本發(fā)明涉及植物細(xì)胞遺傳學(xué)中的植物染色體中期相標(biāo)本的制備方法，尤其涉及斑茅植物根尖染色體的制備方法。

技術(shù)背景

染色體是遺傳物質(zhì)的載體，在不同的物種中染色體具有較為穩(wěn)定的數(shù)目和形態(tài)。細(xì)胞染色體遺傳研究在遺傳育種具有重要的地位，染色體標(biāo)本的制備是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基本實(shí)驗(yàn)方法。植物染色體標(biāo)本制備包括以下幾個(gè)流程：根尖培養(yǎng)、取材、前處理、固定、酶解（或解離），制片及鏡檢。

斑茅Erianthus arundinaceus (Retz.) Jeswiet.為多年生草本，直立叢生，無(wú)地下莖，分布極廣，適應(yīng)性極強(qiáng)。它具有抗旱、耐澇、耐瘠、抗病蟲(chóng)能力強(qiáng)、分蘗多、宿根性好、生長(zhǎng)力旺盛等特點(diǎn)，具有甘蔗育種者所追求的能被甘蔗育種所利用的優(yōu)異性狀，所以倍受世界各國(guó)育種家青睞。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)突破了甘蔗與斑茅的屬間雜交獲得了多代材料。斑茅及其與甘蔗雜交的后代對(duì)甘蔗遺傳改良具有重要的意義。

多數(shù)的斑茅的染色體數(shù)目2n = 60條，研究人員也曾發(fā)現(xiàn)有2n = 40條，但比水稻、玉米、高粱等作物染色體條數(shù)多，染色體制片難度大。特別是斑茅根尖的培養(yǎng)一直是個(gè)難點(diǎn)，傳統(tǒng)的植物根尖培養(yǎng)的方法如水稻、玉米、小麥?zhǔn)峭ㄟ^(guò)種子發(fā)芽等根尖來(lái)獲得。斑茅為無(wú)性系植物一般參照甘蔗的方法，通過(guò)獲取斑茅植物的莖段，對(duì)莖段的節(jié)上根點(diǎn)保濕培養(yǎng)來(lái)獲得新生的根，長(zhǎng)至1cm左右取根尖。但是斑茅莖多為空綿心，節(jié)上的根點(diǎn)較少，保濕后能長(zhǎng)出根的根點(diǎn)更少，傳統(tǒng)方法培養(yǎng)根需要大量的斑茅莖段，此外在培養(yǎng)莖段過(guò)程中的溫度和濕度控制的要求較高，根尖長(zhǎng)出后容易褐化停止生長(zhǎng)，以致要獲得活性較強(qiáng)的根尖不容易。以傳統(tǒng)的斑茅制片方法獲得較好的染色體制片難度大，研究人員都在尋求一種高效的斑茅染色體制備方法，能在較短時(shí)間內(nèi)獲得活性好的斑茅根尖，具有較多的分裂相細(xì)胞，不需要反復(fù)砍莖培養(yǎng)、取根，節(jié)省人力物力，提高斑茅染色體制備效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種斑茅植物根尖分生區(qū)染色體標(biāo)本的制備方法，其具有節(jié)省時(shí)間和實(shí)驗(yàn)材料及勞力，提高實(shí)驗(yàn)效率的效果。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種斑茅植物根尖分生區(qū)染色體標(biāo)本的制備方法，包括以下步驟。

（1）根尖培養(yǎng)：

初春，剪取斑茅幼嫩植株種植于培養(yǎng)桶內(nèi)，培養(yǎng)桶的側(cè)邊及底部打孔透水，桶內(nèi)底部為保水透氣基質(zhì)，通過(guò)正常的水、肥及除草等栽培管理，3~4個(gè)月后斑茅的根會(huì)盤繞于桶內(nèi)的四周及底部。

（2）根尖取樣及前處理：

于夏季晴朗天氣早晨8:00~10:00，將整植株連同基質(zhì)與培養(yǎng)桶分離，挑選活性高的根尖，用手術(shù)刀切取約0.5cm的根尖，放置于蒸餾水中漂洗，漂洗后投入濃度為0.002M的8-羥基喹啉水溶液25~28℃處理3~4小時(shí)，處理后用蒸餾水漂洗，紗布擦去根系表分泌物后，再放置于卡諾氏固定液中、4℃冰箱處理24~48小時(shí)。

（3）根尖酶解

從步驟（2）的冰箱中取出根尖，用蒸餾水漂洗2~3次，洗凈固定液后，放置于0.075M KCl溶液前低滲1小時(shí)，后取出根尖放置于含有纖維素和果膠酶的酶解混合溶液中酶解5~8小時(shí)，酶解后用蒸餾水洗去酶解液，后低滲1小時(shí)，轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液固定0.5小時(shí)。

（4）染色體制片

用手術(shù)刀和鑷子將步驟（3）的根尖分生區(qū)細(xì)胞解離出，并均勻涂抹于玻片上，晾干。

（5）鏡檢

將步驟（4）中晾干的玻片置于具有相差功能的光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，選擇染色體形態(tài)好、分散好的細(xì)胞，做好記錄，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

優(yōu)化方案是：步驟（3）所述的酶解混合液的濃度，纖維素和果膠酶的質(zhì)量濃度分別為3.5%和1.75%。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。

1. 本發(fā)明采用的是桶栽整株取根的方法進(jìn)行根尖培養(yǎng)，根尖活性強(qiáng)，效果穩(wěn)定，具有節(jié)省時(shí)間、實(shí)驗(yàn)材料及勞力、提高實(shí)驗(yàn)效率等優(yōu)點(diǎn)。

2. 本發(fā)明獲得的細(xì)胞制片干凈，細(xì)胞中期分裂相多，染色體分散、形態(tài)好，可用于染色體進(jìn)行核型分析或下游實(shí)驗(yàn)（如染色體熒光原位雜交）等染色體遺傳研究，為斑茅種質(zhì)染色體遺傳研究提供有效的技術(shù)儲(chǔ)備。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。

實(shí)施例

一種斑茅植物根尖分生區(qū)染色體的制備方法，包括如下步驟。

（1）根尖培養(yǎng)：初春，將剪取斑茅幼嫩植株2-3株種植于規(guī)格上口直徑35cm下口直徑27cm高度32cm牛津桶，桶四面及底部打直徑為2cm孔透水透氣，桶內(nèi)底部放入3cm左右厚度的松樹(shù)皮，以菜田土為種植基質(zhì)，厚度約為15cm，通過(guò)正常的水、肥及除草等栽培管理，使植株在良好的條件下茁壯成長(zhǎng)，3個(gè)月后植株進(jìn)入生長(zhǎng)旺盛期，斑茅根系會(huì)纏繞桶內(nèi)底部及邊緣。

（2）根尖取樣及前處理：夏季早上9：00~10：00將整植株連同基質(zhì)與桶分離，此時(shí)根系生長(zhǎng)旺盛，粗壯的根系爬滿基質(zhì)與桶之間，選取底部或邊緣白顏色較為透亮，生長(zhǎng)旺盛，健康的根尖，用手術(shù)刀切取約0.5cm的根尖，放置于蒸餾水中漂洗，漂洗后投入濃度為0.002M的8-羥基喹啉水溶液25~28℃處理4小時(shí)，蒸餾水漂洗后，用紗布擦去根表分泌物后投入卡諾氏固定液于4℃冰箱處理24~48小時(shí)。

（3）根尖酶解：從冰箱取出根尖，用蒸餾水漂洗2~3次后，放置于0.075M KCl溶液前低滲60min，后取出根尖放置于含纖維素3.5%和果膠酶1.75%的酶解混合液中酶解5~8h（視其根尖的大小確定酶解時(shí)間），后用蒸餾水洗去酶液，后低滲60min，轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液后固定30min。

（4）染色體制片：用鑷子和手術(shù)刀，將步驟（3）的根尖分生區(qū)細(xì)胞解離出，均勻涂抹于載玻片，晾干。

（5）鏡檢：將晾干的玻片放置于具有相差功能的顯微鏡鏡檢，選擇染色體形態(tài)好、分散好的細(xì)胞，做好記錄，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>