本發(fā)明屬于熒光指示劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白基溶酶體熒光指示劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著生命科學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)已經(jīng)被人們所熟知。溶酶體是存在于細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的一種單層膜的囊狀細(xì)胞器，起到消化細(xì)胞內(nèi)無用異物的作用，其在細(xì)胞的活動中扮演者重要的作用，所以對于溶酶體的定位與追蹤，有著重要的意義。目前對于溶酶體的標(biāo)記，大多是利用抗體以及熒光染料，并且已經(jīng)達(dá)到商業(yè)化的程度，但是這些指示劑都有其不同的缺點，不容易改進(jìn)，例如抗體的價格昂貴，并且儲存條件苛刻，在使用過程中容易失活；而熒光染料大多是一些有機的小分子，這些分子對于細(xì)胞本身就有一定的毒性，而且多數(shù)染料水溶性不好，需要有機溶劑助溶，有機溶劑對于細(xì)胞的生長影響也較大，造成了熒光染料用于溶酶體指示劑的限制，并且由于溶酶體內(nèi)的低pH環(huán)境，這些分子的穩(wěn)定性也有很大程度的影響。所以設(shè)計并且合成具有良好的生物相容性，合成方法簡單，原料價格低廉等優(yōu)良性質(zhì)的新型的溶酶體指示劑勢在必行。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新型的蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB(BSA：牛血清白蛋白；BPB：溴酚藍(lán))及其應(yīng)用。該指示劑制備方法簡單，原料價格低廉，具有良好的水溶性和生物相容性。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所述的蛋白基溶酶體熒光指示劑，由如下步驟制備得到：

步驟1，分別配制0.1mmol/L的牛血清白蛋白水溶液和0.1mmol/L的溴酚藍(lán)水溶液；

步驟2，將牛血清白蛋白水溶液、溴酚藍(lán)水溶液和超純水按照10％:10～50％:40～80％的體積百分比混合均勻，得到混合溶液；其中，牛血清白蛋白水溶液、溴酚藍(lán)水溶液和超純水的體積百分比之和為100％；將所得混合溶液在100℃水浴條件下加熱2～10min，得到蛋白基溶酶體熒光指示劑膠體溶液。

本發(fā)明還提供了一種上述新型蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB在細(xì)胞溶酶體熒光標(biāo)記中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的新型蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB具有以下有益效果：

(1)合成方法簡單，原料成本低廉，可大量制備。

(2)此蛋白質(zhì)基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB水溶性好，在水中分散性好，不影響細(xì)胞的生長環(huán)境，適用于細(xì)胞溶酶體標(biāo)記(SEM照片中樣品可以看出分散性好，并且制樣的樣品是水溶液，也能間接說明其水溶性)。

(3)蛋白質(zhì)基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB對于細(xì)胞的毒性低，生物相容性好，適合應(yīng)用于細(xì)胞溶酶體標(biāo)記。(圖2與大腸桿菌毒性實驗可以證明)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1制備的蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB的掃描電子顯微鏡圖；從圖中可以看出，其分散性良好，尺寸在300nm左右。

圖2為本發(fā)明實施例1制備的的蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB相對于大腸桿菌的細(xì)胞毒性實驗的生長曲線圖；黑色為正常大腸桿菌(DH5菌)生長，灰色為在培養(yǎng)基中加入1mg/mL的蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB后大腸桿菌的生長，從圖中看，兩者生長趨勢相同，說明本發(fā)明實施例1制備的的蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB不影響大腸桿菌的生長。

圖3為本發(fā)明實施例1制備的蛋白基溶酶體指示劑BSA-BPB與商業(yè)的LysoGreen(溶酶體綠色熒光探針，KeyGEN BioTECH,Cat#:KGMP006-2)在Hela細(xì)胞中共定位的熒光共聚焦倒置顯微鏡的圖片。(Bright：明場，lysosome：商業(yè)的溶酶體探針，BSA-BPB：溶酶體熒光指示劑BSA-BPB，Merge：重疊圖像)，從圖中可以看出，蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB與商業(yè)的溶酶體綠色熒光探針發(fā)光的位置幾乎重疊，說明蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB具有作為溶酶體熒光探針的功能。

圖4為本發(fā)明實施例1制備的蛋白基溶酶體指示劑BSA-BPB與商用溶酶體指示劑的熒光定位與BPB的熒光定位進(jìn)行共定位分析后計算Pearson correlation coefficient的散點圖，兩者之間的Pearson correlation coefficient＝0.86，兩者顯著共定位，說明BPB的確是一個很好的溶酶體指示劑。

圖5為不同的溴酚藍(lán)比例制備蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB的熒光光譜，激發(fā)波長為540nm，在10～50％范圍內(nèi)(BSA為10％，相應(yīng)調(diào)整水的比例，保證總體系100％)，該圖表明，在上述原料配比情況下都可以制備出蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB。

圖6為制備蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB時，100℃加熱不同時間的熒光光譜，激發(fā)波長為540nm，在2～10min內(nèi)，都可以制備效果優(yōu)良的蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB。

具體實施方式

以下對本發(fā)明做進(jìn)一步說明：

一、蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB制備與應(yīng)用

實施例1：

步驟1，分別配制0.1mmol/L的牛血清白蛋白水溶液和0.1mmol/L的溴酚藍(lán)水溶液；

步驟2，將牛血清白蛋白水溶液、溴酚藍(lán)水溶液和超純水按照10％:10％:80％的體積百分比混合均勻，得到混合溶液，其中，牛血清白蛋白水溶液、溴酚藍(lán)水溶液和超純水的體積百分比之和為100％。將所述原料混合物溶液置于水浴中，100℃加熱2min(如圖6所示)，得到納米粒子膠體溶液，即蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB；

步驟3，蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB染色溶酶體的方法是在常規(guī)DMEM培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium的縮寫，改良版的伊格爾培養(yǎng)基)中定期培養(yǎng)(參考文獻(xiàn)：M.Wei,Y.Zhou,A.Sun,G.Ma,L.He,L.Zhou,S.Zhang,J.Liu,S.L.Zhang,D.L.Gill,Y.Wang,Pflugers Arch.2016,468,2061)接種在蓋玻片上的HeLa細(xì)胞，然后將上述細(xì)胞在含有1mg/mL蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時，將細(xì)胞(Hela細(xì)胞)生長在蓋玻片上，用HBSS(Hank's平衡鹽溶液)洗滌蓋玻片上的細(xì)胞兩次并將蓋玻片保持在HBSS中，激光共聚焦倒置顯微鏡下觀察。

實施例2：

步驟1，分別配制0.1mmol/L的牛血清白蛋白水溶液和0.1mmol/L的溴酚藍(lán)水溶液；

步驟2，將牛血清白蛋白水溶液、溴酚藍(lán)水溶液和超純水按照10％:50％:40％的體積百分比混合均勻，得到混合溶液，其中，牛血清白蛋白水溶液、溴酚藍(lán)水溶液和超純水的體積百分比之和為100％。將所述原料混合物溶液置于水浴中，100℃加熱10min(如圖6所示)，得到納米粒子膠體溶液，即蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB；

步驟3，蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB染色溶酶體的方法是在常規(guī)DMEM培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium的縮寫，改良版的伊格爾培養(yǎng)基)中定期培養(yǎng)(參考文獻(xiàn)：M.Wei,Y.Zhou,A.Sun,G.Ma,L.He,L.Zhou,S.Zhang,J.Liu,S.L.Zhang,D.L.Gill,Y.Wang,Pflugers Arch.2016,468,2061)接種在蓋玻片上的HeLa細(xì)胞，然后將上述細(xì)胞在含有1mg/mL蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時，將細(xì)胞(Hela細(xì)胞)生長在蓋玻片上，用HBSS(Hank's平衡鹽溶液)洗滌蓋玻片上的細(xì)胞兩次并將蓋玻片保持在HBSS中，激光共聚焦倒置顯微鏡下觀察。

實施例3：

改變實施例1步驟中的牛血清白蛋白水溶液、溴酚藍(lán)水溶液和超純水的體積比，或改變步驟2中水浴下的加熱時間，均可以制備得到蛋白基溶酶體熒光指示劑BSA-BPB。其結(jié)果見圖5、圖6。