本發(fā)明涉及分析檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種同時(shí)檢測(cè)血清中五種類固醇激素的方法。
背景技術(shù)：
：睪酮是一種類固醇荷爾蒙，由男性的睪丸或女性的卵巢分泌，腎上腺亦分泌少量，但絕經(jīng)后婦女，卵巢分泌睪酮顯著減少。睪酮分子量為288.42g/mol，結(jié)構(gòu)式如下。大多數(shù)睪酮與性激素結(jié)合球蛋白(shbg)結(jié)合，少數(shù)與白蛋白結(jié)合，一小部分以游離形式存在，所有非shbg結(jié)合的睪酮被認(rèn)為是生物可利用的。在兒童期，過(guò)多睪酮會(huì)誘發(fā)男孩性早熟和女孩的男性化。在成年女性中，過(guò)量的睪酮會(huì)造成不同程度的男性化，包括多毛，痤瘡，月經(jīng)稀發(fā)，或不育。睪酮輕度至中度升高對(duì)男性通常無(wú)明顯癥狀，但對(duì)女性造成嚴(yán)重的影響。對(duì)于睪酮輕度至中度升高的確切原因往往不清楚。明顯升高的常見(jiàn)原因包括遺傳疾病(如先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥)，腎上腺，睪丸和卵巢的腫瘤和運(yùn)動(dòng)員濫用睪丸激素或促性腺激素等。女性的睪酮降低會(huì)引起微妙的癥狀。這主要包括性欲下降和非特異性的情緒變化。在男性，它會(huì)導(dǎo)致性腺功能減退。這個(gè)特點(diǎn)將改變男性的第二性征和生育功能。雄烯二酮主要通過(guò)腎上腺分泌，其產(chǎn)量一定程度上由促腎上腺皮質(zhì)激素(acth)調(diào)節(jié)，此外還由睪丸和卵巢通過(guò)將脫氫表雄酮硫酸鹽(dhea-s)轉(zhuǎn)化而來(lái)。雄烯二酮分子量為286.41g/mol，結(jié)構(gòu)式如下。雄烯二酮為一種重要的性類固醇激素前提物。它主要通過(guò)兩種生物合成途徑生成：來(lái)自孕酮或脫氫表雄酮(dhea)等衍生生成。過(guò)高的雄烯二酮水平可能會(huì)引起女性雄激素過(guò)多癥的癥狀。男性通常無(wú)癥狀，但是通過(guò)外圍的雄性激素轉(zhuǎn)化為雌激素可能偶然使其經(jīng)歷雌激素過(guò)多的輕度癥狀，例如男性女性型乳房。大多數(shù)溫和的雄烯二酮水平增高是正常的，但是，顯著的增高可能表明腎上腺和性腺腫瘤。雄烯二酮主要用于評(píng)估腎上腺，卵巢或睪丸功能，如激素的產(chǎn)生影響男性生殖器官和生理特征(雄性激素)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室其他檢測(cè)項(xiàng)目，最通常用于診斷引起高水平睪酮激素女性過(guò)量雄性激素癥狀的原因。11-脫氧皮質(zhì)醇(化合物s)是膽固醇轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)醇的中間產(chǎn)物，皮質(zhì)醇分子量為346.46g/mol，結(jié)構(gòu)式如下。11-脫氧皮質(zhì)醇主要用于診斷11-beta-羥化酶缺乏癥和原發(fā)性(腎上腺衰竭)或者繼發(fā)性(腎上腺軸acth缺乏)腎上腺機(jī)能不足?？傻乃煞肿恿繛?60.44g/mol，結(jié)構(gòu)式如下。當(dāng)患者患有庫(kù)欣綜合征時(shí)，皮質(zhì)醇和可的松水平同時(shí)增高，當(dāng)服用外源性糖皮質(zhì)激素藥物如強(qiáng)的松時(shí)，皮質(zhì)醇和可的松水平會(huì)下降。對(duì)于顯著的鹽皮質(zhì)激素過(guò)剩患者(ame)可的松的形成減少，并使皮質(zhì)醇行使鹽皮質(zhì)激素功能。因此一般顯著的鹽皮質(zhì)激素過(guò)?；颊?ame)常伴隨著可的松和醛固酮水平較低，而皮質(zhì)醇水平正常。由于甘草汁可抑制皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)化為可的松，因此會(huì)減少可的松的血液循環(huán)水平。皮質(zhì)醇是由腎上腺產(chǎn)生的一種激素。位于顱底蝶鞍的垂體生成acth(促腎上腺皮質(zhì)激素)，后者刺激腎上腺合成分泌皮質(zhì)醇。皮質(zhì)醇分子量為362.46g/mol，結(jié)構(gòu)式如下。皮質(zhì)醇在機(jī)體中扮演大量角色：皮質(zhì)醇參與蛋白質(zhì)、糖和脂質(zhì)分解，維持血壓，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。冷熱、感染、創(chuàng)傷、精神、運(yùn)動(dòng)、肥胖和糖尿病可以影響皮質(zhì)醇濃度。皮質(zhì)醇的分泌具有時(shí)間周期性，早晨分泌增多，在早晨8點(diǎn)達(dá)到高峰；傍晚則降低。這種模式可被稱為：“晝夜變異”或“晝夜節(jié)律”，如果人體工作時(shí)間不固定(例如夜班)以及每天睡眠時(shí)間不固定時(shí)，上述節(jié)律會(huì)發(fā)生改變。皮質(zhì)醇不足可引發(fā)非特異性癥狀：體重減輕、肌肉無(wú)力、疲勞、血壓過(guò)低和腹痛。有時(shí)皮質(zhì)醇降低合并壓力有可能導(dǎo)致腎上腺危象，后者需要立即就醫(yī)。皮質(zhì)醇含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致高血壓、血糖過(guò)高、肥胖、皮膚脆弱、腹部紫紋、肌肉無(wú)力和骨質(zhì)疏松。目前國(guó)內(nèi)普遍采用免疫法分別檢測(cè)不同的類固醇激素：如睪酮、4-雄烯二酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、可的松和氫化可的松等，但是免疫法普遍存在交叉反應(yīng)性強(qiáng)，特異性差，靈敏度低，準(zhǔn)確度低等問(wèn)題，而lc-ms/ms法是目前被廣泛接受的小分子定量檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)方法，它的優(yōu)勢(shì)在于靈敏度高，檢測(cè)限低，選擇性好及準(zhǔn)確度和特異性高，它能夠區(qū)別結(jié)構(gòu)相似的化合物。但是由于人體內(nèi)這五種激素的濃度范圍寬，部分濃度高，部分濃度低尤其是女性及兒童的睪酮濃度，且這些類固醇激素主要以蛋白結(jié)合的形式存在，且人體血液組成復(fù)雜存在大量的高親和力結(jié)合蛋白，因此采樣質(zhì)譜法檢測(cè)但仍然需要解決以下問(wèn)題：1)嚴(yán)重的基質(zhì)干擾，特異性差，靈敏度低；2)提高檢測(cè)效率，用同一種方法同時(shí)檢測(cè)這五種類固醇激素；3)不同化合物濃度相差較大或者同一化合物不同人群濃度相差大，要求線性范圍寬。為了降低基質(zhì)干擾，提高特異性、靈敏度等，目前常采用方法有：方法一：離線-樣本先經(jīng)蛋白沉淀，再經(jīng)過(guò)液液萃取或者液固萃取后進(jìn)行氮吹濃縮得到待測(cè)樣本，樣本經(jīng)高效液相色譜、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等進(jìn)行檢測(cè)；方法二：在線-樣本先經(jīng)蛋白沉淀后經(jīng)過(guò)在線萃取裝置得到待測(cè)物，再經(jīng)高效液相色譜、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等進(jìn)行檢測(cè)。但是這兩種方法存在如下的問(wèn)題：方法一前處理復(fù)雜、處理時(shí)間長(zhǎng)(一個(gè)樣本約2小時(shí))、通量低、試劑成本高、對(duì)操作人員要求高；方法二儀器投入大，且在線萃取的耗材成本高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)檢測(cè)血清中五種類固醇激素的方法。具體的技術(shù)方案如下：一種同時(shí)檢測(cè)血清中五種類固醇激素的方法，包括如下步驟：所述五種類固醇激素分別為：睪酮、雄烯二酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)醇和可的松；樣品前處理：在血清樣品中加入含有睪酮內(nèi)標(biāo)物、雄烯二酮內(nèi)標(biāo)物、11-脫氧皮質(zhì)醇內(nèi)標(biāo)物、皮質(zhì)醇內(nèi)標(biāo)物和可的松內(nèi)標(biāo)物的乙腈溶液進(jìn)行蛋白沉淀，再加入叔丁基甲醚進(jìn)行萃取，震蕩，離心取上清液于氮吹儀中，吹干，加入復(fù)溶液，震蕩離心取上清液得待測(cè)樣品；富集、分離和檢測(cè)：對(duì)所述待測(cè)樣品采用二維液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行富集、分離和檢測(cè)。在其中一些實(shí)施例中，所述富集、分離和檢測(cè)的步驟包括：先用流動(dòng)相1洗脫富集柱中的所述待測(cè)樣品，對(duì)所述待測(cè)樣品進(jìn)行富集、純化；將富集柱與分析柱連通，用流動(dòng)相2將待測(cè)物依次從富集柱洗脫至分析柱，用流動(dòng)相2將待測(cè)物從分析柱洗脫、分離；斷開(kāi)富集柱與分析柱，用流動(dòng)相2將待測(cè)物從分析柱洗脫、分離至四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)；其中，富集柱為c6柱，分析柱為c18柱；流動(dòng)相1：a相為去離子水，b相為甲醇，流速為1.0-2.0ml/min；流動(dòng)相2：c相為15mm/l醋酸銨水溶液，d相為含0.1wt％甲酸的甲醇溶液，流速為0.2-1.0ml/min。在其中一些實(shí)施例中，流動(dòng)相采用梯度洗脫模式：0min時(shí)，流動(dòng)相1中a相與b相的體積比為100:0，流動(dòng)相2中c相與d相的體積比為90:10，用流動(dòng)相1洗脫富集柱中的待測(cè)樣品，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行富集、純化；0.15min時(shí)，將富集柱與分析柱連通，用流動(dòng)相2將待測(cè)物依次從富集柱洗脫至分析柱；3.0min時(shí)，流動(dòng)相2中c相與d相的體積比為55:45；4.0min時(shí)，流動(dòng)相2中c相與d相的體積比為35:65；5.0min時(shí)，斷開(kāi)富集柱與分析柱，用流動(dòng)相2將待測(cè)物從分析柱洗脫、分離至四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，流動(dòng)相2中c相與d相的體積比為25:75；用流動(dòng)相1將富集柱中的殘留雜質(zhì)洗脫至廢液瓶中；5.5min時(shí)，流動(dòng)相2中c相與d相的體積比為5:95；8.0min時(shí)，流動(dòng)相2中c相與d相的體積比為90:10；整個(gè)梯度時(shí)間為8.5～12.0min。在其中一些實(shí)施例中，所述流動(dòng)相1的流速為1.0-1.2ml/min，所述流動(dòng)相2的流速為0.4-0.6ml/min。在其中一些實(shí)施例中，所述睪酮內(nèi)標(biāo)物為睪酮的c13標(biāo)記物或氘代標(biāo)記物，所述雄烯二酮內(nèi)標(biāo)物為雄烯二酮的c13標(biāo)記物或氘代標(biāo)記物，所述11-脫氧皮質(zhì)醇內(nèi)標(biāo)物為11-脫氧皮質(zhì)醇的c13標(biāo)記物或氘代標(biāo)記物，所述皮質(zhì)醇內(nèi)標(biāo)物為皮質(zhì)醇的c13標(biāo)記物或氘代標(biāo)記物，所述可的松內(nèi)標(biāo)物為可的松的c13標(biāo)記物或氘代標(biāo)記物。在其中一些實(shí)施例中，所述四級(jí)桿質(zhì)譜條件為：正離子模式，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描mrm；所述正離子模式中，目標(biāo)定量離子對(duì)包括：睪酮離子對(duì)、雄烯二酮離子對(duì)、11-脫氧皮質(zhì)醇離子對(duì)、皮質(zhì)醇離子對(duì)和可的松定量離子對(duì)；和/或，睪酮內(nèi)標(biāo)物的定量離子對(duì)、雄烯二酮內(nèi)標(biāo)物的定量離子對(duì)、11-脫氧皮質(zhì)醇內(nèi)標(biāo)物的定量離子對(duì)、皮質(zhì)醇內(nèi)標(biāo)物的定量離子對(duì)和可的松內(nèi)標(biāo)物的定量離子對(duì)；目標(biāo)定量離子的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描mrm的質(zhì)/荷比條件包括：睪酮的母離子的質(zhì)/荷比為289.0～289.5，對(duì)應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為108.9～109.3，96.8～97.2；雄烯二酮的母離子的質(zhì)/荷比為287.0～287.8，對(duì)應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為96.8～97.2，108.9～109.3；11-脫氧皮質(zhì)醇母離子的質(zhì)/荷比為346.9～347.3，對(duì)應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為96.8～97.2，108.9～109.3；皮質(zhì)醇母離子的質(zhì)/荷比為362.8～363.3，對(duì)應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為96.8～97.2，120.9～121.3；可的松母離子的質(zhì)/荷比為360.9～361.3，對(duì)應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為162.8～163.2，342.8～343.2；13c3-睪酮母離子的質(zhì)/荷比為289.9～292.3，對(duì)應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為111.9～112.2；13c3-雄烯二酮母離子的質(zhì)/荷比為290.0～290.5，對(duì)應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為99.8～100.2；d5-11-脫氧皮質(zhì)醇母離子的質(zhì)/荷比為351.9～352.3，對(duì)應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為113.9～114.3；d4-皮質(zhì)醇母離子的質(zhì)/荷比為366.8～367.3，對(duì)應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為120.9～121.3。在其中一些實(shí)施例中，所述四級(jí)桿質(zhì)譜條件還包括以下離子源參數(shù)：電離源為電噴霧電離esi源，氣簾氣壓力為39～43psi，加熱氣壓力為46～53psi，輔助加熱氣壓力為55～62psi，加熱氣溫度為500～600℃，碰撞氣為氮?dú)?，碰撞氣壓力?.5～7.0psi，電噴霧針電壓為5000～6000v。在其中一些實(shí)施例中，所述四級(jí)桿質(zhì)譜條件還包括：睪酮定量離子對(duì)的去簇電壓為95～105v，入口電壓為8～12v，碰撞電壓為30～40v，出口電壓為10～14v；雄烯二酮的定量離子對(duì)的去簇電壓為95～105v，入口電壓8～12v，碰撞電壓為30～40v，出口電壓為10～14v；11-脫氧皮質(zhì)醇定量離子對(duì)的去簇電壓為95～105v，入口電壓4～8v，碰撞電壓為45～55v，出口電壓為20～30v；皮質(zhì)醇定量離子對(duì)的去簇電壓為105～115v，入口電壓6～10v，碰撞電壓為30～40v，出口電壓為8～12v；可的松定量離子對(duì)的去簇電壓為125～135v，入口電壓8～15v，碰撞電壓為40～50v，出口電壓為9～15v；睪酮-13c定量離子對(duì)的去簇電壓為115～130v，入口電壓4～8v，碰撞電壓為30～40v，出口電壓為9～15v；雄烯二酮-13c定量離子對(duì)的去簇電壓為110～120v，入口電壓8～12v，碰撞電壓為30～40v，出口電壓為9～15v；11脫氧皮質(zhì)醇-d5定量離子對(duì)的去簇電壓為115～125v，入口電壓4～8v，碰撞電壓為45～55v，出口電壓為9～15v；皮質(zhì)醇-d4定量離子對(duì)的去簇電壓為105～120v，入口電壓4～8v，碰撞電壓為30～40v，出口電壓為9～15v。在其中一些實(shí)施例中，所述血清樣品與所述乙腈溶液的體積比為1：1～4；所述叔丁基甲醚與所述血清樣品的體積比為1：2～8倍；所述叔丁基甲醚與上清液的體積比為1：1～2。在其中一些實(shí)施例中，所述樣品前處理中離心的條件為：溫度0～5℃，轉(zhuǎn)速11000～13000r/min，時(shí)間4～8min。上述血清中五種類固醇激素的檢測(cè)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：(1)上述檢測(cè)方法采用一種方法同時(shí)檢測(cè)血清中五種濃度范圍不一致的化合物，同時(shí)檢測(cè)五種化合物的時(shí)間約為8.5～12.0min。其他分別檢測(cè)的方法，一個(gè)化合物的檢測(cè)時(shí)間至少7min，即五個(gè)化合物至少用時(shí)35min。對(duì)比于化合物分別檢測(cè)的方法，上述檢測(cè)方法大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了樣本的檢測(cè)通量。(2)上述檢測(cè)方法在儀器投入方面比普通的液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀僅增加了一個(gè)富集柱和一組泵，就可以大大提高了待測(cè)化合物的濃縮純化效率提高檢測(cè)靈敏度，并且采用的富集柱簡(jiǎn)單、成本低且可重復(fù)使用數(shù)千次以上。相對(duì)于在線固相萃取，本方法的耗材成本至少降低10倍。即本發(fā)明的檢測(cè)方法成本低。(3)上述檢測(cè)方法通過(guò)對(duì)前處理的參數(shù)以及富集、分離和檢測(cè)的各參數(shù)(比如富集柱的選擇、流動(dòng)相的選擇、流速等條件)進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行優(yōu)化，使最后得到的檢測(cè)方法可以有效去除基質(zhì)干擾，特異性、抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)。定量限低，靈敏度高，精密度rsd小于10％，可以準(zhǔn)確的定性或定量檢測(cè)出血清中極低濃度的睪酮、雄烯二酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)醇和可的松的含量。即與常用的檢測(cè)相比，本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度高、精密度高、特異性強(qiáng)。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1人血清樣品中睪酮、雄烯二酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)醇和可的松及其內(nèi)標(biāo)物的tic圖，順序依次為總混合物、皮質(zhì)醇、可的松、11-脫氧皮質(zhì)醇、睪酮、雄烯二酮；圖2為睪酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖3為雄烯二酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖4為11-脫氧皮質(zhì)醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖5為皮質(zhì)醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。實(shí)施例1本實(shí)施例的五種類固醇激素的檢測(cè)方法，包括以下步驟：一、樣品前處理取200μl樣本(標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)與質(zhì)控同步處理)于2.0離心管中，加入400μl內(nèi)標(biāo)工作液(13c3-睪酮4mg/l、d4-皮質(zhì)醇4mg/l、d5-11-脫氧皮質(zhì)醇16mg/l)和13c3-雄烯二酮儲(chǔ)備液8mg/l的乙腈溶液)，高速震蕩混勻3min；加入800ul叔丁基甲醚，高速震蕩混勻3min；于4℃，14000r離心10min；取上清液1ml于1.5ml離心管中，40℃氮?dú)獯蹈?；?00ul復(fù)溶液復(fù)溶，高速震蕩3min；于4℃，10000r離心5min；轉(zhuǎn)移80μl離心后的樣本于進(jìn)樣瓶中，上機(jī)檢測(cè)。二、富集、分離和檢測(cè)自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)將50ul待測(cè)樣品加載到二維液相色譜系統(tǒng)中，對(duì)所述待測(cè)樣品采用二維液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀(lc-ms/ms)進(jìn)行富集、分離與檢測(cè)。其中，富集柱為c6-phenyl(4×2.0mm)；分析柱為c18(50×2.0mm,3μm)；柱溫為40℃。該系統(tǒng)配置了兩套泵，兩套泵通過(guò)一個(gè)六通閥實(shí)現(xiàn)切換(也可以通過(guò)兩個(gè)六通閥或者其它的方式進(jìn)行切換)，六通閥3號(hào)位連接flow1(流動(dòng)相1)，1號(hào)和4號(hào)位連接富集柱，5號(hào)位連接flow2(流動(dòng)相2)，6號(hào)位連接分析柱，2號(hào)位連接廢液瓶。flow1流動(dòng)相1：a相為去離子水、b相為甲醇，流速為1.0ml/min；flow2流動(dòng)相2：c相為含15mm/l醋酸銨水溶液、d相為含0.1％甲酸的甲醇溶液，流速0.45ml/min。六通閥的起始模式為0，即富集柱與分析柱處于未連通狀態(tài)，待測(cè)樣品經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入富集柱進(jìn)行富集、純化，此過(guò)程中富集柱用flow1流動(dòng)相進(jìn)行洗脫；0.15min切換六通閥為1，即富集柱與分析柱連通，將待測(cè)樣品洗脫至分析柱，此過(guò)程中富集柱與分析柱中的洗脫流動(dòng)相均為flow2流動(dòng)相；5.0min六通閥切回起始模式0，斷開(kāi)富集柱與分析柱，待測(cè)物在分析柱中經(jīng)梯度洗脫(流動(dòng)相為flow2流動(dòng)相)至分離后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，富集柱中的殘留雜質(zhì)經(jīng)梯度洗脫(流動(dòng)相為flow1流動(dòng)相)至廢液瓶中。流動(dòng)相的梯度洗脫如表1所示。表1流動(dòng)相的洗脫梯度上述梯度下，可的松的保留時(shí)間為：5.22min；皮質(zhì)醇的保留時(shí)間為：5.38min；11-脫氧皮質(zhì)醇的保留時(shí)間為：5.78min；4-雄烯二酮的保留時(shí)間為:6.04min；睪酮的保留時(shí)間為：6.16min。本實(shí)施例lc-ms/ms采用具有電噴霧電離源(esi)的appliedbiochemistryapi4500plus串聯(lián)質(zhì)譜分析儀作為檢測(cè)器進(jìn)行分析。其中，氣簾氣壓力為40.0psi；加熱氣壓力為40psi；輔助加熱氣壓力為60psi；加熱氣溫度為550℃；碰撞氣為高純氮?dú)?，壓力?psi；電噴霧針電壓為5500v。其它質(zhì)譜條件：采用正離子模式，掃描方式采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描mrm，其條件參見(jiàn)表2。表2多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描mrm條件待測(cè)物隨流動(dòng)相流出分析柱后，在壓力的作用下進(jìn)入質(zhì)譜儀離子源，由六通閥控制進(jìn)入離子源的樣品通道，和進(jìn)入切換時(shí)間。在離子源內(nèi)液體樣品被汽化并且電離為帶電分子，帶電分子在電壓和真空作用下，進(jìn)入q1、q2和q3，其中，q1和q3為質(zhì)量過(guò)濾器，只允許根據(jù)上述五種類固醇激素及其內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)荷比選擇的母離子和子離子通過(guò)，q2為碰撞單元，母離子在此處與惰性氣體原子碰撞，產(chǎn)生特定的碎片離子。質(zhì)譜儀的第一個(gè)四極(q1)選擇具有待測(cè)物及其內(nèi)標(biāo)物的特定質(zhì)荷比m/z的母離子，具有這些m/z比的母離子被允許進(jìn)入q2，q2產(chǎn)生的碎片離子進(jìn)入到q3，其中待測(cè)物及其內(nèi)標(biāo)物的碎片離子(子離子)被選擇通過(guò)，而其它離子被除去。參見(jiàn)表3，示出了被用于鑒別和定量的待測(cè)物的離子對(duì)的質(zhì)荷比m/z。表3待測(cè)物的質(zhì)量轉(zhuǎn)變表隨著離子與檢測(cè)器碰撞，它們將捕獲到的離子數(shù)轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號(hào)的電子脈沖。所獲得的數(shù)據(jù)被傳遞到計(jì)算機(jī)，其將所收集的離子數(shù)對(duì)時(shí)間作圖，即得總離子流圖(tic圖)(如圖1所示)。三、定性判斷和定量計(jì)算(1)依據(jù)待測(cè)物、內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)保留時(shí)間和檢測(cè)的定量離子對(duì)的豐度比判斷待測(cè)物的存在。在相同試驗(yàn)條件下，檢測(cè)樣品中被測(cè)目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間一致；檢測(cè)樣品的色譜圖中所選擇的檢測(cè)離子對(duì)的相對(duì)豐度比與相當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子對(duì)相對(duì)豐度比的偏差(即表4中的最大允許誤差)不超過(guò)表4規(guī)定的范圍，則可以判斷樣品中存在對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)。表4定性判斷相對(duì)豐度的最大允許誤差相對(duì)豐度(k)k≥50％20％≤k≤50％10％≤k≤20％k≤10％最大允許誤差±20％±25％±30％±50％(2)采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值計(jì)算樣品中的待測(cè)物的含量。配置系列濃度的含有待測(cè)物的血清標(biāo)準(zhǔn)樣品，用本實(shí)施例的上述方法進(jìn)行樣品前處理以及分離檢測(cè)，以血清標(biāo)準(zhǔn)樣品中待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積的比值構(gòu)建內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線，睪酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2，曲線的方程y＝0.000122x+0.00188，r＝0.9998；雄烯二酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3，曲線的方程為y＝2.98e-005x+0.00267,r＝0.9992；11-脫氧皮質(zhì)醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4，曲線的方程為y＝0.00068x+0.0105,r＝0.9997；皮質(zhì)醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖5，曲線的方程為y＝0.000957x+0.00105,r＝0.9997；可的松的標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y＝0.0428x+0.00172,r＝0.9993然后利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品或質(zhì)量控制物中的待測(cè)物的濃度。本實(shí)施例測(cè)得睪酮的峰面積為3.10e+005，其內(nèi)標(biāo)物的峰面積為6.10e+006，計(jì)算得到本實(shí)施例的人血清樣品中睪酮的濃度為403ng/l；雄烯二酮的峰面積為6.65e+005，其內(nèi)標(biāo)物的峰面積為1.96e+007，計(jì)算得到雄烯二酮的濃度為1050ng/l；11-脫氧皮質(zhì)醇的峰面積為5.23e+004，其內(nèi)標(biāo)物的峰面積為3.27e+005，計(jì)算得到11-脫氧皮質(zhì)醇的濃度為220ng/l；皮質(zhì)醇的峰面積為3.44e+005，其內(nèi)標(biāo)物的峰面積為8.63e+006，計(jì)算得到皮質(zhì)醇的濃度為4.06ug/l；可的松的峰面積為3.28e+004，其內(nèi)標(biāo)物的峰面積為8.63e+006，計(jì)算得到可的松的濃度為3.79ug/l。實(shí)施例2方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例1中的五種類固醇激素的檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。1、精密度(precision)實(shí)驗(yàn)1.1批內(nèi)精密度(intra-assay)：取實(shí)際血清樣本分別加標(biāo)至低、中、高三水平，得到的樣本進(jìn)行批內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)；每個(gè)濃度水平的樣本平行處理20個(gè)，每個(gè)進(jìn)樣1次；計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)。1.2批間精密度(inter-assay)：取預(yù)先配制好的低、中、高三水平的質(zhì)控品，進(jìn)行批間精密度實(shí)驗(yàn)；每個(gè)水平的樣本分別做4個(gè)平行，即檢測(cè)得4組數(shù)據(jù)，連續(xù)測(cè)定5天；計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)。睪酮、雄烯二酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)醇、可的松的批內(nèi)精密度及批間精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別如表5～9所示，經(jīng)驗(yàn)證，批內(nèi)精密度范圍為1.31％～5.89％，批間精密度范圍為1.67％～6.31％。表5睪酮批內(nèi)精密度及批間精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(單位：ng/l)表6雄烯二酮批內(nèi)精密度及批間精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(單位：ng/l)表711-脫氧皮質(zhì)醇批內(nèi)精密度及批間精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(單位：ng/l)表8皮質(zhì)醇批內(nèi)精密度及批間精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(單位：ug/l)表9可的松批內(nèi)精密度及批間精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(單位：ug/l)2、分析靈敏度和線性范圍(analyticalsensitivityandanalyticalm--easurementrangeandlinearitystudy)2.1方法定量限與線性范圍(limitofquantitationandlinearity)a.配制空白基質(zhì)；b.配置標(biāo)準(zhǔn)曲線；c.每個(gè)濃度的樣本平行處理6個(gè)，分別檢測(cè)一次；d.計(jì)算各濃度樣本的平均值、rsd和回收率；e.方法定量限的確定標(biāo)準(zhǔn)：rsd小于20％且回收率在85％-115％范圍內(nèi)的最低濃度點(diǎn)視為定量限濃度，即loq；f.線性范圍的確定標(biāo)準(zhǔn)：rsd小于20％，回收率在85％-115％范圍內(nèi)，且以理論濃度比率與實(shí)際信號(hào)響應(yīng)峰面積比率繪制成的回歸曲線r2>0.98，即滿足線性范圍的要求；g.驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表10～14與圖2-圖5所示，睪酮的loq為2.75ng/l，線性范圍為2.75-10000ng/l；雄烯二酮的loq為9.7ng/l，線性范圍為9.7-25000ng/l；11-脫氧皮質(zhì)醇的loq為2.75ng/l，線性范圍為2.75-10000ng/l；皮質(zhì)醇的loq為0.0275ug/l，線性范圍為0.0275-100ug/l；可的松的loq為0.046ug/l，線性范圍為0.046-191ug/l。表10睪酮定量限實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)理論濃度(ng/l)檢測(cè)平均值(ng/l)rsd回收率00——1.23752.0325％164.04％2.752.723.59％99.03％5.55.424.07％98.52％1110.924.27％99.24％2221.373.01％97.12％44.142.402.62％96.15％88.184.604.63％96.03％156154.502.04％99.04％313313.832.36％100.27％625632.331.29％101.17％12501238.331.19％99.07％25002506.671.74％100.27％50005030.001.56％100.60％100009960.001.91％99.60％表11雄烯二酮定量限實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表1211-脫氧皮質(zhì)醇定量限實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)理論濃度(ng/l)檢測(cè)平均值(ng/l)rsd回收率00——1.3751.71920.06％125.1％2.752.775.77％100.67％5.55.353.45％97.21％1111.055.45％100.45％2221.035.10％95.61％44.141.177.09％93.35％88.184.873.66％96.33％156159.003.98％101.92％313325.333.89％103.94％625641.333.24％102.61％12501278.332.64％102.27％25002531.671.53％101.27％50005051.671.13％101.03％100009870.002.42％98.70％表13皮質(zhì)醇定量限實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)理論濃度(ng/l)檢測(cè)平均值(ng/l)rsd回收率00——0.013750.0144525.03％105.11％0.02750.036.26％104.12％0.0550.067.96％101.61％0.110.114.05％103.03％0.220.212.94％95.68％0.4410.424.41％94.63％0.8810.842.72％95.89％1.561.591.68％101.71％3.133.231.30％103.09％6.256.481.68％103.60％12.512.781.67％102.27％2525.081.52％100.33％5050.281.51％100.57％10099.072.47％99.07％表14可的松定量限實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)2.2方法檢出限(limitofdetection)a.收集濃度均在定量限loq附近的病人血清樣本；b.平行處理此病人樣本20個(gè)，分別檢測(cè)1次；c.計(jì)算各濃度樣本的平均值、sd和方法檢出限(lod)；d.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表15所示，睪酮的lod為1.595ng/l，雄烯二酮的lod為2.45ng/l，11-脫氧皮質(zhì)醇的lod為1.90ng/l，皮質(zhì)醇的lod為0.012ug/l，可的松的lod為0.0238ug/l。表15方法檢出限試驗(yàn)數(shù)據(jù)2.3結(jié)論(summaryoftheamrstudy)表16分析靈敏度與線性范圍結(jié)果匯總3.方法準(zhǔn)確度-回收率(recovery)a.收集一批混合血清樣本，測(cè)得基礎(chǔ)濃度，分別加標(biāo)至高、中、低三水平的樣本，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)；b.未加標(biāo)及加標(biāo)樣品，每個(gè)平行處理3個(gè)，分別進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算加標(biāo)樣品的回收率結(jié)果，回收率在85-115％范圍內(nèi)，認(rèn)為方法準(zhǔn)確；c.回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表17～21所示。由結(jié)果可知，方法的回收率在95.42～105％之間，滿足要求。表17睪酮加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果表18雄烯二酮加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果表1911-脫氧皮質(zhì)醇加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果表20皮質(zhì)醇加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果表21可的松加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果由上述的檢測(cè)結(jié)果顯示本發(fā)明的五種類固醇激素的檢測(cè)方法檢測(cè)血清樣品或者質(zhì)控物質(zhì)結(jié)果準(zhǔn)確，睪酮的定量限為2.75ng/l，檢測(cè)限為1.6ng/l，精密度rsd<5％，加標(biāo)回收率在90％-110％之間；雄烯二酮的定量限為9.7ng/l，檢測(cè)限為2.45ng/l，精密度rsd<5％，加標(biāo)回收率在90％-115％之間；11-脫氧皮質(zhì)醇的定量限為2.75ng/l，檢測(cè)限為1.90ng/l，精密度rsd<5％，加標(biāo)回收率在87％-110％之間；皮質(zhì)醇的定量限為0.0275ug/l，檢測(cè)限為0.0120ug/l，精密度rsd<5％，加標(biāo)回收率在85％-115％之間；可的松的定量限為0.046ug/l，檢測(cè)限為0.0238ug/l，精密度rsd<5％，加標(biāo)回收率在90％-110％之間，檢測(cè)時(shí)間時(shí)間約11.0min，檢測(cè)效率高。說(shuō)明本方法準(zhǔn)確可靠，精密度高、靈敏度高、檢測(cè)通量高、成本低。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書(shū)記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)12