本發(fā)明屬于獸藥殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種用于檢測動物肌肉中獸藥殘留物的分析方法。

背景技術(shù)：

食品動物肌肉組織因其具有高蛋白、相對低脂肪和口感好等優(yōu)點，是我國消費較多的主要動物性食品。恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、替米考星和泰樂菌素是常用的動物抗菌藥，由于它們具有廣譜、高效、價格低廉等優(yōu)點，在食品動物養(yǎng)殖生產(chǎn)中廣泛用于預(yù)防、治療疾病，提高飼料報酬，促進動物生長、發(fā)育等方面。但是長期使用或者不合理使用、不注重休藥期，易造成它們在動物肌肉組織中的殘留，通過食物鏈對人類造成潛在的危害，還會導(dǎo)致微生物的耐藥性、生態(tài)環(huán)境毒性等。因此，我國為加強食品動物生產(chǎn)的質(zhì)量安全管理，農(nóng)業(yè)部于2002年頒布了235號公告，規(guī)定了這些藥物在食品動物肌肉組織中的最大殘留限量(mrl)：如雞肉組織中磺胺類藥物的總量和磺胺二甲嘧啶單個藥物的mrl為100μg/kg；恩諾沙星和環(huán)丙沙星的總量為100μg/kg；沙拉沙星為10μg/kg；替米考星為75μg/kg；泰樂菌素為200μg/kg。

目前，藥物殘留分析的前處理方法主要有液-液萃取、固相萃取、quechers方法、基質(zhì)固相分散、索氏溶劑萃取和壓力溶劑萃取等技術(shù)。但是這些前處理技術(shù)，過程普遍比較繁瑣、耗時較長、提取雜質(zhì)多、重復(fù)性差、消耗大量有機試劑，對實驗操作者身體造成危害、對環(huán)境造成污染。隨著現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的不斷發(fā)展，高靈敏度和高選擇性的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)儀在日常獸藥殘留分析檢測獲得越來越廣泛的使用，可定量準確測定痕量水平(μg/kg)的目標分析物。對于大多數(shù)制定有最大殘留限量的獸藥而言，以往因為儀器靈敏度低，為了達到分析檢測要求，在最大限度的獲取殘留級的獸藥同時，常常因采用均質(zhì)和大量有機溶劑而導(dǎo)致“過度”破碎和提取，嚴重影響后面處理，增加了可重復(fù)性操作的難度；進一步濃縮、富集策略而實際是相對更大量雜質(zhì)也一并富集，大量共萃取雜質(zhì)不僅影響目標物的分離，檢測過程中會產(chǎn)生嚴重的基質(zhì)效應(yīng)，定性、定量分析都因而受到嚴重影響，測定結(jié)果重現(xiàn)性不好，準確度不可靠。因此，探索開發(fā)樣品前處理步驟簡單、方便、使用溶劑少、可操作性強、重現(xiàn)好和準確度高的技術(shù)十分必要，也具有重要理論意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測動物肌肉中獸藥殘留物的分析方法。該方法是基于低溫冷凍破碎細胞的原理，lc-ms/ms技術(shù)的高選擇性和高靈敏度特性，采用稀釋手段最大限度消除基質(zhì)效應(yīng)，建立提取方便、簡單、步驟少，有機溶劑用量少、環(huán)保，可操作性強，重現(xiàn)好和具有通用性的分析方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述分析方法在檢測動物肌肉中獸藥殘留物的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

一種用于檢測動物肌肉中獸藥殘留物的分析方法，包括以下步驟：

s1.將動物肌肉組織低溫冷凍破碎細胞，在15～25℃下解凍使細胞液流出，得到解凍組織；

s2.將解凍組織用淋洗溶劑淋洗，渦旋，離心處理，得到上清液；

s3.用甲醇或乙腈水溶液稀釋上清液，經(jīng)定容和過濾膜處理，得到濾液；

s4.將濾液經(jīng)c18反相色譜柱分離，以a乙腈或甲醇，b甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧離子源電離，正離子在m/z100～1000amu掃描，利用三重四極桿質(zhì)譜儀進行選擇反應(yīng)監(jiān)測分析，動物肌肉基質(zhì)匹配內(nèi)標法進行定性定量，進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測，即可檢測動物肌肉中獸藥殘留物。

優(yōu)選地，步驟s1中所述的動物肌肉組織為雞、豬、牛、羊或兔的肌肉。

優(yōu)選地，步驟s1中所述低溫冷凍的溫度為-80℃～-20℃，所述低溫冷凍的時間為3～12h；所述解凍的時間為15～30min。

優(yōu)選地，步驟s2中所述的淋洗溶劑為乙酸甲醇或乙腈溶液，所述乙酸甲醇或乙腈溶液的濃度為0.5～2％；所述渦旋的時間為0.5～2min；所述離心的溫度為4～10℃，所述離心的轉(zhuǎn)速為6000～9000轉(zhuǎn)/分鐘，所述離心的時間為10～20min。

優(yōu)選地，步驟s3中所述甲醇水溶液或乙腈水溶液的濃度為10～30％；所述甲醇水溶液或乙腈水溶液中含有0.05～0.2％的甲酸；所述定容的體積為8～16毫升；所述過濾膜為水系針頭濾膜，所述過濾膜的直徑為0.2～0.4微米。

優(yōu)選地，步驟s4中所述a乙腈或甲醇與b甲酸水溶液的體積比為1：(2～9)，所述甲酸水溶液的濃度為0.05～0.2％，所述梯度洗脫的程序為0～3.0min，10～20％a，90～80％b；3～10min，20～90％a,80～10％b；10～12min，90～95％a，10～5％b；12～14min，95～10％a，5～90％b；14～20min，10％a，90％b，所述a為乙腈或甲醇，b為甲酸水溶液。

更為優(yōu)選地，所述a乙腈或甲醇與b甲酸水溶液的體積比為1：4，所述甲酸水溶液的濃度為0.1％。

優(yōu)選地，步驟s4中所述質(zhì)譜的分析條件為電噴霧電離正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式，電噴霧電壓為4000～5500v，滯留時間為20～100毫秒，霧化氣壓力為55～65psi，輔助氣壓力為50～60psi，氣簾氣壓力為20～35psi，離子源溫度為550～650℃。

上方法在檢測動物肌肉中獸藥殘留物的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述獸藥為恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、替米考星或泰樂菌素中的一種以上。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1.本發(fā)明將低溫冷凍破碎動物組織細胞的原理和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)結(jié)合起來，建立了所需有機溶劑少、提取步驟簡單、環(huán)保、低成本、可操作性強的分析方法，可以檢測動物肌肉組織中典型獸藥：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、替米考星或泰樂菌素的殘留物。

2.本發(fā)明將肌肉組織經(jīng)低溫冷凍破碎細胞后，用乙酸甲醇或乙腈溶液提取樣品中的分析物，用乙腈-甲酸水溶液或甲醇-甲酸水溶液稀釋定容，lc-ms/ms分析測定。與傳統(tǒng)獸藥殘留分析檢測方法相比，無需大量溶劑均質(zhì)、超聲、振蕩萃取以及濃縮等步驟，大大縮短了樣品前處理時間；共萃取出來的雜質(zhì)少，避免了后續(xù)一系列的凈化步驟；減少了有機溶劑用量，僅需用4毫升的有機溶劑。

3.本發(fā)明具有環(huán)境友好、簡單、快速、靈敏、穩(wěn)定、成本低，方便和可操作性強等特點，適用于動物肌肉組織中抗菌藥物的殘留確證和定量分析檢測，這將為獸藥殘留分析檢測研究提供新思路、新手段和技術(shù)支持。

附圖說明

圖1為空白雞肉樣品的mrm色譜圖。其中(a)為恩諾沙星；(b)為環(huán)丙沙星；(c)為沙拉沙星；(d)為磺胺間甲氧嘧啶；(e)為磺胺二甲嘧啶；(f)為替米考星；(g)為泰樂菌素；(h)為恩諾沙星-d5；(i)為環(huán)丙沙星-d8；(j)為磺胺間甲氧嘧啶-d4。

圖2為添加不同濃度和不同獸藥的雞肉樣品的mrm質(zhì)量色譜圖。其中，(a)為添加100μg/kg恩諾沙星；(b)為添加100μg/kg環(huán)丙沙星；(c)為添加20μg/kg沙拉沙星；(d)為添加100μg/kg磺胺間甲氧嘧啶；(e)為添加100μg/kg磺胺二甲嘧啶；(f)為添加100μg/kg替米考星；(g)為添加100μg/kg泰樂菌素；(h)為添加50μg/kg恩諾沙星-d5；(i)為添加50μg/kg環(huán)丙沙星-d8；(j)為添加50μg/kg磺胺間甲氧嘧啶-d4。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

在實施例中采用的儀器和藥品如下：

所述1200series高效液相色譜儀(美國agilent公司)；zorbaxsb-aq色譜柱，電噴霧-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，api4000ms/ms(美國appliedbiosystems公司)；電子分析天平bp121s型，感量為0.01g(德國sartorius公司)；電子分析天平92sm-202a型，感量為0.0001g(瑞士precisa公司)；冷凍高速離心機5804r型(德國eppendof公司)；超聲波清洗儀kq5200b型(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；微量移液器pipetman型(德國gillson公司)；微孔濾膜孔徑為0.22微米(天津市騰達過濾器件廠)；超純水制備系統(tǒng)f3pn33491型(美國millipore公司)。

所述色譜純乙腈、甲醇購自美國thermofisher公司，色譜純甲酸購自德國sigma-aldrich公司，分析純乙腈和乙酸購自廣州化學(xué)試劑廠。

所述標準品：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、替米考星和泰樂菌素均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，內(nèi)標物恩諾沙星-d5、環(huán)丙沙星-d8，磺胺間甲氧嘧啶-d4購買自加拿大torontoresearchchemicalsinc.公司，含量均大于97.7％。

所述健康雞購于廣東智威農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，體重1.3-1.8千克之間。

實施例1

1.標準工作液的配制：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、替米考星和泰樂菌素標準品用純甲醇配制成1g/l的標準儲備液，根據(jù)需要用純甲醇溶液稀釋成10和1mg/l的混合標準工作液，-20℃避光保存，有效期1個月。內(nèi)標化合物恩諾沙星-d5、環(huán)丙沙星-d8和磺胺間甲氧嘧啶-d4用純甲醇配成0.1g/l的儲備液，-20℃避光保存，有效期3個月。

2.色譜條件：采用zorbaxsb-aq色譜柱的內(nèi)徑為150mm×2.1mm，色譜柱的膜厚為3.5微米，柱溫為20～35℃，流速為0.15～0.3毫升/分鐘，進樣量為5～20微升。本實施中采用柱溫為30℃；流速為0.25ml/min；進樣量為5微升。流動相a為乙腈，b為0.1％甲酸水溶液；藥物梯度洗脫程序：0～3.0min，10～20％a，90～80％b；3～10min，20～90％a，80～10％b；10～12min，90～95％a，10～5％b；12～14min，95～10％a，5～90％b；14～20min，10％a，90％b。

3.質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離正離子(esi⁺)多反應(yīng)監(jiān)測模式(mrm)，電噴霧電壓(ionsprayvoltage，is)為4000～5500v，滯留時間(dwelltime)為20～100毫秒，霧化氣壓力(gs1)為55～65psi，輔助氣壓力(gs2)為50～60psi，氣簾氣壓力(curtaingas，cur)為20～35psi，離子源溫度為550～650℃。本實施中電噴霧電壓為5000v，滯留時間為50毫秒，霧化氣壓力為65psi，輔助氣壓力為60psi，氣簾氣壓力為25psi，離子源溫度為600℃。目標藥物和內(nèi)標物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1藥物和內(nèi)標化合物的質(zhì)譜參數(shù)和離子比

*第一個子離子為定量離子，第二個子離子為定性離子。

從表1中可知，每個目標分析物在純?nèi)軇┖碗u肉基質(zhì)匹配標準溶液中定性離子與定量離子的比率都在合理的范圍范圍內(nèi)，滿足殘留分析的要求。

實施例2

1.樣品的制備：試驗雞購回后，按常規(guī)適應(yīng)性地飼養(yǎng)1周，自由采食和飲水，投喂不含任何抗菌藥的全價飼料。隨機選出1只作為空白對照(1號雞)，其余的隨機平均分為2個試驗組，給藥時間、劑量和殺雞時間點見表2。

表2給藥劑量和殺雞時間

a：替米考星15mg/kg，磺胺二甲嘧啶50mg/kg，磺胺間甲氧嘧啶20mg/kg；

b：恩諾沙星8mg/kg，沙拉沙星8mg/kg；c：泰樂菌素700mg/kg。

2.樣品前處理：分別準確稱取2克(±0.01克)雞的肌肉組織于50毫升離心管中，加入恩諾沙星-d5、環(huán)丙沙星-d8和磺胺間甲氧嘧啶-d4的3種內(nèi)標物，靜置10分鐘，將樣品于-80℃冷凍6小時后取出，解凍至室溫。用4毫升1％乙酸乙腈溶液渦旋提取1分鐘，離心9000轉(zhuǎn)/分鐘、10分鐘，取出上清液至15毫升離心管中，用20％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)定容到8毫升。取1毫升上清液過膜至進樣瓶中，待lc-ms/ms檢測。

選擇agilentzorbaxsb-aqc18色譜柱。文獻中一般采用甲醇-0.1％甲酸水溶液和乙腈-0.1％甲酸水溶液作為流動相。因此，本發(fā)明對甲醇和乙腈作為流動相的有機相進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇的分離效果不如乙腈。最終選擇了乙腈-0.1％甲酸水溶液作為流動相。進一步優(yōu)化洗脫程序，在更短的時間內(nèi)獲得更好的分離度和峰形。

將目標物和內(nèi)標化合物的標準儲備液用色譜甲醇稀釋至1mg/l，然后用注射泵以10μl/min的速度直接注入質(zhì)譜儀，通過analyst1.5軟件對目標藥物的質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化。在esi正離子模式下藥物可以有效的離子化并且響應(yīng)值較高，因此選用esi⁺模式對分析物進行全掃描，獲得母離子質(zhì)量數(shù)(q1)，確定母離子后，進行其余質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，包括子離子質(zhì)量數(shù)、去簇電壓和碰撞能，優(yōu)化結(jié)果見表1。為了符合歐盟2002/657/ec決議對獸藥殘留質(zhì)譜確證分析的方法學(xué)要求(鑒定分≥4)，每個目標藥物分別選擇兩個子離子進行監(jiān)測，響應(yīng)值較強的子離子用于定量，另一個子離子用于定性，最大程度提高了檢測靈敏度。

3.樣品前處理條件的選擇和優(yōu)化：

雞肉成分復(fù)雜，含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)。本發(fā)明結(jié)合藥物的理化性質(zhì)和相關(guān)文獻報道，選擇1％乙酸乙腈作為提取溶劑。1％乙酸乙腈作為提取溶劑，不僅可以使蛋白質(zhì)變性，釋放與其結(jié)合的藥物，而且提取液澄清，回收率試驗符合殘留檢測的要求。

實驗還對不同用量(1、2、3、4、5和6毫升)的提取溶劑進行了評價。當(dāng)使用1毫升溶劑提取時，因體積太少，提取液雜質(zhì)相對較多，經(jīng)稀釋、離心后上清液仍渾濁，容易導(dǎo)致儀器系統(tǒng)堵塞，不能上機檢測。2、3和4毫升的1％乙酸乙腈溶液提取時，隨著提取溶劑量的增加，提取效率也在增加；但是當(dāng)提取溶劑用量超過4毫升時，藥物的提取效率無明顯增加，為節(jié)約成本，減少有機溶劑的用量，最終選擇4毫升1％乙酸乙腈作為提取溶劑用量。

為了得到更好的提取效率以及滿足儀器上樣要求，實驗還進一步對使用流動相稀釋定容到不同體積(8、12和16毫升)進行了優(yōu)化。當(dāng)定容到8和12毫升時，所有藥物的提取效率都無明顯差異，最終選擇定容到8毫升。

實施例3

選擇性是指在分析方法中分析物能夠區(qū)分和其他物質(zhì)之間的區(qū)別，本發(fā)明分析60份不同來源的雞肉樣品對該方法的選擇性進行驗證。圖1為空白雞肉樣品的mrm色譜圖。其中(a)為恩諾沙星；(b)為環(huán)丙沙星；(c)為沙拉沙星；(d)為磺胺間甲氧嘧啶；(e)為磺胺二甲嘧啶；(f)為替米考星；(g)為泰樂菌素；(h)為恩諾沙星-d5；(i)為環(huán)丙沙星-d8；(j)為磺胺間甲氧嘧啶-d4。圖2為添加不同濃度和不同獸藥的雞肉樣品的mrm質(zhì)量色譜圖。其中，(a)為添加100μg/kg恩諾沙星；(b)為添加100μg/kg環(huán)丙沙星；(c)為添加20μg/kg沙拉沙星；(d)為添加100μg/kg磺胺間甲氧嘧啶；(e)為添加100μg/kg磺胺二甲嘧啶；(f)為添加100μg/kg替米考星；(g)為添加100μg/kg泰樂菌素；(h)為添加50μg/kg恩諾沙星-d5；(i)為添加50μg/kg環(huán)丙沙星-d8；(j)為添加50μg/kg磺胺間甲氧嘧啶-d4。從圖1至圖2的比較可知，在7種分析物的保留時間±2.5％范圍內(nèi)，均無干擾峰出現(xiàn)在mrm色譜圖上，滿足歐盟2002/657/ec對定性的要求。

實施例4標準曲線和線性范圍

取900微升按照實施例2中樣品前處理方法處理的空白雞肉提取液與100微升適當(dāng)濃度的標準溶液，制得濃度在1.0～200.0μg/l(每個藥物八個濃度點)范圍內(nèi)的基質(zhì)匹配標準工作液，內(nèi)標濃度為12.5μg/l，然后上機檢測。線性范圍、線性方程與相關(guān)系數(shù)見表3。從表3中可知在試驗濃度范圍內(nèi)各分析物的基質(zhì)匹配標準曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.99，可以滿足各藥物殘留檢測分析的要求。

表3藥物基質(zhì)匹配標準曲線、線性范圍及相關(guān)系數(shù)(n＝3)

實施例5回收率和精密度

按照實施例2中樣品前處理方法進行回收率試驗，空白雞肉中添加目標分析物，計算各濃度添加水平的回收率和精密度見表4，從表4中可知，在50μg/kg，100μg/kg及200μg/kg(沙拉沙星添加水平為10μg/kg，20μg/kg和40μg/kg)三個濃度添加水平下，雞肉中藥物的平均回收率在73.7～106.1％之間，批內(nèi)和批間精密度分別在0.8～11.2％和3.3～10.8％之間。表明該方法具有較好的回收率和精密度，能夠滿足動物組織樣品中獸藥殘留檢測分析的要求。

表4樣品加標回收率、批內(nèi)和批間精密度

注：沙拉沙星的添加水平為10μg/kg，20μg/kg和40μg/kg。

實施例6檢測限和定量限

在空白雞肉中添加目標分析物，按照實施例2中樣品前處理方法進行試驗，分別以信噪比(s/n)為3和10時所對應(yīng)的樣品添加濃度為檢測限和定量限。結(jié)果見表5，所有藥物的檢測限和定量限分別在0.2～3.0μg/kg和0.5～8.0μg/kg范圍內(nèi)，表明該方法具有很高的靈敏度，能定量準確測定動物組織中痕量水平的抗菌藥物殘留。

表5藥物的檢測限、定量限和最大殘留限量(mrl)

^a代表恩諾沙星與環(huán)丙沙星的總量；

^b代表磺胺類藥物的總量

施例7動物實驗測定結(jié)果

根據(jù)實施例2中樣品的制備的雞肉試樣(2號和3號雞)，使用本發(fā)明方法分別測定雞肉樣品中7種獸藥殘留量，結(jié)果如表6所示。表6為給藥雞試樣肌肉組織藥物殘留測定結(jié)果(n＝6)。測得恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、替米考星和泰樂菌素等7種典型獸藥在5～450μg/kg殘留水平，2號和3號雞藥物含量在高、低水平下，但都獲得了良好的精密度，滿足殘留分析的相關(guān)規(guī)定要求。

表6給藥雞試樣肌肉組織藥物殘留測定結(jié)果(n＝6)

綜上所述，本發(fā)明基于低溫冷凍破碎細胞的原理建立了lc-ms/ms同時測定雞肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、替米考星和泰樂菌素等7種抗菌藥物的分析方法。在方法定量限到0.1mrl水平，7種抗菌藥的回收率均高于70％，精密度小于12％。該方法與傳統(tǒng)前處理方法相比具有前處理步驟少、所需時間短、消耗有機溶劑少、環(huán)保和低成本等優(yōu)點。此方法成功運用于不同來源雞肉樣品中抗菌藥物殘留檢測，恩諾沙星、磺胺二甲嘧啶、泰樂菌素和替米考星等抗菌藥有不同程度的檢出。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合和簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。