本發(fā)明涉及一種測定理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，尤其是一種快速溶劑萃取聯(lián)合quechers凈化法測定理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，屬于化學(xué)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：通宣理肺丸是由紫蘇葉、前胡、桔梗、苦杏仁、麻黃、甘草、陳皮、半夏等十一味中藥材組方制成的丸劑，味微甜、略苦，具有解表散寒,宣肺止嗽的功能，用于風(fēng)寒束表、肺氣不宣的感冒咳嗽，癥見發(fā)熱、惡寒、鼻塞流涕、頭痛、無汗、肢體酸痛。其中麻黃具有發(fā)汗散寒、宣肺平喘、利水消腫的作用,用于風(fēng)寒感冒、胸悶喘咳、風(fēng)水浮腫，其主要有效成分為鹽酸麻黃堿。中國藥典2015年版一部規(guī)定通宣理肺丸中含量測定的成分為鹽酸麻黃堿?？焖偃軇┹腿?ase)是指在密閉容器內(nèi)于高溫(50～200℃)和高壓(500～3000psi)條件下，在短時間內(nèi)，用有機(jī)溶劑提取固體或半固體樣品的一種新型樣品前處理方法。與超聲、微波、回流、超臨界萃取等成熟方法相比，ase有萃取溶劑用量少、提取時間短、萃取效率高、操作簡單方便、安全和自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)。國外已有學(xué)者將這項技術(shù)應(yīng)用于植物藥定量和定性分析中樣品的前處理，但在中成藥有效成分的定量和定性分析中作為樣品的前處理方法應(yīng)用較少，用于通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿提取的研究未見報道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種節(jié)約提取時間，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的快速溶劑萃取聯(lián)合quechers凈化法測定理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的：一種快速溶劑萃取聯(lián)合quechers凈化法測定理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，依次包括下述步驟：1)對照品儲備液的制備精密稱定鹽酸麻黃堿對照品19.77mg，用鹽酸甲醇溶液定容至50ml量瓶中，制成0.3942mg·ml-1的對照品儲備液2)準(zhǔn)確稱取樣品1g置于10ml萃取池中，用正己烷對樣品進(jìn)行除酯提取溫度為80℃，靜態(tài)提取時間為5min，提取次數(shù)為1次，沖洗體積100％)后以甲醇為提取溶劑，提取溫度為80℃，靜態(tài)提取時間為8min，提取次數(shù)為3次。提取完成后將提取液定容至25ml，吸取1.5ml于裝有300mgpsa的2ml離心管中，漩渦2min，離心力25700×g離心3min，取上清液進(jìn)行高效液相分析。進(jìn)一步的，上述的一種快速溶劑萃取聯(lián)合quechers凈化法測定理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，所述的色譜條件為：分析柱aceexcel2c18-pfp流速0.5ml·min-1，柱溫35℃，檢測波長210nm，進(jìn)樣量為1μl；流動相a為乙腈，流動相b為0.1％磷酸溶液；梯度洗脫程序：0～3.5min，2％a、98％b；3.5～4min，2％～90％a、98％～10％b；4～7min，90％a、10％b；在2％a、98％b下平衡2min。進(jìn)一步的，上述的一種快速溶劑萃取聯(lián)合quechers凈化法測定理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，所述的除酯條件是提取溫度為80℃，靜態(tài)提取時間為5min，提取次數(shù)為1次，沖洗體積100％。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)勢：本發(fā)明提供的技術(shù)方案ase法極大限度地節(jié)省了提取時間，由原來的48h以上，縮短為40min，且省略了繁瑣的萃取凈化步驟及揮干的過程，減少了鹽酸麻黃堿在提取和后處理中的降解及損失，保證結(jié)果的可靠性。快速溶劑萃取法(ase)提取通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿可行，適用于通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的提取。附圖說明圖1是對照品hplc色譜圖；圖2是供試品hplc色譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的權(quán)利要求書做進(jìn)一步說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何對本發(fā)明做有限次修改可得的技術(shù)方案仍然屬于本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。實(shí)施例11儀器與試藥ase350快速溶劑萃取儀(美國thermofisher公司)；ultimate3000dglc，dad檢測器，二元梯度泵，自動進(jìn)樣器(美國thermofisher公司)；xa205du電子天平(瑞士梅特勒公司)；3k15高速離心機(jī)(德國sigma)；classicuvf超純水器(英國elga)。鹽酸麻黃堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：171241-201007)；乙腈(色譜純，德國merck公司)，其余試劑均為分析純；通宣理肺丸(大蜜丸，由廣西梧州三鶴藥業(yè)有限公司，批號：140201、140803、140850、150901、150702)。2方法與結(jié)果2.1鹽酸麻黃堿的測定2.1.1色譜條件分析柱aceexcel2c18-pfp(2.1mm×75mm，2μm)，流速0.5ml·min-1，柱溫35℃，檢測波長210nm，進(jìn)樣量為1μl。流動相a為乙腈，流動相b為0.1％磷酸溶液；梯度洗脫程序：0～3.5min，2％a、98％b；3.5～4min，2％～90％a、98％～10％b；4～7min，90％a、10％b；在2％a、98％b下平衡2min。見圖1。2.1.2對照品儲備液的制備精密稱定鹽酸麻黃堿對照品19.77mg，用鹽酸甲醇溶液(1→1000)定容至50ml量瓶中，制成0.3942mg·ml-1的對照品儲備液。2.1.3供試品溶液制備2.1.3.1快速溶劑萃取法準(zhǔn)確稱取樣品1g置于10ml萃取池中，用正己烷對樣品進(jìn)行除酯(提取溫度為80℃，靜態(tài)提取時間為5min，提取次數(shù)為1次，沖洗體積100％)后以甲醇為提取溶劑，提取溫度為80℃，靜態(tài)提取時間為8min，提取次數(shù)為3次。提取完成后將提取液定容至25ml，吸取1.5ml于裝有300mgpsa的2ml離心管中，漩渦2min，離心力25700×g離心3min，取上清液進(jìn)行高效液相分析。2.1.3.2索氏提取法準(zhǔn)確稱取樣品2g，加硅藻土2g，研磨均勻。置索氏提取器中，加濃氨試液3ml、乙醇10ml與乙醚適量，置水浴上加熱回流至提取液無色，放冷，將乙醚提取液移至蒸發(fā)皿中，濾紙和容器用少量乙醚洗滌，洗液并入蒸發(fā)皿中，揮干，殘渣用鹽酸甲醇溶液(1→1000)溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加鹽酸甲醇溶液(1→1000)至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液進(jìn)行超高效液相分析。2.1.4線性關(guān)系試驗精密吸取0.3942mg·ml-1的對照品儲備液1ml，用鹽酸甲醇溶液(1→1000)定容至25ml量瓶中，制成0.0158mg·ml-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。進(jìn)樣量分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.2μl，平行測定2次，以峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x，mg·ml-1)進(jìn)行線性回歸，線性方程為：y＝4184.2x+0.3465，r＝0.9999。表明在0.00315～0.0189mg·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.1.5精密度試驗取0.0158mg·ml-1的對照品儲備液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果鹽酸麻黃堿峰面積的rsd為2.7％(n＝6)，說明儀器精密度良好。2.1.6穩(wěn)定性試驗取同一供試品(批號：150702)，按“2.1.3.1”方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別在0，4，8，12，16，20，24h測定，記錄峰面積，結(jié)果鹽酸麻黃堿峰面積的rsd為3.5％(n＝7)，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.1.7方法重復(fù)性和回收率試驗準(zhǔn)確稱取通宣理肺丸(批號：150702)1g共6份，再準(zhǔn)確稱取通宣理肺丸(批號：150702)0.5g共6份，精確加入鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3ml(含鹽酸麻黃堿0.11826mg)，按“2.1.3.1”方法進(jìn)行提取及檢測。結(jié)果重復(fù)性rsd為3.0％(n＝6)，加標(biāo)回收率范圍為92％～102％，rsd為4.2％(n＝6)，由于加標(biāo)方式為將對照液加入裝有樣品的小燒杯中，混勻，與硅藻土充分分散后再裝入萃取池中，整個轉(zhuǎn)移過程可能對加入量有一定的損失。2.2快速溶劑萃取(ase)方法優(yōu)選2.2.1單因素考察取批號為150702作為考察樣品，考察提取溶劑、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)等因素對通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿提取效率的影響。以鹽酸麻黃堿含量為評價指標(biāo)。2.2.1.1提取溶劑和取樣量的選擇準(zhǔn)確稱取通宣理肺丸樣品2g，分別用正丁醇、乙酸乙酯、氨水-正丁醇、氨水-乙酸乙酯、氨水-乙醇-乙酸乙酯(3:10:90)、1.44％磷酸、堿性甲醇(ph8～9)、甲醇作為提取溶劑，在100℃下萃取5min，萃取3次，考察不同提取溶劑對鹽酸麻黃堿提取效果的影響。結(jié)果顯示，磷酸或堿性甲醇提取效率較高，但基質(zhì)影響較大；氨水-乙醇-乙酸乙酯(3:10:90)條件下提取效率較高且基質(zhì)影響較小，但考慮酸、堿溶劑對ase儀器的影響，故選擇甲醇作為提取溶劑。由于使用使用的10ml萃取池溶劑沖洗體積有限，2g樣品提取不充分，因此選擇取樣量為1g。2.2.1.2提取溫度的選擇準(zhǔn)確稱取通宣理肺丸樣品1g，用甲醇作為提取溶劑，在80℃、100℃、120℃下分別提取3次，每次8min，考察不同提取溫度對鹽酸麻黃堿提取效果的影響。結(jié)果80℃、100℃、120℃下ase方法所得到的提取率較藥典提取方法偏低，可能鹽酸麻黃堿受熱易降解，考慮降低溫度以提高提取效率。由于甲醇的沸點(diǎn)約為64℃，結(jié)合ase的高壓穿透性，故選擇70℃、80℃和90℃對提取方法進(jìn)行摸索，考察提取溫度對通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的提取效率影響。準(zhǔn)確稱取通宣理肺丸1g，用甲醇作為提取溶劑，在70℃、80℃和90℃下分別提取3次，每次8min，考察不同提取溫度對鹽酸麻黃堿提取效果的影響。結(jié)果見表1。表1不同提取溫度對鹽酸麻黃堿的提取效果表1可見，溫度對提取效率的影響較大。在考慮鹽酸麻黃堿的提取效率時，應(yīng)充分考慮其高溫降解的影響及其所使用溶劑的熔沸點(diǎn)。根據(jù)選擇的提取溶劑甲醇可確定溫度在80℃左右，進(jìn)一步優(yōu)化提取溫度與提取時間、循環(huán)次數(shù)、雜質(zhì)凈化等因素，尋求最佳方案。2.2.2ase提取正交試驗結(jié)果根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，確定甲醇為提取溶劑，采用l9(34)正交試驗，以提取溫度(a，℃)、提取時間(b，min)和提取次數(shù)(c，次)這3個因素對通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿提取含量的影響，每個因素三個水平，進(jìn)行ase法提取通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的條件優(yōu)化。正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。表2l9(34)正交試驗表及結(jié)果分析表3方差分析由正交試驗結(jié)果可知，影響通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿ase提取效果的各因素主次順序為：c(提取次數(shù))>b(提取時間)>a(提取溫度)，得到最佳提取條件為：a2b2c2，即稱樣量為1g，甲醇作為提取溶劑，提取溫度為80℃，提取時間為8min，提取次數(shù)3次。2.3ase法與藥典方法比較分別取通宣理肺丸5個批次樣品，每個批次分別取3份，按“2.1.3.1”項下ase方法進(jìn)行儀器1和儀器2的處理；取通宣理肺丸5個批次樣品，每個批次分別取2份，按”2.1.3.2”項下藥典方法處理，分別進(jìn)液相進(jìn)行分析。結(jié)果如表4。表4不同儀器驗證及ase法與藥典方法的平均含量(單位：mg/丸，n＝3)批號ase法(儀器1)ase法(儀器2)藥典方法1402011.901.861.901408031.841.811.771408502.022.011.701509011.901.951.841507021.341.311.39兩臺ase儀器得到的通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿含量rsd均少于5％，表明方法的重復(fù)性好。由以上5批樣的結(jié)果分析可見，藥典方法由于受到環(huán)境溫度，回流速率、時間，加液體積，包裝緊密等多種因素的影響，同批樣品同一時間提取，差異性較大，重現(xiàn)性較差。采用優(yōu)化后的ase法提取通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿，結(jié)果重復(fù)性較好，提取較完全，與藥典方法的rsd在5％以內(nèi),數(shù)據(jù)分別為1.1％、0.9％、0.3％、1.3％、1.2％,，0.6％、1.6％、4.3％、2.3％、2.4％可控性強(qiáng)。3討論3.1液相色譜條件的選擇中國藥典2015年版一部中使用0.02mol·l-1磷酸二氫鉀(含0.2％三乙胺，磷酸調(diào)節(jié)ph至2.7)作為水相流動相，考慮到使用緩沖鹽以及調(diào)節(jié)流動相酸度的不便，嘗試用0.1％磷酸作為水相流動相，分別采用phenomenexsynergipolar-rp80a(250mm×4.6mm，4μm)、agilentzorbaxsbc18(250mm×4.6mm，5μm)、thermoaccucorec18(2.1mm×50mm，2.6μm)、aceexcel2c18-pfp(2.1mm×75mm，2μm)進(jìn)行實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)aceexcel2c18-pfp(2.1mm×75mm，2μm)分離效果最好、色譜峰形理想，故選用aceexcel2c18-pfp(2.1mm×75mm，2μm)為分析柱。3.2雜質(zhì)凈化方法由于樣品通宣理肺丸為大蜜丸，在中國藥典中鹽酸麻黃堿[1]使用了氨化乙醚進(jìn)行提取，同時去除了糖類等雜質(zhì)的干擾，若以甲醇作為快速溶劑萃取方法的提取溶劑，處方中極性小的酯類成分以及丸劑中糖類雜質(zhì)溶出較多，基質(zhì)對鹽酸麻黃堿液相分析干擾較大，需要前處理去掉相應(yīng)的雜質(zhì)干擾。3.2.1小極性雜質(zhì)凈化方法考察由于乙醚不能適用于ase法，嘗試用正己烷對樣品進(jìn)行預(yù)處理，提取溫度為80℃，靜態(tài)提取時間為5min，提取次數(shù)為1次，沖洗體積100％，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分小極性脂類物質(zhì)被去除，且鹽酸麻黃堿在此條件下沒有損失。3.2.2糖類雜質(zhì)凈化方法考察嘗試在萃取池底部填充一定量的凈化材料，如硅膠、中性氧化鋁、堿性氧化鋁、c18、psa(n-丙基乙二胺)等，在提取的過程中直接凈化樣品。結(jié)果發(fā)現(xiàn)硅膠、c18凈化效果較差，中性氧化鋁、堿性氧化鋁的凈化效果較好，隨著氧化鋁的增加，凈化效果越好，但中性氧化鋁和堿性氧化鋁對目標(biāo)化合物對鹽酸麻黃堿有一定吸附作用，損失率約為15％～18％。psa(n-丙基乙二胺)吸附糖類物質(zhì)效果較好，且基本沒有損失，但考慮到在萃取池中直接加psa的量較大，成本較高，故改用quechers凈化方法。即對ase萃取液定容至25ml后，吸取1.5ml于裝有一定量psa的2ml離心管中，漩渦2min，離心力25700×g離心3min，取上清液進(jìn)行高效液相分析。3.2.3凈化量考察分別吸取1.5mlase萃取液置于裝有50，100，200，300，400，500mgpsa的2ml凈化管中，漩渦2min，15000r·min-1離心3min后取上清液進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)300mgpsa凈化效果最好，故確定psa的凈化量為300mg。總而言之，優(yōu)化后的ase法極大限度地節(jié)省了提取時間，由原來的48h以上，縮短為40min，且省略了繁瑣的萃取凈化步驟及揮干的過程，減少了鹽酸麻黃堿在提取和后處理中的降解及損失，保證結(jié)果的可靠性?？焖偃軇┹腿》?ase)提取通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿可行，適用于通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的提取。以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12