本發(fā)明屬于化妝品、生物制品或藥品質(zhì)量控制技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種酵母抽提水的質(zhì)量控制方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

酵母是人類利用最早、應(yīng)用范圍最廣的微生物。酵母細胞是由約35％～50％的蛋白質(zhì)、5％～10％的核酸、35％～40％的碳水化合物、2.8％～3.0％的脂質(zhì)、3％～5％的水分和5.5％～6％的灰分組成，其中碳水化合物包含含有海藻糖、糖原、甘露聚糖、葡聚搪和木聚糖等。近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展，酵母的各種使用價值不斷被挖掘出來。酵母除了可以被利用來釀酒、制作面包等發(fā)酵食品、作為細胞蛋白資源用來緩解蛋白質(zhì)食品短缺、制作食品調(diào)味劑以及制作保健食品以外，酵母細胞在化妝品行業(yè)的開發(fā)與應(yīng)用正日益受到重視。通過幾十年的努力，研究者們尋求出了一種新的利用微生物生產(chǎn)發(fā)酵的方法。該方法具有生產(chǎn)效率高、不受季節(jié)和氣候條件的影響、生產(chǎn)的的原料來源廣泛等特點。但是，目前酵母發(fā)酵的開發(fā)與應(yīng)用主要是用于制作飼料、食品、保健食品及醫(yī)藥制品方面；對于酵母發(fā)酵技術(shù)用于化妝品行列在我國還處于初級階段，特別是從酵母菌體細胞中制備的酵母抽提水在化妝品中應(yīng)用的質(zhì)量控制及其方法還幾乎還是空白。如何快速、準確的控制化妝品用的一種酵母抽提水的質(zhì)量是目前需要解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種酵母抽提水的質(zhì)量控制方法。該方法能夠快速、準確的檢測出一種以化妝品用為主要目的的酵母抽提水中活性成分的含量，控制其產(chǎn)品的質(zhì)量。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述的酵母抽提水的質(zhì)量控制方法的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種酵母抽提水的質(zhì)量控制方法，是對酵母抽提水中的谷胱甘肽、總氮含量、氨基酸態(tài)氮的含量和氨基酸態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率、以及天冬氨酸和谷氨酸含量進行測定。

所述的酵母抽提水指的是用酵母為原料，在冷凍冰晶化低溫超微粉碎破壁后，或經(jīng)酶解自溶后，再經(jīng)分離提取后得到的產(chǎn)品；優(yōu)選為按申請?zhí)枮?01610210255.X、發(fā)明名稱為“一種酵母水及其制備方法與在化妝品中的應(yīng)用”的專利申請制備得到的酵母抽提水。該酵母抽提水富含氨基酸、小分子肽、多肽等酵母細胞中的可溶性成分。根據(jù)需要可添加適量輔料進行調(diào)配，也可在生產(chǎn)后期增加美拉德反應(yīng)工藝，該酵母抽提水屬于化妝品或生物醫(yī)藥用配料。

所述的酵母是化妝品用的酵母、食品用的酵母或生物醫(yī)藥用的酵母。

所述的酶解中的酶為酵母自身的酶或外加食品級酶。

所述的酵母抽提水的質(zhì)量控制方法，還包括對測定結(jié)果的判斷標準；該判斷標準如下：符合如下指標的酵母水提物為合格產(chǎn)品：谷胱甘肽的重量百分比含量≥0.08％、總氮的重量百分比含量≥1.5％、氨基酸態(tài)氮的重量百分比含量≥0.5％、氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率為25.0～55.0％、天冬氨酸的重量百分比含量≥0.2％且谷氨酸的重量百分比含量≤5.0％。

所述的谷胱甘肽優(yōu)選為通過HPLC方法測定，具體步驟優(yōu)選如下：

(1)供試品溶液的制備：取酵母抽提水樣品液，經(jīng)孔徑為0.2～0.48μm的微孔濾膜過濾，取過濾液作為供試品溶液，備用；

(2)對照品溶液的制備：取谷胱甘肽對照品30.73mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加入超純水將谷胱甘肽對照品溶解后再用超純水稀釋至刻度，搖勻；該對照品溶液每1mL含谷胱甘肽對照品3.073mg，即得到濃度為10mmol/L的谷胱甘肽對照品溶液，備用；

(3)系統(tǒng)適用性：用十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑，以體積比為96.3：3.7的三氟乙酸水溶液-乙腈為流動相，流速為每分鐘0.6mL；柱溫：25℃；蒸發(fā)光散射檢測器檢測；理論板數(shù)按酵母抽提水谷胱甘肽峰計算應(yīng)不低于1500；

其中三氟乙酸水溶液的制備：取三氟乙酸1mL，置1000mL的量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻；

蒸發(fā)光散射檢測器檢測的檢測參數(shù)：漂移管溫度：90℃；氮氣流速：1.5L/min；增益：1；模式：inpactor on；

(4)含量測定：分別精密吸取對照品溶液5μL、20μL，供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數(shù)方程計算，得到谷胱甘肽的含量。

所述的總氮含量優(yōu)選為通過凱氏定氮法測定，具體步驟優(yōu)選如下：

(A)樣品消化：稱取酵母抽提水樣品2g，精密稱定，小心轉(zhuǎn)移到已干燥的凱氏燒瓶中，加入混合催化劑2.5g，緩緩加入濃硫酸20mL，搖勻，小心加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱30min，得到消化液；其中混合催化劑為硒粉和硫酸鉀按質(zhì)量0.1:100的比例混合配制得到；濃硫酸是濃度為質(zhì)量百分比98％的硫酸；

(B)樣品蒸餾：待消化液冷卻后，緩緩加入水250mL，搖勻，冷卻，并加入小瓷片，小瓷片的作用是防止爆沸；連接凱氏燒瓶與蒸餾裝置，餾出管的尖端插人盛有25mL硼酸溶液和4滴溴甲酚綠混合指示液的錐形瓶中，餾出管尖端應(yīng)在液面之下；通過加液漏斗加入70mL氫氧化鈉溶液于凱氏燒瓶中，輕輕搖勻，使內(nèi)容物混勻，然后加熱蒸餾；待餾出液達到180mL時，停止蒸餾；其中，硼酸溶液的配制步驟如下：稱取硼酸3g，用水溶解，并定容至100mL，得到硼酸溶液；溴甲酚綠混合指示液的配制步驟如下：將1g/L溴甲酚綠乙醇溶液和1g/L甲基紅乙醇溶液按體積比10:4混合即得；氫氧化鈉溶液的配制步驟如下：稱取氫氧化鈉400g，溶于1L水中，靜置，吸取上層清液于帶橡皮塞的瓶內(nèi)即得；

(C)含量測定：用0.1mol/L鹽酸標準滴定溶液滴定餾出液，顏色由綠色消失轉(zhuǎn)變?yōu)榛壹t色即為終點，記錄消耗鹽酸標準滴定溶液的毫升數(shù)；按上述操作同時進行空白試驗；根據(jù)滴定測定結(jié)果計算總氮含量；其中，鹽酸標準滴定溶液按GB/T601配制與標定。

所述的氨基酸態(tài)氮的含量優(yōu)選為通過甲醛滴定法進行測定，具體步驟優(yōu)選如下：吸取酵母抽提水樣品溶液5.0mL于100mL燒杯中，加入55mL水，用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至pH＝8.20，并保持1min不變，此結(jié)果為游離酸度，不予計量體積；慢慢加入濃度為質(zhì)量百分比36％的甲醛溶液10mL，放置1min后，用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至pH＝9.20，記錄消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數(shù)；同時做空白試驗，記錄加入濃度為質(zhì)量百分比36％的甲醛溶液后，空白試驗所消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數(shù)；根據(jù)滴定測定結(jié)果計算氨基酸態(tài)氮的含量；其中，氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度為0.05mol/L，按GB/T601配制與標定。

所述的氨基酸態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率優(yōu)選為通過如下公式計算得到：

氨基酸態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率＝氨基酸態(tài)氮含量÷總氮含量×100％。

所述的天冬氨酸和谷氨酸的含量優(yōu)選為通過如下步驟測定得到：

1)標準溶液的制備：

天冬氨酸-谷氨酸標準儲備溶液：分別稱取天冬氨酸6.66mg、谷氨酸36.78mg于10mL的容量瓶，用鹽酸溶液溶解，并稀釋至刻度，得到標準儲備溶液，即該標準儲備溶液含天冬氨酸0.005mol/L、谷氨酸0.025mol/L；

天冬氨酸-谷氨酸標準使用溶液：吸取天冬氨酸、谷氨酸標準儲備液1mL，用鹽酸溶液稀釋至1000ml，得到標準使用溶液；每50μL標準使用溶液含有0.25nmol的天冬氨酸和1.25nmol的谷氨酸，相當于50μL該標準使用溶液含有天冬氨酸33.275ng和谷氨酸183.91ng；

其中鹽酸溶液的濃度為0.02mol/L，制備方法為：量取1.8mL濃度為質(zhì)量百分比37％的濃鹽酸，注入1000mL高純水中，搖勻即得；

2)樣品制備

稱取酵母抽提水樣品2g(精確至0.0001g)，加入40mL鹽酸溶液，充分攪拌溶解后，全部轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，并用鹽酸溶液稀釋至刻度；取上述溶液1.00mL，用鹽酸溶液稀釋至100mL，再用濾膜過濾；該溶液為樣品待測液；

其中鹽酸溶液濃度為0.02mol/L，制備方法為：量取1.8mL濃度為質(zhì)量百分比37％的濃鹽酸，注入1000mL高純水中，搖勻即得；

3)含量測定

分別取50μL的天冬氨酸-谷氨酸標準使用溶液和樣品待測液上機測定；使用離子交換氨基酸分析儀，樣品經(jīng)色譜注分離后與水合茚三酮試劑混合，通過記錄儀連續(xù)不斷地自動測量反應(yīng)產(chǎn)物570nm的吸光度；獲得的色譜圖，比較標準使用溶液和樣品待測液的保留時間來鑒別谷氨酸所產(chǎn)生的峰；記錄樣品中天冬氨酸、谷氨酸的峰面積、標準溶液中天冬氨酸、谷氨酸的峰面積，計算樣品中天冬氨酸、谷氨酸的含量。

所述的酵母抽提水的質(zhì)量控制方法在化妝品領(lǐng)域、食品領(lǐng)域或生物醫(yī)藥領(lǐng)域中進行應(yīng)用。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：本發(fā)明首次公開了一種用于化妝品的破壁酵母抽提水的質(zhì)量控制方法，能夠快速、準確的檢測出一種破壁酵母抽提水中活性成分的含量，控制其產(chǎn)品的質(zhì)量。具體如下：

(1)本發(fā)明提供了一種酵母抽提水的質(zhì)量控制方法，該方法能在較短時間內(nèi)快速準確的檢測一種酵母抽提水中活性成分、有關(guān)物質(zhì)的含量，控制其產(chǎn)品的質(zhì)量；

(2)該質(zhì)量控制方法中既有總體活性成分含量的控制，又有代表性活性成分含量的測定與限定；

(3)該控制方法中既有活性成分的含量測定與限定；也有有關(guān)物質(zhì)含量的測定與限定，確保了其產(chǎn)品的有效性與安全性。

附圖說明

圖1是谷胱甘肽標準品與酵母抽提水樣品的HPLC-ELSD色譜圖；其中，圖(A)為谷胱甘肽標準品，圖(B)為酵母抽提水樣品。

圖2是谷胱甘肽的標準工作曲線圖。

圖3是標準使用溶液中天冬氨酸和谷氨酸的色譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實驗例1HPLC-ELSD法測定酵母抽提水中谷胱甘肽的含量

1材料與方法

1.1儀器與試藥

儀器：Thermo U300高效液相色譜(廣州紫安科技有限公司)；Alltech 3300型蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD，廣州紫安科技有限公司)；

試藥：谷胱甘肽(GSH，中國藥品生物制品檢定所，純度≥99.4％)；乙腈(色譜純，國藥集團)；三氟乙酸(TFA，天津大茂)；酵母抽提水(批號161214、161228、170125，廣州嬌蘭化妝品有限公司生產(chǎn)，按按申請?zhí)枮?01610210255.X、發(fā)明名稱為“一種酵母水及其制備方法與在化妝品中的應(yīng)用”的專利申請的實施例1制備得到的酵母水B，其中復(fù)溶所用的水的用量相當于酵母菌體質(zhì)量10倍量)。

1.2系統(tǒng)適用性

用十八烷基硅烷鍵合硅膠做為填充劑，以體積比為96.3：3.7的三氟乙酸水溶液-乙腈為流動相，流速為每分鐘0.6ml；柱溫：25℃；蒸發(fā)光散射檢測器檢測；理論板數(shù)按酵母抽提水谷胱甘肽峰計算≥1500；

其中三氟乙酸水溶液的制備：取三氟乙酸1ml，置1000ml的量瓶中,加超純水稀釋至刻度，搖勻。

ELSD參數(shù)：蒸發(fā)光散射檢測器檢測；檢測參數(shù)：漂移管溫度：90℃；氮氣流速：1.5L/min；增益：1；模式：inpactor on。

1.3對照品儲備溶液的制備

取谷胱甘肽對照品約76.83mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加超純水使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，該對照品溶液每1ml含谷胱甘肽對照品3.073mg，即10mmol/L的谷胱甘肽對照品儲備溶液，備用；

1.4供試品溶液的制備

取酵母抽提水樣品液，經(jīng)孔徑為0.28μm的微孔濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液，備用；

2結(jié)果與討論

2.1線性關(guān)系

取谷胱甘肽對照品儲備溶液，分別精確吸取0.5、1.5、2.5、4.0、5.0mL，分別置5mL的量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻，分別得1.0、3.0、5.0、8.0、10.0mmol/L濃度的谷胱甘肽對照品溶液；取各對照品溶液20μL，注入液相色譜儀，測定并記錄色譜圖；谷胱甘肽對照品與酵母抽提水樣品的色譜圖見圖1；以進樣濃度的自然對數(shù)對峰面積的自然對數(shù)線性回歸，得標準工作曲線：lnA＝1.2208lnQ+13.053，R²＝0.9990。結(jié)果見表1與圖2。

結(jié)果表明谷胱甘肽在1.0～10.0mmol/L濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系；又因其標準工作曲線為不過原點的直線，故需用外標兩點法測定。

表1谷胱甘肽對照品線性測定數(shù)據(jù)

2.2精密度試驗

精確量取濃度為5.0mmol/L的谷胱甘肽對照品溶液20μl，重復(fù)連續(xù)進樣5次，測定谷胱甘肽的峰面積值，結(jié)果對照品色譜中谷胱甘肽的峰面積值的平均值為3381965.7，RSD為0.75％，小于2.0％，精密度良好。

2.3穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，在制備后分別在0、2、4、6、8、10、12小時進樣測定供試品中谷胱甘肽的峰面積值，每次進樣20μl，測得谷胱甘肽峰面積值的平均值為1927459.4；RSD為3.23％。結(jié)果表明本品供試品溶液在制備后12小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.4重現(xiàn)性試驗

同一批樣品(批號為161214)，精密稱定重量，共取5份，按“1.4供試品溶液的制備”項下方法處理并測定，測得供試品中谷胱甘肽含量的平均值為0.0893％；RSD為1.78％。結(jié)果表明，本法測定本品中的重現(xiàn)性良好。

2.5回收率測定

取已知含量的樣品(批號為161214)5份，每份分別精密加入谷胱甘肽對照品溶液，按樣品含量測定方法測定其谷胱甘肽的含量，計算谷胱甘肽的回收率。測得本品中谷胱甘肽的平均回收率為98.33％，RSD為2.01％。結(jié)果表明，本法測定本品中谷胱甘肽的回收率良好。

2.6樣品中谷胱甘肽的含量測定

按選定的方法，進樣供試品液20μl，測定供試品溶液中谷胱甘肽的峰面積值，外標法計算含量，得谷胱甘肽的含量，測得3批樣品的平均含量為0.0902％，結(jié)果見表2。三批酵母抽提水中谷胱甘肽平均含量為0.0902％。

表2樣品中谷胱甘肽的含量測定結(jié)果(n＝3)

實驗例2酵母抽提水中總氮含量的測定

1材料與方法

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器：JKXZ06-20B恒溫加熱消煮爐(常州諾基儀器有限公司)，KjeltecTM 8100凱氏定氮儀(德國，F(xiàn)OSS公司)，CP225D微量分析天平(德國，賽多利斯公司)，DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海和呈儀器制造有限公司)；滴定管:50mL。

1.1.2試藥：蒸餾水，硫酸鉀，硫酸銅，氯化銨，硼酸，甲基紅，溴甲酚綠，乙醇，鹽酸，氫氧化鈉，硫酸，碳酸鈉等試劑均為分析純。酵母抽提水為廣州嬌蘭化妝品有限公司生產(chǎn)。以下試劑均用不含氨的蒸餾水配制。

1.1.2.1濃硫酸：98％(w/w)。

1.1.2.2氫氧化鈉溶液(400g/L)：稱取氫氧化鈉400g，溶于1L水中，靜置，吸取上層清液于帶橡皮塞的瓶內(nèi)。

1.1.2.3硼酸溶液(30g/L)：稱取硼酸3g，用水溶解，并定容至100mL。

1.1.2.4混合催化劑：用硒粉、硫酸鉀按質(zhì)量比0.1:100的比例混合。

1.1.2.5鹽酸標準滴定溶液[c(HCl)＝0.1mol/L]，按GB/T601配制與標定。

1.1.2.6溴甲酚綠混合指示液：將溴甲酚綠乙醇溶液(1g/L)和甲基紅乙醇溶液(1g/L)按體積比10:4混合。

1.2方法

1.2.1測定流程

1.2.1.1消解：稱取酵母抽提水樣品約2g，精密稱定，小心轉(zhuǎn)移到已干燥的凱氏燒瓶中，加入混合催化劑2.5g，輕輕搖勻后緩緩加入濃硫酸20mL，在恒溫加熱消煮爐以300℃消解30min，使其完全炭化。再升高溫度到400℃繼續(xù)消化約60min，待液體呈藍綠色并澄清透明后，再繼續(xù)加熱30min。取出消解液，放冷備用。

1.2.1.2蒸餾：待消化液冷卻后，緩緩加入水250mL，搖勻，冷卻，并加入幾塊小瓷片。連接凱氏燒瓶與蒸餾裝置，餾出管的尖端插人盛有25mL硼酸溶液和含溴甲酚綠甲基紅混合指示劑的的錐形瓶中，餾出管尖端應(yīng)在液面之下。通過加液漏斗加入70mL氫氧化鈉溶液于凱氏燒瓶中，輕輕搖勻，使內(nèi)容物混勻，然后加熱蒸餾。待餾出液達到180mL時，停止蒸餾；蒸餾停止后用10ml水淋洗冷凝管外部尖端。

1.2.1.3滴定：接收液用鹽酸標準溶液(0.1000mol/L)進行滴定，結(jié)果用空白試驗校正。每個樣品重復(fù)測定兩次，以均值計算含量。

1.3重復(fù)性試驗：綜合消解、蒸餾、滴定，確定酵母抽提水含氮量的自動凱氏定氮儀測定條件。重復(fù)測定樣品5份。試驗結(jié)果見表3，方法重復(fù)性良好。

表3酵母抽提水含氮量測定重復(fù)性試驗考察

1.4回收率試驗:按上述的凱氏定氮測定條件，取161214批酵母抽提水5份，每份分別精密加入0.05g氯化銨進行回收率試驗。平均回收率為101.3％,RSD為1.97％。

2結(jié)果與討論

2.1樣品總氮含量測定結(jié)果

樣品中總氮含量測定結(jié)果見表4，三批酵母抽提水中總氮平均含量為1.65％。

表4酵母抽提水樣品中總氮的含量測定結(jié)果(n＝3)

2.2結(jié)論與討論

用凱氏定氮法檢測其酵母抽提水中總氮，按照本試驗建立的氮含量的凱氏定氮法測定條件，方法的重復(fù)性、精密度與回收率試驗結(jié)果良好。表明凱氏定氮法能夠用于酵母抽提水中總氮含量測定。通過酵母抽提水中總氮含量測定，將總氮量的控制與氨基酸態(tài)氮含量控制相結(jié)合，對酵母抽提水的整體質(zhì)量評價具有重要意義。

實施例3酵母抽提水中氨基酸態(tài)氮含量測定及氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率測定結(jié)果

1材料與方法

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器：CP225D微量分析天平(德國，賽多利斯公司)；S220PH計(上海，梅特勒-托利多儀器有限公司)；恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)；堿式滴定管；容量瓶；錐形瓶等。

1.1.2試藥：蒸餾水，氫氧化鈉，甲醛等試劑均為分析純。酵母抽提水為廣州嬌蘭化妝品有限公司生產(chǎn)。以下試劑均用不含氨的蒸餾水配制。

1.1.2.1氫氧化鈉標準滴定溶液[c(NaOH)＝0.05mol/L]：按GB/T 601配制與標定。

1.1.2.2甲醛溶液(36wt％)。

1.2方法

1.2.1測定流程

吸取酵母抽提水樣品溶液5.0mL于100mL燒杯中，加入55mL蒸餾水充分攪拌均勻，用0.05mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至pH＝8.20，并保持1min不變，此結(jié)果為游離酸度，不予計量體積。再準確加入36％甲醛溶液10mL，攪拌10min后，續(xù)用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至pH＝9.20，記錄消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數(shù)。同時做空白試驗，記錄加入36％甲醛溶液后，空白試驗所消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數(shù)。根據(jù)滴定測定結(jié)果計算氨基酸態(tài)氮含量，即得。

1.2.2精密度實驗

對同一生產(chǎn)批次161214批酵母抽提水樣品測定氨基酸態(tài)氮含量，平行5次測定考察方法的精密度，結(jié)果測得161214批酵母抽提水樣品中氨基酸態(tài)氮平均含量為0.75％，RSD為1.93％；方法的精密度良好。

1.2.3重復(fù)性實驗

對同一生產(chǎn)批次161214批酵母抽提水樣品測定氨基酸態(tài)氮含量，重復(fù)5次測定考察方法的重現(xiàn)性，結(jié)果測得161214批酵母抽提水樣品中氨基酸態(tài)氮平均含量為0.75％，RSD為2.33％；方法的重現(xiàn)性良好。

1.2.4回收率實驗

對對同一生產(chǎn)批次161214批酵母抽提水樣品，分別加入不同濃度的L-谷氨酸標準液，按照1.2.1方法操作，測定回收率，每個濃度平行3次檢測，結(jié)果測定的回收率在96.31％～100.89％之間，平均回收率為98.92％；表明本實驗準確度高，實驗方法可行、可靠。

2結(jié)果與討論

2.1樣品氨基酸態(tài)氮含量測定結(jié)果

樣品中氨基酸態(tài)氮含量測定結(jié)果見表5，三批酵母抽提水中氨基酸態(tài)氮平均含量為0.72％。

表5酵母抽提水樣品中氨基酸態(tài)氮的含量測定結(jié)果(n＝3)

2.2樣品氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率測定結(jié)果

樣品中氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率測定結(jié)果見表6，三批酵母抽提水中氨基酸態(tài)氮平均含量為43.46％。

表6酵母抽提水樣品中氨基酸態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率測定結(jié)果(n＝3)

2.3結(jié)論與討論

2.3.1用滴定法檢測其酵母抽提水中氨基酸態(tài)氮的方法具有較好的重復(fù)性，其精密度高，重現(xiàn)性好；可用于酵母抽提水中氨基酸態(tài)氮的含量檢測；

2.3.2通過滴定法檢測其酵母抽提水中氨基酸態(tài)氮含量與凱氏定氮法檢測其酵母抽提水中總氮含量的比值，可得出酵母抽提水樣品中氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率；

2.3.3通過酵母抽提水中總氮含量測定，將總氮量的控制與氨基酸態(tài)氮含量控制相結(jié)合，對酵母抽提水的整體質(zhì)量評價具有重要意義。

實驗例4酵母抽提水中天冬氨酸、谷氨酸的含量測定

1儀器與試藥

1.1儀器

日立L-8900型氨基酸自動分析儀(包括EZChrom Elite for Hitachi AAA色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、L-8900Tab分析系統(tǒng)狀態(tài)屏、珀爾帖柱溫箱、自動進樣系統(tǒng)、分光光度計，Hitachi公司)；CP225D電子天平(德國Sartorius公司)；Milli-Q超純水機(法國Millipore公司)。

1.2試藥

酵母抽提水(批號161214、161228、170125，廣州嬌蘭化妝品有限公司生產(chǎn))；谷氨酸(中國藥品生物制品檢定所，批號：140690-201401)；天冬氨酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：140691-201401)；H型氨基酸混合標準樣品(濃度2nmol/L，和光純藥工業(yè)株式會社)；特級茚三酮試劑反應(yīng)液(日本和光純藥工業(yè)株式會社)；L-8500PH-KIT緩沖液(三菱化學株式會社)；水為超純水，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1標準溶液制備

天冬氨酸-谷氨酸標準儲備溶液：分別稱取天冬氨酸6.66mg、谷氨酸36.78mg于10mL的容量瓶，用鹽酸溶液溶解，并稀釋至刻度。該溶液含天冬氨酸0.005mol/L、谷氨酸0.025mol/L。

天冬氨酸-谷氨酸標準使用溶液：吸取天冬氨酸-谷氨酸標準儲備液1ml，用鹽酸溶液稀釋至1000mL。每50μL該溶液含有0.25nmol的天冬氨酸和1.25nmol的谷氨酸，相當于50μL該溶液含有天冬氨酸33.275ng和谷氨酸183.91ng。

其中鹽酸溶液濃度為0.02mol/L，制備方法為：量取1.8mL濃鹽酸，注入1000mL的高純水中，搖勻即得。

2.2樣品溶液制備

稱取樣品2g(精確至0.0001g)，加入40mL鹽酸溶液，充分攪拌溶解后，全部轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，并用鹽酸溶液稀釋至刻度；取上述溶液1.00mL，用鹽酸溶液稀釋至100mL，再用濾膜過濾。該溶液為樣品待測液。

其中鹽酸溶液濃度為0.02mol/L，制備方法為：量取1.8ml濃鹽酸，注入1000ml的高純水中，搖勻即得。

2.3含量測定

取制備好的天冬氨酸-谷氨酸標準使用溶液和各樣品溶液各50μL，分別注入氨基酸分析儀進行測定，樣品經(jīng)色譜注分離后與水合茚三酮試劑混合。測定條件：HITACHI 2622SC-PH離子分離柱，色譜柱尺寸4.6mm ID×60mm，日立專用3μm磺酸型陽離子交換樹脂，柱溫57℃，反應(yīng)單元溫度135℃；泵Ⅰ(緩沖液)流速0.4mL/min，泵壓力0.3～25MPa，泵Ⅱ(反應(yīng)液)流速0.35mL/min，泵壓力0～0.2MPa；檢測波長：一通道570nm，二通道440nm；進樣體積50μL；分析時間：一通道32min，二通道10min；EZChrom EliteTM色譜處理系統(tǒng)分析軟件(Hitachi，2005)。分析方法的重復(fù)性變異系數(shù)小于0.5％。

獲得的色譜圖，比較標準使用溶液和樣品溶液的保留時間來鑒別谷氨酸所產(chǎn)生的峰。記錄樣品中天冬氨酸、谷氨酸的峰面積、標準使用溶液中天冬氨酸、谷氨酸的峰面積，計算樣品中天冬氨酸、谷氨酸的含量即得。

2.4結(jié)果分析

2.4.1標準樣品的氨基酸色譜圖

標準使用溶液的氨基酸圖譜見圖3。圖3是在一通道570nm檢測波長下，分析32min的出峰圖，按出峰順序的標樣依次為：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)。

2.4.2樣品中天冬氨酸、谷氨酸的含量

具體測定的酵母抽提水中天冬氨酸、谷氨酸的含量結(jié)果見表7。表7結(jié)果顯示，在3批樣品中，均檢測出天冬氨酸與谷氨酸，天冬氨酸(Asp)平均含量為0.27％、谷氨酸的平均含量為1.82％，變異系數(shù)0.76。

表7酵母抽提水樣品中天冬氨酸、谷氨酸的含量測定結(jié)果(n＝3)

2.5討論

用本質(zhì)量控制方法測定的三批酵母抽提水中天冬氨酸的重量百分比含量≥0.2％，谷氨酸的重量百分比含量≤5.0％。天冬氨酸可代表酵母抽提水中氨基酸的活性成分；谷氨酸即可代表酵母抽提水中氨基酸的活性成分，同時又被作為有關(guān)物質(zhì)限定成分，保證了酵母抽提水質(zhì)量控制的總體平衡。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。