必要參數(shù)為：流動相為含0.05％(v/v)三氟乙酸的50％乙腈水溶液(v/v)，流速0.5ml/min?；瘜W(xué)值單位換算為au/mg，表示每毫克面粉中谷蛋白大聚體的吸光度(au)。4、sds-磷酸緩沖液提取液：含0.5％sds(w/v，十二烷基硫酸鈉)的0.5m磷酸緩沖液，ph6.90。實施例1不溶性谷蛋白大聚體含量測定近紅外模型的建立1、制備谷蛋白大聚體待測樣品：隨機(jī)選取100份面粉樣本，每份準(zhǔn)確稱取20mg于2.0ml離心管，加入1.6mlsds-磷酸緩沖液提取液室溫震蕩10min，17000g離心5min，棄上清；再次在沉淀中加入1.6mlsds-磷酸緩沖液提取液，使用超聲波細(xì)胞粉碎儀(探頭，10w)提取20s，然后17000g離心5min，所獲得的上清液即為谷蛋白大聚體液體待測樣品。2、色譜分析測定化學(xué)值：使用0.45μm尼龍膜(水系)針頭過濾器取200ul步驟1獲得的液體待測樣品進(jìn)行色譜分析，化學(xué)值變異范圍較寬，為854.55au/mg～1805.57au/mg。(具體測定方法參見guptarb,khank,macritchief.biochemicalbasisofflourpropertiesinbreadwheats.i.effectsofvariationinthequantityandsizedistributionofpolymericprotein.jcerealsci,1993,18:23-41；larroqueor,bekesf.rapidsize-exclusionchromatographyanalysisofmolecularsizedistributionforwheatendospermprotein.cerealchem,2000,77:451-453.)，本實施例100份樣本的化學(xué)測定結(jié)果見表2。3、建模及光譜收集：在步驟2進(jìn)行化學(xué)值測定同時，直接分別取谷蛋白大聚體液體待測樣品1.0～1.2ml，使用pertenda7200液體石英樣品池采集樣品的光譜數(shù)據(jù)。光譜掃描區(qū)間950-1650nm，掃描次數(shù)10次，溫度室溫，分辨率5nm。本實施例100份谷蛋白大聚體液體待測樣品(提取液)所獲得的近紅外光譜數(shù)據(jù)如圖2所示。4、不溶性谷蛋白大聚體近紅外測定模型的建立：通過對步驟2化學(xué)值(表2)和步驟3光譜數(shù)據(jù)的計算分析建模。本實施例所使用的建模軟件為theunscramblerx(v10.3，camo)，光譜數(shù)據(jù)見圖2，采用的建模方法為偏最小二乘(pls)方法，建模波段為950-1650nm。pls在運算時同時對光譜信息x和濃度信息y矩陣進(jìn)行主成分分解，并采用主因子進(jìn)行回歸，模型包含了光譜信息和樣品相關(guān)指標(biāo)的濃度信息；pls的具體步驟如下：首先，對x和y矩陣進(jìn)行分解，其模型為：y＝uqt+ey(1)x＝tpt+ex(2)式(1)、(2)中，t和p分別為x矩陣的得分和載荷矩陣，u和q分別為y的得分載荷矩陣，ex和ey分別為用pls模型擬合x和y時所剩余的殘差矩陣；然后，將t和u作線性回歸：u＝tb(3)b＝(ttt)-1tty(4)在預(yù)測時，首先根據(jù)載荷陣p求出未知樣品矩陣x未知的得分陣t未知，然后由式(5)得到濃度預(yù)測值：y未知＝t未知bq(5)5、獲得相應(yīng)的預(yù)測模型，利用該預(yù)測模型對光譜數(shù)據(jù)反向預(yù)測，獲得預(yù)測值(表2)。表2100份建模用面粉樣本的色譜分析化學(xué)值和模型預(yù)測值(au/mg)該模型的決定系數(shù)為r2＝0.89，模型的交互驗證標(biāo)準(zhǔn)偏差為rmsecv＝36.40，僅為建模樣品均值的3.28％。由表2可以看出，該模型精確地檢測sds磷酸緩沖提取液中不溶性谷蛋白大聚體的含量。待測樣品的主要吸收峰位于1400～1600nm范圍內(nèi)(如圖2所示)，主要是n-h的一倍頻、c-h的組合頻以及o-h的一倍頻吸收。同時，從圖2中可以看出，近紅外光譜區(qū)域內(nèi)各組分的吸收峰互相重疊，因此采用unscrambler化學(xué)計量學(xué)軟件，結(jié)合偏最小二乘法方法建立預(yù)測的校準(zhǔn)模型。建模前，采用一階導(dǎo)數(shù)+s-g平滑(平滑點數(shù)7點)的光譜預(yù)處理方式消除測量過程中光譜基線漂移對建模造成的影響。以交互驗證的標(biāo)準(zhǔn)偏差(standarderrorofcrossvalidation,secv)和所建模型的決定系數(shù)(r2)為評價建模效果的主要參數(shù)。實施例2不溶性谷蛋白大聚體含量測定近紅外模型的應(yīng)用另外選取未參與實施例1建模的樣品20個，采用與實施例1步驟1相同的樣品制備方法獲得谷蛋白大聚體液體待測樣品。使用實施例1中相同的da7200近紅外分析儀及液體石英樣品池，利用實施例1步驟4中建立的不溶性谷蛋白大聚體含量預(yù)測校準(zhǔn)模型(光譜譜檢測950-1650nm范圍內(nèi)物質(zhì)的吸光度，檢測指標(biāo)為谷蛋白大聚體含量)對樣品進(jìn)行檢測，并獲得近紅外檢測值(表3)，檢測時的測量條件與建模時的保持一致。采用與實施例1步驟2中相同色譜分析條件測定20份樣本的化學(xué)值，結(jié)果如表3。將近紅外預(yù)測校準(zhǔn)模型檢測結(jié)果與化學(xué)值作比對，結(jié)果同樣見表3。表320份驗證模型用面粉樣本的色譜分析化學(xué)值和模型檢測值(au/mg)注：預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)偏差為43.66au/mg，預(yù)測相關(guān)系數(shù)為0.93。由表3可以看出，使用已建立的近紅外檢測模型測定的谷蛋白大聚體含量檢測范圍較寬，預(yù)測相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.93，預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)偏差為43.66au/mg，該模型在面粉不溶性谷蛋白測定中具有較好的應(yīng)用前景。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12