本發(fā)明屬于化學(xué)檢測領(lǐng)域，尤其是一種ase-hplc法測定大青葉中靛玉紅含量的方法。
背景技術(shù)：
：《中國藥典》2015年版一部制備供試品方法：取本品細粉0.25g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷，浸泡15小時，加熱回流提取至提取液無色?；厥杖軇┲粮?，殘渣加甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。本發(fā)明對技術(shù)人員的專業(yè)水平要求較高，且回流時間較長。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述不足，本發(fā)明旨在提供一種ase-hplc法測定大青葉中靛玉紅含量的方法，該方法萃取時間短，重復(fù)性好，且檢測精度高。為了實現(xiàn)上述技術(shù)效果，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：一種ase-hplc法測定大青葉中靛玉紅含量的方法，依次包括下述步驟：步驟1：采用ase法用乙酸乙酯萃取大青葉粉末，并收集萃取液；步驟2：采用hplc法測定萃取液中靛玉紅的含量。優(yōu)選地，所述的步驟1依次包括下述子步驟：步驟s1：將大青葉樣品粉碎，過三號篩，取0.25g與0.3g硅藻土混合；步驟s2：將所得的混合物裝于放有濾膜的ase萃取池中，加硅藻土至與池口平行；步驟s3：用乙酸乙酯萃取，結(jié)束后，用甲醇將萃取液定容至50ml。優(yōu)選地，步驟s3所述的萃取步驟參數(shù)為：萃取溫度為90℃，萃取時間為5min，循環(huán)次數(shù)為2次，沖洗體積為60％，吹掃時間為60s。優(yōu)選地，步驟2所述的hplc法的檢測參數(shù)為：色譜柱為thermosyncronisc18；柱溫為40℃；流速為0.5ml/min；流動相為甲醇-水；檢測波長為289nm。優(yōu)選地，所述的色譜柱的規(guī)格為3μm，3×100mm。優(yōu)選地，所述的流動相為體積比等于75：25的甲醇-水。優(yōu)選地，步驟s2所述的ase萃取池的體積為5ml。本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，具有以下優(yōu)點：本發(fā)明考察了乙酸乙酯、正己烷、乙酸乙酯：正已烷(1:1)、甲醇，結(jié)果表示，甲醇和乙酸乙酯提取效率基本一致，但甲醇提取的雜質(zhì)峰較多，故本實驗采用乙酸乙酯為提取溶劑。本發(fā)明采用3因素3水平正交試驗考察了對提取效率影響較大的三個因素：萃取溫度、靜態(tài)萃取時間、循環(huán)次數(shù)，通過實驗結(jié)果，結(jié)合極差分析，終確定較佳ase參數(shù)為萃取溫度90℃，靜態(tài)萃取時間5min，循環(huán)次數(shù)2次。附圖說明圖1為以靛玉紅對照品圖2為靛玉紅對照品溶液的色譜圖；圖3為采用ase法萃取所得的供試品溶液的色譜圖；圖4為采用藥典方法提取所得的供試品溶液的色譜圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式，對本發(fā)明的權(quán)利要求做進一步說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護范圍內(nèi)所做的有限次修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護范圍內(nèi)。實施例11、儀器設(shè)備及試劑1.1儀器：電子分析天平(xa205du)、ase350快速溶劑萃取儀(美國dionex公司)、thermou3000uhplc液相色譜儀、安捷倫超高速液相色譜儀1.2試劑：試劑與溶液(除特別注明外，本實驗所用試劑均為分析純)水：符合gb/t6682規(guī)定的一級水；甲醇(ch4o)：色譜純(液相色譜用)。2、方法2.1對照品溶液的制備：取靛玉紅對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含2μg的溶液，即得。2.2供試品溶液的制備2.2.1《中國藥典》2015年版一部制備供試品方法：取本品細粉0.25g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷，浸泡15小時，加熱回流提取至提取液無色?；厥杖軇┲粮桑瑲堅蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至100ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。2.2.2快速溶劑萃取法(ase)制備供試品方法：樣品經(jīng)粉碎機粉碎，過三號篩，約0.25g，精密稱定，與0.3g硅藻土混合均勻，待用，移入到預(yù)先放好過濾膜的5ml萃取池中再加入適量硅藻土，輕輕振搖使之與池口在同一水平線上，擰緊萃取池上蓋。萃取結(jié)束后，把萃取液轉(zhuǎn)移于50ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液，即得。2.3ase萃取條件：萃取溶劑為乙酸乙酯，萃取溫度為90℃，萃取時間為5min，循環(huán)次數(shù)為2次，沖洗體積為60％，吹掃時間為60s。2.4色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗a)儀器：thermo雙三元液相(u-3000)、安捷倫1290超高速液相色譜儀；b)色譜柱：thermosyncronis(c183μm3×100mm)；c)柱溫：40℃；d)流速：0.5ml/min；e)流動相：：甲醇-水(75:25)；f)檢測波長：289nm；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；理論板數(shù)按靛玉紅峰計算應(yīng)不低于4000。2.5測定法照高效液相色譜法(通則0512)測定分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，即得。2.6標準限值要求本品按干燥品計算，含靛玉紅(c16h10n2o2)不得少于0.020％。27計算(外標法)式中cr——對照品溶液濃度，單位為微克每毫升(μg/ml)；ax——供試品的峰面積；ar——對照品峰面積。注意：使用前萃取池底部應(yīng)拆卸清理干凈，否則容易引起壓力不穩(wěn)；萃取池底部的濾紙應(yīng)在密封圈內(nèi)，否則引起滲漏；萃取池裝樣時松緊適中，太松容易導(dǎo)致提取液過多；開機前檢查氣瓶氣壓是否達到1mpa；使用結(jié)束后清理干凈，萃取池要及時晾干(容易生銹)。3、結(jié)果3.1線性關(guān)系取靛玉紅對照品溶液(濃度：0.00175mg/ml)，分別精密吸取該溶液0.5μl、1μl、2μl、3μl、5μl進入lc測定，并依照上述方法測定，結(jié)果詳見表1。以濃度(μg)-平均峰面積進行線性回歸，求得回歸方程：y＝12.841x-1.0345，r2＝1。靛玉紅在0.875～8.75ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，詳見圖1。表1線性實驗結(jié)果3.2重復(fù)性實驗取相同批號的樣品(批號：1509003)0.25g，共5份，精密稱定，按ase提取方法提取供試品溶液，進樣量為2μl，以上述的色譜條件平行試驗，測得樣品中靛玉紅的含量見表2，rsd為1.7％，結(jié)果表明ase提取方法重復(fù)性良好。表2重復(fù)性實現(xiàn)結(jié)果3.3精密度試驗取靛玉紅對照品溶液(0.00175mg/ml)，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，峰面積rsd為1.5％，表明儀器精密度良好。其中，圖2為靛玉紅對照品溶液的色譜圖；圖3為采用ase法萃取所得的供試品溶液的色譜圖；圖4為采用藥典方法提取所得的供試品溶液的色譜圖3.4樣品不同儀器提取結(jié)果及與藥典方法結(jié)果比較(3批)表3不同儀器提取結(jié)果比較表4ase與藥典提取結(jié)果比較4、討論：4.1ase提取溶劑的選擇：《中國藥典》采用氯仿提取大青葉中靛玉紅，氯仿毒性大，而靛玉紅的理化性質(zhì)為溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、乙醚，不溶于水，微溶于乙醇，本實驗考察了乙酸乙酯、正己烷、乙酸乙酯：正已烷(1:1)、甲醇，結(jié)果如表5，甲醇和乙酸乙酯提取效率基本一致，但甲醇提取的雜質(zhì)峰較多，故本實驗采用乙酸乙酯為提取溶劑。表5提取溶劑考察結(jié)果提取溶劑測定含量(％)甲醇0.118乙酸乙酯0.111正己烷0.097正己烷：乙酸乙酯(1:1)0.0854.2ase提取條件的優(yōu)化本實驗采用3因素3水平正交試驗考察了對提取效率影響較大的三個因素：萃取溫度、靜態(tài)萃取時間、循環(huán)次數(shù)，通過試驗結(jié)果，確定較優(yōu)的ase參數(shù)，見表6、表7。表6因素水平設(shè)計表表7正交實驗極差分析結(jié)果由極差分析可以看出，靜態(tài)萃取時間對靛玉紅的提取效率影響最大，其次是萃取溫度和循環(huán)次數(shù)。最終確定較佳ase參數(shù)為萃取溫度90℃，靜態(tài)萃取時間5min，循環(huán)次數(shù)2次。以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。當前第1頁12