本發(fā)明涉及一種基于適配體識別和過氧化物模擬酶可視化檢測沙門氏菌的方法，屬于食品安全檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

沙門氏菌是一種腸道桿菌致病菌，在自然界中廣泛存在，特別容易污染水源、食品及畜產(chǎn)品。食用了感染沙門氏菌的食物會引發(fā)突發(fā)性食物中毒，出現(xiàn)傷寒、急性腸胃炎、菌血癥和敗血癥等癥狀，對于人類和動物的健康均構(gòu)成極大危害。各國政府機構(gòu)普遍提出該致病菌的限量要求，我國規(guī)定在乳制品、肉制品、水產(chǎn)制品、即食蛋制品等11類食品中沙門氏菌不得被檢出。因此建立一種快速、準確、便捷的沙門氏菌檢測方法，對于保障食品安全具有重要意義。

傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法主要包括傳統(tǒng)的平板計數(shù)法、分子生物學(xué)法、免疫學(xué)方法等。平板計數(shù)法因其檢驗程序較繁瑣，耗時長，難以滿足現(xiàn)場快速檢測的需要。分子生物學(xué)技術(shù)，雖然能縮短檢驗時間，但前期需要提取細菌總dna，且靈敏度仍然不高；免疫學(xué)方法如酶聯(lián)免疫吸附分析法具有特異性強、靈敏度高、易于肉眼觀察等優(yōu)點，可應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測。然而其識別分子-抗體，制備成本高，周期長，且穩(wěn)定性不佳；其信號分子-辣根過氧化酶(hrp)，屬天然酶，活性高但穩(wěn)定性欠佳，易受環(huán)境因素的影響，從而限制了酶聯(lián)免疫檢測的發(fā)展。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服上述不足之處，以適配體作為識別分子，以納米模擬酶催化底物顯色，將適配體和納米生物技術(shù)及可視化檢測等諸多技術(shù)的優(yōu)勢強強聯(lián)合，建立一種簡單快捷而又具有極高靈敏度和特異性的沙門氏菌檢測方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案，一種基于適配體識別和過氧化物模擬酶可視化檢測沙門氏菌的方法，將生物素化適配體固定于包被有親和素的微孔板中作為捕獲探針，同時制備鐵酸鋅/還原氧化石墨烯過氧化物模擬酶，并將另一條沙門氏菌的適配體固定于鐵酸鋅/還原氧化石墨烯表面作為信號探針，當加入沙門氏菌時，捕獲探針和信號探針中的適配體均與沙門氏菌發(fā)生特異性結(jié)合，形成(微孔板)適配體-沙門氏菌-適配體/鐵酸鋅/還原氧化石墨烯的三明治夾心結(jié)構(gòu)，最后加入顯色底物tmb-h2o2，鐵酸鋅/還原氧化石墨烯復(fù)合納米材料可以作為過氧化物模擬酶，催化h2o2氧化tmb發(fā)生顯色反應(yīng)，從而實現(xiàn)對食品中沙門氏菌的檢測。具體檢測原理如圖1所示。本方法靈敏度高、特異性強、操作方便，在食品安全檢測領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。

實現(xiàn)本發(fā)明的具體方法：

一種基于適配體識別和過氧化物模擬酶可視化檢測沙門氏菌的方法，包括以下步驟：

1)捕獲探針的制備：100μl，20(μg/ml)的親和素于微孔板中4℃包被過夜；倒出，每孔加入200μlpbs(10mm，ph7.4)洗板3次，每次1min；接著加入200μl生物素化的適配體1(200nm)于37℃孵育1h；倒出，每孔加入200μlpbs(10mm，ph7.4)洗板3次，每次1min；最后加入200μl1％的bsa于37℃孵育1h封閉孔板；倒出，每孔加入200μlpbs(10mm，ph7.4)洗板3次，每次1min，以防后續(xù)實驗步驟中產(chǎn)生非特異性吸附。

2)信號探針的制備：

a.過氧化物模擬酶-鐵酸鋅/還原氧化石墨烯復(fù)合納米材料的制備

取0.6g石墨粉加入80ml濃硫酸與濃磷酸的混合溶液中(體積比為9:1)，溫度調(diào)節(jié)為50℃，分多次緩慢加入3.6gkmno4，連續(xù)攪拌12h后，緩慢加入80ml冰水，待溫度稍降后，逐滴加入3ml30％的h2o2，得到金黃色懸濁液，攪拌30min。靜置2h后，棄去上層清液，下層懸濁液以3000rpm離心分離10min，下層沉淀物分別用鹽酸(10％)和無水乙醇洗3次，并用超純水多次洗滌至上清液ph近中性為止。產(chǎn)物于60℃烘干12h，制備得到氧化石墨烯。接著稱取20mg制備好的氧化石墨烯溶于60ml乙醇中并超聲分散2h，同時稱取149mgzn(no3)2·6h2o和404mgfe(no3)3·9h2o溶解于20ml無水乙醇中，室溫下磁力攪拌30min。逐滴向氧化石墨稀分散液中滴入zn(no3)2.6h2o和fe(no3)3.9h2o的乙醇溶液，繼續(xù)攪拌30min。用6m的naoh水溶液調(diào)節(jié)混合溶液ph至10，繼續(xù)攪拌30min。將混合液轉(zhuǎn)入100ml高壓反應(yīng)釜中180℃反應(yīng)12h，冷卻至室溫后，棄去上清液，所得黑色固體產(chǎn)物用去離子水洗5次，于50℃烘箱中干燥備用，即制備得到鐵酸鋅/還原氧化石墨烯復(fù)合納米材料。

b.適配體修飾的鐵酸鋅/還原氧化石墨烯復(fù)合物的制備

稱取1mg上述制備所得鐵酸鋅/還原氧化石墨烯復(fù)合納米材料分散于1mlpbs(10mm，ph7.4)緩沖液中，取10μl適配體2(100μm)加入到上述分散液中于室溫下緩慢振搖1h，通過磁分離將上清液中未結(jié)合的適配體2去除，沉淀即為信號探針—鐵酸鋅/還原氧化石墨烯-適配體2復(fù)合物，將其分散于1mlpbs(10mm，ph7.4)備用。

3)沙門氏菌的可視化檢測：取100μl不同濃度的沙門氏菌加入包被有捕獲探針的微孔板中于37℃孵育1h，溶液倒出并用100μlpbs(10mm，ph7.4)緩沖液清洗板孔3次，去除未結(jié)合的沙門氏菌；接著每孔加入100μl鐵酸鋅/還原氧化石墨烯-適配體2(100μg/ml)于37℃孵育1h，溶液倒出并用100μlpbs(10mm，ph7.4)緩沖液清洗板孔3次，去除未結(jié)合的鐵酸鋅/還原氧化石墨烯-適配體2；最后加入200μltmb-h2o2溶液和100μl乙酸鈉(ph3.5)于室溫下反應(yīng)20min，記錄不同沙門氏菌濃度下鐵酸鋅/還原氧化石墨烯催化氧化tmb產(chǎn)生的吸光值(652nm)，建立吸光值與沙門氏菌濃度間的線性關(guān)系，從而實現(xiàn)對沙門氏菌的檢測。然后進行拉曼光譜檢測。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1.本發(fā)明方法以適配體作為識別元件，相比于免疫分析法中使用抗體作為識別元件，適配體穩(wěn)定性好，制備成本低，易于標記且標記后不影響其活性，同時對目標菌體具有高度親和力和高度選擇性，在很大程度上提高了檢測的準確性。

2.本發(fā)明方法以鐵酸鋅/還原氧化石墨烯過氧化物模擬酶催化底物tmb-h2o2顯色，相比于hrp，該納米模擬酶具有與hrp相媲美的催化活性，同時穩(wěn)定性好、成本低、且本身具有的磁性特性簡化實驗操作，在很大程度上提高了檢測的靈敏度和便捷性。

3.本發(fā)明方法提供的檢測方法與現(xiàn)有沙門氏菌的檢測方法相比，具有靈敏度高的特點，其檢測限可達到11cfu/ml，且可視化檢測易于肉眼觀察，適應(yīng)現(xiàn)場檢測的需要。

附圖說明

圖1基于適配體識別和過氧化物模擬酶可視化檢測沙門氏菌的示意圖

圖2鐵酸鋅/還原氧化石墨烯復(fù)合納米材料的透射電子顯微鏡圖

圖3相對吸光值與沙門氏菌濃度的線性關(guān)系圖

圖4本發(fā)明方法和平板計數(shù)法檢測沙門氏菌的相關(guān)性圖

具體實施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實施例1.沙門氏菌濃度-吸光值標準曲線的繪制

1)捕獲探針的制備：100μl，20(μg/ml)的親和素于微孔板中4℃包被過夜；倒出，每孔加入200μlpbs(10mm，ph7.4)洗板3次，每次1min；接著加入200μl生物素化的適配體1(200nm)于37℃孵育1h；倒出，每孔加入200μlpbs(10mm，ph7.4)洗板3次，每次1min；最后加入200μl1％的bsa于37℃孵育1h封閉孔板；倒出，每孔加入200μlpbs(10mm，ph7.4)洗板3次，每次1min，以防后續(xù)實驗步驟中產(chǎn)生非特異性吸附。

2)信號探針的制備：

a.過氧化物模擬酶-鐵酸鋅/還原氧化石墨烯復(fù)合納米材料的制備

取0.6g石墨粉加入80ml濃硫酸與濃磷酸的混合溶液中(體積比為9:1)，溫度調(diào)節(jié)為50℃，分多次緩慢加入3.6gkmno4，連續(xù)攪拌12h后，緩慢加入80ml冰水，待溫度稍降后，逐滴加入3ml30％的h2o2，得到金黃色懸濁液，攪拌30min。靜置2h后，棄去上層清液，下層懸濁液以3000rpm離心分離10min，下層沉淀物分別用鹽酸(10％)和無水乙醇洗3次，并用超純水多次洗滌至上清液ph近中性為止。產(chǎn)物于60℃烘干12h，制備得到氧化石墨烯。接著稱取20mg制備好的氧化石墨烯溶于60ml乙醇中并超聲分散2h，同時稱取149mgzn(no3)2·6h2o和404mgfe(no3)3·9h2o溶解于20ml無水乙醇中，室溫下磁力攪拌30min。逐滴向氧化石墨稀分散液中滴入zn(no3)2.6h2o和fe(no3)3.9h2o的乙醇溶液，繼續(xù)攪拌30min。用6m的naoh水溶液調(diào)節(jié)混合溶液ph至10，繼續(xù)攪拌30min。將混合液轉(zhuǎn)入100ml高壓反應(yīng)釜中180℃反應(yīng)12h，冷卻至室溫后，棄去上清液，所得黑色固體產(chǎn)物用去離子水洗5次，于50℃烘箱中干燥備用，即制備得到鐵酸鋅/還原氧化石墨烯復(fù)合納米材料。

b.適配體修飾的鐵酸鋅/還原氧化石墨烯復(fù)合物的制備

稱取1mg上述制備所得鐵酸鋅/還原氧化石墨烯復(fù)合納米材料分散于1mlpbs(10mm，ph7.4)緩沖液中，取10μl適配體2(100μm)加入到上述分散液中于室溫下緩慢振搖1h，通過磁分離將上清液中未結(jié)合的適配體2去除，沉淀即為信號探針—鐵酸鋅/還原氧化石墨烯-適配體2復(fù)合物，將其分散于1mlpbs(10mm，ph7.4)備用。

3)緩沖液中沙門氏菌的檢測

以平板計數(shù)法得到濃度為1.10×10⁷cfu/ml的副溶血性弧菌菌液，再將該菌液梯度稀釋至1.10×10⁶cfu/ml，1.10×10⁵cfu/ml，1.10×10⁴cfu/ml，1.10×10³cfu/ml，1.10×10²cfu/ml，1.10×10cfu/ml；取100μl不同濃度的沙門氏菌加入包被有捕獲探針的微孔板中于37℃孵育1h，溶液倒出并用100μlpbs(10mm，ph7.4)緩沖液清洗板孔3次，去除未結(jié)合的沙門氏菌；接著每孔加入100μl鐵酸鋅/還原氧化石墨烯-適配體2(100μg/ml)于37℃孵育1h，溶液倒出并用100μlpbs(10mm，ph7.4)緩沖液清洗板孔3次，去除未結(jié)合的鐵酸鋅/還原氧化石墨烯-適配體2；最后加入200μltmb-h2o2溶液和100μl乙酸鈉(ph3.5)于室溫下反應(yīng)20min，記錄不同沙門氏菌濃度下鐵酸鋅/還原氧化石墨烯催化氧化tmb產(chǎn)生的吸光值(652nm)，建立吸光值與沙門氏菌濃度間的線性關(guān)系，隨著沙門氏菌濃度的增加，吸光值也相應(yīng)增高。以652nm處吸光值為為定量特征值，圖3所示為沙門氏菌線性曲線圖。沙門氏菌在1.10×10²～1.10×10⁶cfu/ml濃度范圍內(nèi)，與652nm處相對吸光值呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y＝0.0683x+0.0826(r²＝0.995)，最低檢出限為11cfu/ml。

實施例2.牛奶樣品中沙門氏菌的檢測

5ml牛奶樣品于10℃，7000rpm離心10min，去除上層乳脂肪，下層溶液用0.45μm膜過濾，得到的清液為實際樣品，配制不同濃度的沙門氏菌加入待測溶液中，獲得含沙門氏菌的牛奶樣品。按照實施例1中緩沖液中沙門氏菌檢測的步驟對牛奶中人工添加的沙門氏菌進行檢測。結(jié)果如圖4所示，用本發(fā)明構(gòu)建的可視化方法檢測牛奶中沙門氏菌的結(jié)果與平板計數(shù)法得到的沙門氏菌結(jié)果無顯著差異，表明該發(fā)明方法對沙門氏菌的檢測具有較強的應(yīng)用價值。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬于本發(fā)明的涵蓋范圍。

序列表

〈110〉江南大學(xué)

〈120〉一種基于適配體識別和過氧化物模擬酶可視化檢測沙門氏菌的方法

〈130〉

〈160〉1

〈170〉patentinversion3.5

〈210〉1

〈211〉40

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉1

agtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga40

〈210〉2

〈211〉40

〈212〉dna

〈213〉人工序列

〈400〉2

aaaaaaaaaaaaagtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga52