本發(fā)明涉及一種水果、蔬菜及其制品中葉綠素含量的測定方法,屬于食品檢測分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
在我國種植業(yè)中,水果和蔬菜僅次于糧油,分列第三位和第二位。水果、蔬菜及其制品與我國居民日常生活密不可分,是居民膳食不可或缺的重要組成部分。葉綠素是綠色植物光合作用的基礎(chǔ)物質(zhì),可反映植物的生長發(fā)育狀況、生理代謝變化以及營養(yǎng)狀況,因此,葉綠素含量常常用作研究植物生長發(fā)育的生理指標(biāo),對于富含葉綠素的水果、蔬菜及其制品尤其如此。在水果、蔬菜及其制品生產(chǎn)、加工、貿(mào)易、管理中往往均需對葉綠素含量進(jìn)行檢測和評價。
目前,國內(nèi)外已針對植物材料開展了大量研究,建立了分光光度法、熒光光譜法、高效液相色譜法、高校液相色譜質(zhì)譜法和反射光譜法等多種葉綠素含量測定方法。其中熒光光譜法和反射光譜法前處理比較復(fù)雜;而高效液相色譜法和高效液相色譜質(zhì)譜法的檢測過程中,葉綠素容易對儀器造成污染,不適合大批量樣品的檢測;分光光度法,是研究最為透徹的一種方法,該方法具有簡便、經(jīng)濟(jì)、實用等諸多優(yōu)點(diǎn),被廣泛認(rèn)可和使用;因此,本研究采用分光光度法對葉綠素含量進(jìn)行檢測。
葉綠素含量測定的分光光度法又有多種方法,例如丙酮法、乙醚法、乙酸乙酯、石油醚、二甲基亞砜法、二甲基酰胺法、無水乙醇法、丙酮乙醇水混合液法等,提取溶劑差異很大。并且,研究內(nèi)容大多是針對植物葉片中葉綠素含量的測定,涉及到水果和制品的研究鮮有報道。此外,我國制定的葉綠素含量測定的方法標(biāo)準(zhǔn)只有2個,gb/t22182-2008和ny/t1287-2007,均是針對油菜籽中葉綠素含量的測定,水果和蔬菜及制品中葉綠素含量測定方法標(biāo)準(zhǔn)在我國尚屬空白。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
為克服現(xiàn)有技術(shù)不足,本發(fā)明提供一種水果、蔬菜及其制品中葉綠素含量的測定方法,旨在為保障食品安全和質(zhì)量提供技術(shù)支持。
本發(fā)明技術(shù)方案如下:
一種水果、蔬菜及其制品中葉綠素含量的測定方法,包括制備供試樣品和比色法檢測。
所述制備供試樣品的方法包括:準(zhǔn)確稱取適量待測樣品于容器中,加入適量提取溶劑,封口密封后于室溫下避光提取,過濾,制得供試樣品;備用。
優(yōu)選地,將待測樣品切成細(xì)絲或勻漿后進(jìn)行提取。對于含水量較少的待測樣品(例如葡萄干),可以加入適當(dāng)比例(例如等重量)的蒸餾水后再進(jìn)行勻漿處理。
優(yōu)選地,采用丙酮/乙醇(v:v=1/1)的混合液作為提取溶劑。
優(yōu)選地,以g/ml計,待測樣品(或經(jīng)勻漿后制備的待測樣品)與提取溶劑的比例為0.5:100-300,例如0.5:100、0.5:150、0.5:200、0.5:250、0.5:300。
具體地,當(dāng)待測樣品為菠菜時,以g/ml計,待測樣品(或經(jīng)勻漿后制備的待測樣品)與提取溶劑的比例為0.5:100或0.5:200。
或者,以g/ml計,待測樣品(或經(jīng)勻漿后制備的待測樣品)與提取溶劑的比例為0.5:10-50,例如0.5:10、0.5:20、0.5:30、0.5:40、0.5:50。
具體地,當(dāng)待測樣品為黃瓜時,以g/ml計,待測樣品(或經(jīng)勻漿后制備的待測樣品)與提取溶劑的比例為0.5:10-30,例如0.5:10、0.5:20、0.5:30。
優(yōu)選地,所述提取時間為5-24h,例如5h、10h和24h;優(yōu)選為5h。
具體地,當(dāng)待測樣品為菠菜時,所述提取時間為5-24h,例如5h、10h和24h;優(yōu)選為5h。
具體地,當(dāng)待測樣品為黃瓜時,所述提取時間為5-10h,例如5h、10h;優(yōu)選為5h。
具體地,當(dāng)待測樣品為萵苣、綠茄子或韭菜花時,以g/ml計,待測樣品或經(jīng)勻漿后制備的待測樣品與提取溶劑的比例為2:10-30,優(yōu)選為2:10。
具體地,當(dāng)待測樣品為獼猴桃、青蘋果或葡萄干時,以g/ml計,待測樣品或經(jīng)勻漿后制備的待測樣品與提取溶劑的比例為5:10-30,優(yōu)選為5:10。
更具體地,所述制備供試樣品的方法包括:準(zhǔn)確稱取適量勻漿后的待測樣品于容器中,加入適量提取溶劑,封口密封后于室溫下避光提取5-10h,過濾,制得供試樣品;所述提取溶劑為丙酮/乙醇(v:v=1/1)的混合液;當(dāng)待測樣品為菠菜時,以g/ml計,經(jīng)勻漿后制備的待測樣品與提取溶劑的比例為0.5:100或0.5:200;當(dāng)待測樣品為黃瓜時,以g/ml計,經(jīng)勻漿后制備的待測樣品與提取溶劑的比例為0.5:10-30。
具體地,所述葉綠素包括葉綠素a和葉綠素b。
具體地,所述比色法檢測包括檢測供試樣品在663nm處和645nm處的吸光度值。
結(jié)果計算方法:
待測樣品中葉綠素a含量、葉綠素b含量和葉綠素總含量均以質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω表示,單位為毫克每克(mg/g),分別按公式(1)、(2)和(3)計算。
ω1=(12.72×a1-2.59×a2)×v/(1000×m)……………………(1)
ω2=(22.88×a2-4.67×a1)×v/(1000×m)……………………(2)
ω3=(8.05×a1+20.29×a2)×v/(1000×m)……………………(3)
式中:
ω1——葉綠素a含量;
ω2——葉綠素b含量;
ω3——葉綠素總含量;
a1——供試樣品在663nm處的吸光度值;
a2——供試樣品在645nm處的吸光度值;
v——供試樣品體積,單位為毫升(ml);
m——待測樣品質(zhì)量,單位為克(g)。
本發(fā)明所述水果、蔬菜及其制品包括菠菜、黃瓜、綠茄子、萵苣、獼猴桃、青蘋果、葡萄干和韭菜花等。
本發(fā)明對水果、蔬菜及制品中葉綠素含量的測定展開了研究,根據(jù)葉綠素含量的不同,分別從葉菜類、瓜果類、茄果類、根莖類蔬菜中選擇菠菜、黃瓜、綠茄子和萵苣4種蔬菜樣品,從漿果類和仁果類水果中選擇獼猴桃和青蘋果2種水果樣品,選擇韭菜花和葡萄干2種制品,共計8種樣品作為代表性試材,對提取溶劑、提取時間、提取體積和提取方式進(jìn)行了優(yōu)化,既能保證檢測工作簡便、高效、實用、經(jīng)濟(jì),又不至影響檢測人員身體健康,同時為果蔬中葉綠素含量測定方法標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)。
本發(fā)明方法對于待測樣品中葉綠素的提取率高,檢測方法結(jié)果準(zhǔn)確,操作簡單,分析周期短,可應(yīng)用于多種水果、蔬菜及其制品中葉綠素的檢測,具有較高地推廣應(yīng)用價值。
附圖說明
圖1表示實驗例中不同處理方式對菠菜葉片的提取效果;
圖2表示實驗例中6種提取溶劑對菠菜和黃瓜中葉綠素的提取效果;
圖3為實驗例中葉綠素標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者,按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件,或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者,均為可通過正規(guī)渠道商購買得到的常規(guī)產(chǎn)品。
以下所用儀器與試劑:
u-3900型紫外-可見分光光度計(日本hitachi公司);shz-b(a)型振蕩器(常州諾基儀器有限公司);分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);高速組織搗碎機(jī)(0-2000rpm,美國waring公司)。
葉綠素a(純度90%,10mg,日本和光純藥工業(yè)株式會社);葉綠素b(純度≥90%,5mg,美國sigma公司);丙酮、無水乙醇(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);實驗用水為蒸餾水。
實施例1
水果、蔬菜及其制品中葉綠素含量的測定方法,包括如下步驟:
1、制備供試樣品
1)深綠色樣品:以菠菜為例,準(zhǔn)確稱取0.5g勻漿試樣于三角瓶中,加入100ml提取劑,三角瓶用封口膜密封,充分搖勻,室溫下避光提取5h,過濾,制得供試樣品。
2)綠色樣品:以黃瓜為例,準(zhǔn)確稱取0.5g勻漿試樣于三角瓶中,加入10ml提取劑,三角瓶用封口膜密封,充分搖勻,室溫下避光提取5h,過濾,制得供試樣品。
3)淺綠色樣品:以萵苣、綠茄子、獼猴桃、青蘋果、葡萄干和韭菜花為例,其中,萵苣、綠茄子、韭菜花分別稱取2.0g勻漿試樣,獼猴桃、青蘋果、葡萄干分別稱取5.0g勻漿試樣于三角瓶中,加入10ml提取劑,三角瓶用封口膜密封,充分搖勻,室溫下避光提取5h,過濾,制得供試樣品。
以上所述提取溶劑為丙酮/乙醇(v:v=1/1)的混合液。
2、將以上供試樣品用紫外分光光度計檢測在663nm處和645nm處的吸光度值,以葉綠素包括葉綠素a和葉綠素b為標(biāo)準(zhǔn)品,按下式計算葉綠素總含量:
待測樣品中葉綠素a含量、葉綠素b含量和葉綠素總含量均以質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω表示,單位為毫克每克(mg/g),分別按公式(1)、(2)和(3)計算。
ω1=(12.72×a1-2.59×a2)×v/(1000×m)……………………(1)
ω2=(22.88×a2-4.67×a1)×v/(1000×m)……………………(2)
ω3=(8.05×a1+20.29×a2)×v/(1000×m)……………………(3)
式中:
ω1——葉綠素a含量;
ω2——葉綠素b含量;
ω3——葉綠素總含量;
a1——供試樣品在663nm處的吸光度值;
a2——供試樣品在645nm處的吸光度值;
v——供試樣品體積,單位為毫升(ml);
m——待測樣品質(zhì)量,單位為克(g)。
實際樣品的檢測結(jié)果
采用本方法對市售的黃瓜、綠茄子、萵苣、獼猴桃、青蘋果、葡萄干、韭菜花、菠菜(兩個品種樣品)共8種果蔬及其制品進(jìn)行了檢測,前7種樣品中葉綠素的含量分別為0.088mg/g,0.017mg/g,0.0087mg/g,0.029mg/g,0.011mg/g,0.019mg/g,0.062mg/g;品種1菠菜和品種2菠菜中葉綠素的含量分別為1.75mg/g和2.63mg/g。
實施例2
水果、蔬菜及其制品中葉綠素含量的測定方法,與實施例1的區(qū)別僅在于供試樣品的制備方法不同,具體如下:
1)深綠色樣品。以葉綠素含量較高的菠菜(同實施例1品種2)為例,準(zhǔn)確稱取0.5g勻漿試樣于三角瓶中,加入150ml提取劑,三角瓶用封口膜密封,充分搖勻,室溫下避光提取5h,過濾,制得供試樣品。
2)綠色樣品。以黃瓜為例,準(zhǔn)確稱取0.5g勻漿試樣于三角瓶中,加入10ml提取劑,三角瓶用封口膜密封,充分搖勻,室溫下避光提取24h,過濾,制得供試樣品。
以上所述提取溶劑為丙酮/乙醇(v:v=1/1)的混合液。
將以上供試樣品用紫外分光光度計按實施例相同的方法進(jìn)行檢測。
實際樣品的檢測結(jié)果
1.采用本方法對菠菜樣品進(jìn)行了檢測,其葉綠素的含量為2.41mg/g,較100ml提取溶劑的提取效果(2.63mg/g,即實施例1)差,且二者存在顯著性差異。
2.采用本方法對黃瓜進(jìn)行了檢測,其葉綠素的含量呈下降趨勢,為0.061mg/g,較避光提取5h后的效果(0.088mg/g,即實施例1)差,且二者存在顯著性差異。
對比例
水果、蔬菜及其制品中葉綠素含量的測定方法,與實施例1的區(qū)別僅在于供試樣品的制備方法不同,具體如下:
1)深綠色樣品。以菠菜為例,準(zhǔn)確稱取0.5g勻漿試樣于三角瓶中,加入100ml提取劑丙酮,三角瓶用封口膜密封,充分搖勻,室溫下避光提取5h,過濾,制得供試樣品。
2)綠色樣品。以黃瓜為例,準(zhǔn)確稱取0.5g勻漿試樣于三角瓶中,加入10ml提取劑丙酮,三角瓶用封口膜密封,充分搖勻,室溫下避光提取5h,過濾,制得供試樣品。
將以上供試樣品用紫外分光光度計按實施例相同的方法進(jìn)行檢測。
實際樣品的檢測結(jié)果
1.采用本方法對菠菜樣品進(jìn)行了檢測,其葉綠素含量為1.08mg/g,較實施例1提取溶劑的提取效果差,且二者存在顯著性差異。
2.采用本方法對黃瓜進(jìn)行了檢測,其葉綠素的含量呈下降趨勢,為0.043mg/g,較實施例1提取溶劑的提取效果差,且二者存在顯著性差異。
實驗例
一、實驗部分
(一)儀器與試劑
u-3900型紫外-可見分光光度計(日本hitachi公司);shz-b(a)型振蕩器(常州諾基儀器有限公司);分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);高速組織搗碎機(jī)(0-2000rpm,美國waring公司)。
葉綠素a(純度90%,10mg,日本和光純藥工業(yè)株式會社);葉綠素b(純度≥90%,5mg,美國sigma公司);丙酮、無水乙醇(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);實驗用水為蒸餾水。(二)樣品提取
1.深綠色樣品。以菠菜為例,準(zhǔn)確稱取0.5g試樣于三角瓶中,加入提取劑,三角瓶用封口膜密封,室溫下避光提取,過濾。
2.綠色樣品。以黃瓜為例,準(zhǔn)確稱取0.5g試樣于三角瓶中,步驟同1。
3.淺綠色樣品。以萵苣、綠茄子、獼猴桃、青蘋果、葡萄干和韭菜花為例,稱取2.0g~5.0g試樣于三角瓶中,步驟同1。
(三)結(jié)果計算
試樣中葉綠素a含量、葉綠素b含量和葉綠素總含量均以質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω表示,單位為毫克每克(mg/g),分別按公式(1)、(2)和(3)計算。
ω1=(12.72×a1-2.59×a2)×v/(1000×m)……………………(1)
ω2=(22.88×a2-4.67×a1)×v/(1000×m)……………………(2)
ω3=(8.05×a1+20.29×a2)×v/(1000×m)……………………(3)
式中:
ω1——葉綠素a含量;
ω2——葉綠素b含量;
ω3——葉綠素總含量;
a1——供試樣品在663nm處的吸光度值;
a2——供試樣品在645nm處的吸光度值;
v——供試樣品體積,單位為毫升(ml);
m——待測樣品質(zhì)量,單位為克(g)。
二、結(jié)果與討論
(一)樣品前處理方法的優(yōu)化
1.樣品處理方式的選擇。以葉綠素含量最高的菠菜為例,比較了2種處理方式對葉綠素含量的提取效果,第1種處理方式是將菠菜葉片切成細(xì)絲;第2種處理方式是將菠菜葉片切碎,置于高速組織搗碎機(jī)中勻漿。然后分別稱取相同質(zhì)量的樣品,加入相同體積的提取液進(jìn)行提取,結(jié)果見圖1。細(xì)絲狀菠菜葉片經(jīng)提取液提取后,大部分葉片已經(jīng)脫色,但葉脈部分仍有綠色殘留(圖1a);勻漿后的菠菜葉片經(jīng)提取后,殘渣已經(jīng)完全變?yōu)榘咨?圖1b),并且脫色迅速,因此,本實驗選擇采用高速組織搗碎機(jī)處理樣品,對于含水量較少的制品(葡萄干),需按1/1(w/v)的比例加入蒸餾水后進(jìn)行勻漿處理。
2.提取溶劑的選擇。提取葉綠素常用的溶劑一般為丙酮、乙醇、石油醚、乙酸乙酯或是幾者的混合液等,由于石油醚的毒性較高,乙酸乙酯具有刺激性氣味,且易燃易爆,所以選擇丙酮和乙醇為主要提取溶劑,設(shè)置了以下6個處理:丙酮、80%丙酮、乙醇、95%乙醇、丙酮/乙醇(v:v=1/1)、丙酮/乙醇/水(v:v=4.5/4.5/1),選擇其中葉綠素含量較高的2種代表性蔬菜菠菜和黃瓜為試驗對象,掃描測定葉綠素提取液在663nm處和645nm處吸光度值,結(jié)果如圖2所示。
對于菠菜(圖2a),6種提取溶劑中葉綠素的吸光度值由高到低依次為:丙酮/乙醇(v:v=1/1)>乙醇>丙酮/乙醇/水(v:v=4.5/4.5/1)>95%乙醇>丙酮>80%丙酮;對于黃瓜(圖2b),6種提取溶劑中葉綠素的吸光度值由高到低依次為:丙酮/乙醇(v:v=1/1)>80%丙酮>丙酮/乙醇/水(v:v=4.5/4.5/1)>乙醇>95%乙醇>丙酮。
根據(jù)公式ω3分別計算出6種提取溶劑中葉綠素的總含量,并進(jìn)行了方差分析,結(jié)果見表1。對于菠菜,經(jīng)丙酮/乙醇(v:v=1/1)提取的葉綠素含量最高,且與其他5個處理之間存在顯著性差異(p=0.05);對于黃瓜,雖然80%丙酮、丙酮/乙醇(v:v=1/1)以及丙酮/乙醇/水(v:v=4.5/4.5/1)3種提取劑的提取效果無顯著性差異,但為保證與其他試樣提取的統(tǒng)一性,本實驗最終選擇丙酮/乙醇(v:v=1/1)的混合液作為提取溶劑。
表16種提取溶劑對葉綠素含量的提取效果
注:同一行中的不同小寫字母表示差異顯著性,p=0.05,下同。
3.提取體積的優(yōu)化。同樣選擇菠菜和黃瓜為試驗對象,稱取0.5g勻漿樣品,分別設(shè)置5個提取體積,菠菜的提取體積分別為100ml、150ml、200ml、250ml和300ml,黃瓜的提取體積分別為10ml、20ml、30ml、40ml和50ml,靜置5h后檢測,結(jié)果如表2所示。
對于菠菜,提取體積為100ml時,葉綠素含量最高,但與200ml差別不大,與其他3個處理之間存在顯著性差異,考慮到經(jīng)濟(jì)成本,選擇100ml提取液進(jìn)行提取。
對于黃瓜,10ml和30ml的提取效果較好,二者與20ml之間差異不顯著,40ml和50ml的提取效果較差,且二者與其他3個處理間存在顯著性差異,考慮到經(jīng)濟(jì)成本,最終選擇10ml提取液進(jìn)行提取。
表2不同提取溶劑體積對葉綠素的提取效果
4.提取時間的優(yōu)化。以菠菜和黃瓜作為試驗對象,分別設(shè)置5h、10h和24h,靜置提取,結(jié)果見表3。對于2種試樣,提取時間為5h時葉綠素含量最高。對于菠菜3個處理間并無顯著性差異;對于黃瓜,5h和10h間無差異顯著性,二者與24h之間差異顯著,提取24h后,葉綠素含量反而下降,所以,本實驗選擇5h為最佳提取時間。
表3不同提取時間對葉綠素的提取效果
5.提取方式的選擇。以菠菜和黃瓜作為試驗對象,分別設(shè)置靜置提取和搖床振蕩提取2種提取方式,結(jié)果見表4。2種提取方式之間無顯著差異,考慮到經(jīng)濟(jì)成本,本實驗最終選擇靜置提取。
表4不同提取方式對葉綠素的提取效果
(二)方法的線性范圍
比色法測定樣品的含量,理論依據(jù)是朗伯-比耳定律,要得到準(zhǔn)確的測定結(jié)果,樣品測定濃度就必須在其線性范圍內(nèi)。以葉綠素a和葉綠素b為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),在0~0.030mg/g范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性(圖3),r2都在0.999以上,符合方法要求。
(三)方法的精密度和準(zhǔn)確度
從果蔬及其制品中選擇菠菜、黃瓜、綠茄子、萵苣、獼猴桃、青蘋果、葡萄干和韭菜花8種樣品為試材,分別對葉綠素a和葉綠素b進(jìn)行低、中和高3個水平的添加回收率試驗,每個處理取5個平行樣,結(jié)果見表5,葉綠素a的回收率為70.8%~109.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.2%~9.2%之間,葉綠素b的回收率為70.1%~109.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5%~9.9%之間,表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。
表58種試材中葉綠素a和葉綠素b的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差
(四)實際樣品的檢測
采用本方法對市售的菠菜、黃瓜、綠茄子、萵苣、獼猴桃、青蘋果、葡萄干和韭菜花8種果蔬及其制品進(jìn)行了檢測,8種樣品中葉綠素的含量分別為1.75mg/g,0.088mg/g,0.017mg/g,0.0087mg/g,0.029mg/g,0.011mg/g,0.019mg/g和0.062mg/g。
三、結(jié)論
本研究以8種果蔬(菠菜、黃瓜、萵苣、綠茄子、獼猴桃、青蘋果、葡萄干和韭菜花)為試材,建立了水果、蔬菜及其制品中葉綠素的檢測方法。根據(jù)樣品中葉綠素含量的不同,對提取方法進(jìn)行了優(yōu)化。精密度、準(zhǔn)確度等指標(biāo)考察結(jié)果表明,該方法操作簡單、快速,準(zhǔn)確度高,重現(xiàn)性好,適用于水果、蔬菜及其制品中葉綠素含量的測定。
雖然,上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述,但在本發(fā)明基礎(chǔ)上,可以對之作一些修改或改進(jìn),這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此,在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn),均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。