本發(fā)明涉及一種飛行時(shí)間質(zhì)譜直接測(cè)定藍(lán)藻細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù)，屬于蛋白質(zhì)組學(xué)和環(huán)境分析化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：藍(lán)藻作為原始而古老的藻類(lèi)原核生物，氣溫較高時(shí)尤其是夏季，在適宜的水文、氣象條件下易在富營(yíng)養(yǎng)化的湖泊、水庫(kù)以及河流中大量繁殖形成藍(lán)藻水華。而許多藍(lán)藻尤其是淡水藍(lán)藻中最常見(jiàn)的銅綠微囊藻會(huì)產(chǎn)生微囊藻毒素為代表的有毒次生代謝產(chǎn)物，對(duì)人畜的肝臟及皮膚產(chǎn)生極大傷害，嚴(yán)重危害水體環(huán)境以及人類(lèi)自身健康和生命安全。因此，對(duì)藍(lán)藻水華中優(yōu)勢(shì)種群銅綠微囊藻的鑒別尤為重要。目前對(duì)藍(lán)藻的鑒別技術(shù)主要有：浮游植物半定量活檢法，衛(wèi)星遙感技術(shù)以及16SrRNA基因序列方法等，此類(lèi)方法或耗時(shí)或耗力，需要具備豐富的專(zhuān)業(yè)知識(shí)以及復(fù)雜的前處理步驟，無(wú)法直接測(cè)定藍(lán)藻細(xì)胞且鑒別的精確性不足。因此，快速、簡(jiǎn)便、高精度地鑒別藍(lán)藻的需求迫在眉睫?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)是一種軟離子電離技術(shù)，且這一分析化學(xué)的手段在迅速、準(zhǔn)確識(shí)別其它微生物方面有成功應(yīng)用案例，但對(duì)藍(lán)藻的鑒別還未有適宜的方法，特別是前處理的步驟，基質(zhì)的選擇和蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法一直是研究的重點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種以核糖體蛋白質(zhì)為生物標(biāo)識(shí)物，快速、簡(jiǎn)便、直接地測(cè)定藍(lán)藻細(xì)胞并進(jìn)行分類(lèi)鑒別的飛行時(shí)間質(zhì)譜方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種利用飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別藍(lán)藻細(xì)胞的方法，包括如下步驟：(1)對(duì)待鑒別藍(lán)藻細(xì)胞樣品進(jìn)行前處理；(2)將步驟(1)處理后的樣品滴入樣品板上，再滴入基質(zhì)溶液，室內(nèi)風(fēng)干；(3)將步驟(2)得到的樣品板放入飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，以核糖體蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)識(shí)物，測(cè)定出的圖譜與所選擇的特征核糖體蛋白理論峰值進(jìn)行比對(duì)后實(shí)現(xiàn)對(duì)藍(lán)藻種類(lèi)的鑒別。步驟(1)中，所述的前處理，無(wú)需提純蛋白質(zhì)，只需破碎和離心即可獲得核糖體亞單位。步驟(1)中，所述的前處理具體過(guò)程為：將樣品進(jìn)行超聲波除泡，離心后去除上清液，取沉淀物離心后再取沉淀，所得沉淀加入TMA-1緩沖液混勻，移入裝有氧化鋯-二氧化硅微粒的細(xì)胞破碎專(zhuān)用離心管，置入細(xì)胞破碎儀進(jìn)行機(jī)械破碎；將機(jī)械破碎后的樣品低速離心后取上清液；上清液再經(jīng)高速離心后獲得核糖體亞單位沉淀物。其中，所述的TMA-1緩沖液為含10mMpH7.8Tris-HCl緩沖液，30mM的氯化銨，10mM的氯化鎂以及6mM的2-巰基乙醇。其中，所述的低速離心，離心條件為5800g，4℃，離心25分鐘；所述的高速離心，離心條件為64000g，4℃，離心4小時(shí)。步驟(2)中，將步驟(1)處理后的樣品加入混合液A混勻后，再取2μL滴于樣品板靶位上，再滴入1.5μL基質(zhì)溶液覆蓋，在空氣中自然風(fēng)干；所述的混合液A為含50％v/v乙腈和1％v/v三氟乙酸的水溶液；所述的基質(zhì)溶液為含10mg芥子酸，0.5mL混合液A和0.5mL蒸餾水的混合溶液。本發(fā)明的基質(zhì)溶液為測(cè)定結(jié)果中目標(biāo)峰值的離子強(qiáng)度最強(qiáng)的芥子酸(SA)，而非α氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)和2，5-二羥基苯甲酸(DHB)。步驟(3)中，所述的生物標(biāo)識(shí)物為13個(gè)核糖體蛋白質(zhì)，分別為L(zhǎng)32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20以及S14。這些生物標(biāo)識(shí)物的選定為測(cè)定的54株保存的藍(lán)藻藻株均存在的，而且在的多次重復(fù)測(cè)試中都可以檢測(cè)到的離子強(qiáng)度最強(qiáng)的13個(gè)核糖體蛋白質(zhì)。根據(jù)目前已公布的20株的銅綠微囊藻的全部或部分基因序列，得知在不同的株之間，某些核糖體蛋白質(zhì)的分子量是不同的，即如果能夠?qū)嶋H測(cè)定到這些不同，就可以把它們區(qū)別開(kāi)來(lái)。在我們的實(shí)際測(cè)量中，確實(shí)觀察到了同一個(gè)核糖體蛋白質(zhì)在不同的株之間的不同分子量，所以，據(jù)此方法，可以實(shí)現(xiàn)在株水平的鑒別(高于屬和種的水平)。步驟(3)中，所述的飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定儀為配備N(xiāo)2的激光脈沖儀的AximaCFRPlus型飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定儀，設(shè)定條件：m/z為2000-40000Da，氮?dú)饧す饷}沖儀λ為337nm，脈沖寬度3ns，頻率10Hz，平均不同位置發(fā)射500下激光脈沖，正線性模式。步驟(3)中，將所測(cè)圖譜選取范圍為m/z6000-12000Da，對(duì)實(shí)際檢測(cè)到的峰值，與13個(gè)特征核糖體蛋白L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20以及S14的理論峰值進(jìn)行比對(duì)后鑒別是否是銅綠微囊藻，同時(shí)確定具體株型。不同銅綠微囊藻具體株型的理論峰值可以檢索氨基酸序列：NationalCenterforBiotechnologyInformation(http：//www.ncbi.NLM.NIH.gov/)；可以計(jì)算等電點(diǎn)及理論分子量工具：BioinformaticsResourcePortal(http：//www.expasy.org/)查詢(xún)和計(jì)算得到。有益效果：本發(fā)明的利用飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別藍(lán)藻細(xì)胞的新方法是基于核糖體蛋白為生物標(biāo)識(shí)物提出的一種藍(lán)藻鑒定方法，有以下優(yōu)勢(shì)：1、本方法所確定的生物標(biāo)識(shí)物：L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20以及S14為所測(cè)定的54株保存的藍(lán)藻藻株多次重復(fù)測(cè)試中都測(cè)到的13個(gè)核糖體蛋白質(zhì)。且多個(gè)核糖體蛋白反映了分子進(jìn)化過(guò)程和親緣關(guān)系，與之前鑒別藍(lán)藻的技術(shù)方法相比，鑒別的精確度更高，可實(shí)現(xiàn)在藍(lán)藻株水平上的鑒別，并在分辨產(chǎn)毒素株/非產(chǎn)毒素株的精確鑒定上有一定突破。2、前處理中無(wú)需提純蛋白質(zhì)和16SrRNA基因序列方法包括的PCR擴(kuò)增，只需簡(jiǎn)單地離心加機(jī)械破碎即可獲得核糖體亞單位，與16SRNA基因序列等方法相比，前處理的步驟大大簡(jiǎn)化且更加快速。3、本方法選擇SA(芥子酸)為基質(zhì)與常用基質(zhì)CHCA(α-氰基-4-羥基肉桂酸)相比，獲得峰值的離子強(qiáng)度更強(qiáng)。4、本方法的新型蛋白質(zhì)原位結(jié)晶方法與通常的混合結(jié)晶方法相比，得到的質(zhì)譜圖中被檢測(cè)的特征核糖體蛋白質(zhì)的特征峰值信號(hào)更強(qiáng)和更穩(wěn)定。5、本方法可直接測(cè)定藍(lán)藻細(xì)胞，所需的樣品劑量需求小，操作簡(jiǎn)單，不易受樣品狀態(tài)與儀器的影響，結(jié)果準(zhǔn)確，降低了人力和時(shí)間成本，測(cè)定程序可以標(biāo)準(zhǔn)化，最終實(shí)現(xiàn)藍(lán)藻鑒別的在線、程序化操作。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例中樣品①的質(zhì)譜圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例中樣品②的質(zhì)譜圖；具體實(shí)施方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1：本實(shí)施例中，在2016年水華易爆發(fā)期5月30日的內(nèi)太湖梅園水廠外取水樣作為待測(cè)樣品，通過(guò)浮游植物網(wǎng)采集100mL水樣于塑料瓶中。將水樣移入15ml離心管中并編號(hào)①和②，為后續(xù)對(duì)比參照做準(zhǔn)備，將做好標(biāo)記的樣品進(jìn)行超聲波輕微除泡后，置入離心機(jī)在9100g，4℃下離心10分鐘。離心后去除上清液，用移液槍移出底部沉淀物至1.5mL離心管內(nèi)(離心管提前稱(chēng)量自重編號(hào)并記錄)在20400g，4℃下離心10分鐘，上一步操作后各樣品加入160μL的TMA-1緩沖液混勻，TMA-1緩沖液含10mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH7.8)，30mM的氯化銨，10mM的氯化鎂以及6mM的2-巰基乙醇，配置好的TMA-1緩沖液放置在冰箱4℃保存。將加入緩沖液后的樣品移入提前備好的含160mg氧化鋯-二氧化硅微粒的細(xì)胞破碎專(zhuān)用離心管，置入細(xì)胞破碎儀進(jìn)行機(jī)械破碎，在3000r/min下破碎兩次，每次45s，間隔30s。將機(jī)械破碎后樣品移入1.5mL離心管中在5800g，4℃下離心25分鐘后，用移液槍將上清液移入1.5mL離心管(專(zhuān)用)在64000g，4℃下高速離心4小時(shí)，該超高速離心機(jī)需提前打開(kāi)電源使溫度降至4℃后再放入待離心樣品。上述所有離心操作及機(jī)械破碎都需進(jìn)行配平，可使用緩沖液進(jìn)行配平。將樣品①經(jīng)過(guò)前處理步驟后去除上清液，留下沉淀物并加入10μL混合液A(含50％v/v乙腈和1％v/v三氟乙酸的水溶液)，使用移液槍頭擊打混勻，移取2μL該樣品和10μL基質(zhì)SA溶液(含10mgSA，0.5mL混合液A和0.5mL蒸餾水)混勻，吸取2uL混合樣品滴入專(zhuān)用樣品板靶位上(如不立即點(diǎn)樣，需將該樣品放入冰箱4℃保存)，注意溶液在通風(fēng)櫥配制，下滴液小心滴在靶點(diǎn)上，使其盡量不蔓延。將樣品②經(jīng)過(guò)前處理步驟后去除上清液，留下沉淀物并加入10μL混合液A(配方同上)，使用移液槍頭擊打混勻，吸取2μL該樣品滴入專(zhuān)用樣品板靶位上(如不立即點(diǎn)樣，需將該樣品放入冰箱4℃保存)，再滴入1.5μL基質(zhì)SA溶液覆蓋，注意使下滴液不蔓延，保持在靶位內(nèi)。將點(diǎn)樣后的樣品板放在空氣中室溫下自然風(fēng)干，置入日本島津公司AximaCFRPlus型MALDI-TOFMS儀中進(jìn)行測(cè)定。設(shè)定條件：m/z為2000-40000Da，氮?dú)饧す饷}沖儀λ為337nm，脈沖寬度3ns，頻率10Hz，正線性模式，注意檢測(cè)器氣壓需達(dá)到真空狀態(tài)才能進(jìn)行操作。將所測(cè)圖譜選取范圍為m/z6000-12000Da，依據(jù)13個(gè)特征核糖體蛋白L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20以及S14理論峰值進(jìn)行標(biāo)注，樣品①的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1，樣品②的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2，并進(jìn)行對(duì)比分析后鑒別藍(lán)藻種類(lèi)。13個(gè)特征核糖體蛋白的m/z理論值見(jiàn)表1，單位：Da。表1在本實(shí)施例中，樣品①選擇常用混合結(jié)晶方式，結(jié)合本發(fā)明方法的其它操作步驟后得出質(zhì)譜圖中檢測(cè)出的特征峰與誤差情況見(jiàn)表2，單位：Da。表2L32S21L33L35S18L29L31L28S16S19S15S20S145.970.87.2//6.9/7.5/11.37.6/樣品②使用本發(fā)明新型蛋白質(zhì)原位結(jié)晶方式得出的質(zhì)譜圖中檢測(cè)出特征峰與誤差情況見(jiàn)表3，單位：Da。表3L32S21L33L35S18L29L31L28S16S19S15S20S141.82.2-2.21.6-1.4/0.9/1.616.25.81.7/對(duì)特征峰的鑒定及誤差分析發(fā)現(xiàn)，采用常用混合結(jié)晶方式能夠識(shí)別出8個(gè)特征核糖體蛋白質(zhì)，而采用本發(fā)明的新型點(diǎn)樣方法能夠成功識(shí)別出10個(gè)特征核糖體蛋白質(zhì)，且誤差也大幅降低。比較這兩種方式的質(zhì)譜圖(附圖1和附圖2)，新型蛋白質(zhì)原位結(jié)晶方式下的圖譜信號(hào)也更強(qiáng)更加穩(wěn)定。以上結(jié)果表明，利用飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別藍(lán)藻細(xì)胞的新方法能夠成功鑒別實(shí)際湖泊中的藍(lán)藻樣品且在鑒別藍(lán)藻的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性上都比常用混合結(jié)晶方式更優(yōu)異。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3