本發(fā)明涉及應(yīng)用uhplc-qexactive聯(lián)用的代謝組學(xué)技術(shù)區(qū)分真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜的檢測方法，屬于食品摻假鑒別技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)，蜂蜜營養(yǎng)價值高，但是由于蜂蜜較高的價格和較低的產(chǎn)量，使得蜂蜜成為不法商販摻假的一個主要對象,為了提高蜂農(nóng)的生產(chǎn)積極性、保障消費者的利益，為了支持正規(guī)蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)的公平競爭、維護蜂蜜市場的秩序，促進我國蜂蜜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，因此對于找到真正蜂蜜樣品的標志性代謝物，從而嘗試建立一套靈敏、高效、準確的蜂蜜摻假鑒定方法具有非常重要的意義與價值。

在真蜂蜜中摻入果葡糖漿、淀粉糖漿、大米糖漿等：這是目前最常用的蜂蜜摻假手段，由于這些糖漿的果糖和葡萄糖比例與蜂蜜中的成分非常相似，摻入后各項檢測指標完全符合國家標準，給檢測造成了很大的困難。目前常用于蜂蜜摻假進行鑒定的方法有穩(wěn)定碳同位素比值分析法(scira)、薄層色譜法(tic)、脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜法(hpaec-pad)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gc-ms)、高效液相色譜法(hplc)、高效液相同位素質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(hplc-irms)、核磁共振技術(shù)(nmr)以及近紅外光譜(nirs)等?，F(xiàn)有的方法對于測定蜂蜜摻假有許多弊端：穩(wěn)定碳同位素比值分析法(scira)這種方法只對天然蜂蜜中摻入c4植物糖有效，如果蜂蜜中摻入利用水稻、小麥、大豆等c3植物淀粉制備的糖類成分或利用水稻、小麥、大豆等c3植物淀粉制備的糖類物質(zhì)與其他物質(zhì)配制的全假蜂蜜，則難以鑒別。kushnir等利用薄層色譜法測定玉米糖漿摻假的蜂蜜確定聚合度為12到19的多聚糖為蜂蜜摻假高果糖玉米糖漿和玉米糖漿的標志物。但是這種方法需要復(fù)雜的前處理過程來除去蜂蜜中的葡萄糖、果糖和少量寡糖，導(dǎo)致檢測方法操作復(fù)雜。脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜法(hpaec-pad)法的局限性更大，在前期對寡糖和多聚糖的水解很可能造成假陽性結(jié)果，因為真蜂蜜中也有聚合度3-6的寡糖的存在。脈沖電流檢測器的高效陰離子交換色譜法(hpaec-pad)則需要復(fù)雜的前處理過程來除去單糖和寡糖，前處理過程復(fù)雜。gc-ms法測定蜂蜜摻假也有一定的缺陷，在檢測前需要對蜂蜜樣本進行衍生化。核磁共振技術(shù)(nmr)靈敏度低，對于蜂蜜中我們所關(guān)注的代謝物可能會被忽略，并且核磁共振儀器價格昂貴，并不適用于日常監(jiān)測。近紅外光譜(nirs)也有其致命的缺點：1.需要大量有代表性且化學(xué)值已知的樣品建立模型。這樣，對小批量樣品的分析用近紅外就顯得不實際了。2.模型需要不斷更新，由于儀器狀態(tài)改變或標準樣品發(fā)生變化，模型也要隨之變化了。3.模型不通用，每臺儀器的模型都不相同，增加使用的局限性。4.建模本錢高，測試用度大。

現(xiàn)有的對蜂蜜品質(zhì)進行鑒定的方法如gb14963-2011以及sn/t0852-2012：對蜂蜜的感官性狀；理化指標如：果糖葡萄糖含量，蔗糖含量等方面進行檢測；微生物指標，農(nóng)殘獸殘，重金屬，添加劑等方面也均進行檢測。很多企業(yè)標準則對蜂蜜中的麥芽糖、果葡萄糖漿、可可粉，檸檬酸、誘惑紅、焦糖色、山梨酸鉀、卡拉膠、食用香精等進行測定。目前對蜂蜜摻假的各種糖漿，在理化性質(zhì)，成分組成和含量以及風(fēng)味方面與蜂蜜非常相似，因此上述對蜂蜜品質(zhì)進行測定的方法并不能檢測出糖漿摻假的蜂蜜。

綜上所述，目前現(xiàn)有技術(shù)中缺少一種對蜂蜜摻假進行鑒定的快速有效和直觀明顯的方法，也沒有用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)合代謝組學(xué)法測定真正蜂蜜標志性代謝物的有關(guān)研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法判別真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜的分析方法，該分析方法能夠有效鑒別真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

基于蜂蜜代謝物和糖漿代謝物的差異，本發(fā)明的第一個目的是提供一種應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法判別真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜的分析方法，包括以下步驟：

將真蜂蜜樣品和與真蜂蜜蜜源相同的待檢測的糖漿摻假蜂蜜樣品分別采用有機溶劑進行前處理后，應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜方法實現(xiàn)對前處理后的樣品中的化學(xué)成分的分離與測定，然后對得到真蜂蜜樣品與待測蜂蜜樣品的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，最后應(yīng)用多元統(tǒng)計分析方法主成分分析(pca)模型區(qū)分真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜。

不同蜜源蜂蜜的性質(zhì)和化學(xué)組成差別較大，根據(jù)不同的蜜源蜂蜜鑒別摻假的方法也是多種多樣。本發(fā)明人經(jīng)過篩選得到該應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法判別真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜的分析方法較優(yōu)先適用于荊條蜜、洋槐蜜和棗花蜜的糖漿摻假。

本發(fā)明的分析方法對于摻假蜂蜜所用的糖漿并沒有特別限定，涵蓋目前摻假所用的c3、c4糖漿所有種類，包括：大米糖漿、玉米糖漿、甜菜糖漿、復(fù)合果葡糖漿、網(wǎng)購蜂蜜專用糖漿或其它糖漿。

作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明中樣品前處理中采用的有機溶劑是含有甲酸的甲醇和水的混合溶劑，其中，優(yōu)選的，甲酸的體積分數(shù)為1％，甲醇和水為等體積混合形成混合溶劑。

作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明中的樣品前處理過程包括：將樣品與有機溶劑混合至樣品完全溶解，超聲，離心，過有機濾膜，得到可上機檢測的樣品。其中，超聲時間為10～30min，優(yōu)選25min；離心條件：800～1200rpm離心4～8min，優(yōu)選1000rpm離心5min；有機濾膜的孔徑為0.20～0.25μm，優(yōu)選0.22μm；為保證樣品中代謝物提取效果較好，樣品與有機溶劑的添加比例為1g：(15～25)ml。

在整個前處理過程，為了保證盡可能多的獲取蜂蜜樣品以及糖漿摻假蜂蜜樣品的代謝物信息，提取試劑優(yōu)先選用的是甲醇和水的混合溶劑(含少量甲酸)對測試樣品進行溶解，超聲后離心過有機濾膜即可上機檢測，前處理步驟簡單，易于操作。

色譜的分離和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集是同時進行的，為了使每個組分都得到分離和鑒定，必須選擇合適的色譜和質(zhì)譜分析條件。

本發(fā)明針對蜂蜜樣品以及糖漿摻假蜂蜜組分的特點，考察了超高效液相色譜中的流動相、梯度洗脫流程、柱溫和進樣量等條件對分離效率和分析速度的影響，最終優(yōu)化篩選得到一組使得分析樣品得到最佳分離效果的超高效液相色譜條件。

作為一種優(yōu)選方案，超高效液相色譜條件為：采用十八烷基鍵合硅膠柱(c18柱)；a相：乙腈，b相：醋酸銨水溶液(優(yōu)選濃度為10mm)，梯度洗脫流程：0-2min1％a，2-3.25min1％-5％a，3.25-4.25min5％a，4.25-7.75min5％-55％a，7.75-9.75min55％-90％a，9.75-11.75min90％a，11.75-12min90％-1％a，12-15min1％a。流速：0.2～0.5ml/min(優(yōu)選0.3ml/min)，柱溫30～37℃(優(yōu)選35℃)，進樣量3微升。

本發(fā)明針對蜂蜜樣品以及糖漿摻假蜂蜜組分的特點，為改善化合物的霧化和電離狀況，提高靈敏度，通過對分辨率、氣體流速、噴霧電壓等條件進行考察，最終優(yōu)化篩選得到一組使得檢測效果準確的四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜條件。

作為一種優(yōu)選方案，四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜選用thermofisherqexactivemassspectrometer，正譜條件為：分辨率，70000(fwhm)；鞘氣流速，40個單位；輔助氣流速，10個單位；反吹氣流速，0個單位；噴霧電壓，3.5kv；毛細管溫度，320℃；輔助氣溫度，350℃。掃描范圍，m/z：70-1050。掃描模式：fullms(全掃描)。

應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)可以測定許多內(nèi)源性化合物的定性/定量信息。這些信息在輸出的譜圖上表現(xiàn)為許多信號峰，在色譜質(zhì)譜圖上表現(xiàn)為不同保留時間出現(xiàn)色譜峰。

對得到的真蜂蜜樣品和待測蜂蜜樣品的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，得到各個峰的保留時間、峰高、峰面積和質(zhì)荷比數(shù)據(jù)。目前可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種軟件對于原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，對于軟件的種類并沒有特別的限定，這些軟件對總離子流圖具有數(shù)據(jù)處理的功能。

從處理效果和方便性來講，作為一種優(yōu)選方案，對得到的真蜂蜜樣品和待測蜂蜜樣品的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)采用compoundsdiscoverer軟件進行預(yù)處理，該預(yù)處理是指對總離子流圖原始數(shù)據(jù)中的色譜峰的提取、峰對齊、去噪音、未知物的檢測等處理，得到各個峰的保留時間、峰高、峰面積和質(zhì)荷比數(shù)據(jù)；然后通過多元統(tǒng)計分析方法pca得分圖的形式對區(qū)分結(jié)果進行展示。

其中，compoundsdiscoverer軟件是賽默飛世爾科技有限公司研制的一種處理lc-ms原始數(shù)據(jù)的軟件。

為了進一步的準確鑒別糖漿摻假蜂蜜中的糖漿的類型，本發(fā)明的第二個目的是提供一種基于上述分析方法篩選區(qū)別于糖漿摻假蜂蜜的真蜂蜜標志性代謝物的方法，該方法能夠篩選出真蜂蜜與糖漿的差異代謝物，然后只需對這些差異代謝物進行進一步確認，避免了對所有樣品中的代謝物進行統(tǒng)計和分析的麻煩，這樣提高了分析準確性和分析效率；對差異性代謝物的研究和分析為深入研究樣品的內(nèi)在差異提供重要信息；進一步的，這還為以后建立鑒別真假蜂蜜的通用模型提供了基礎(chǔ)，可用于快速鑒別蜂蜜摻假的樣品類型(摻假的是何種糖漿類型)，不僅分析時間短，還提高了鑒別結(jié)果的準確性和可靠性。

具體包括以下步驟：

對真蜂蜜樣品與糖漿分別采用有機溶劑進行前處理后，應(yīng)用所述的超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜方法實現(xiàn)對前處理后的樣品中的化學(xué)成分的分離與測定，然后對得到真蜂蜜樣品與糖漿的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，最后應(yīng)用多元統(tǒng)計分析方法主成分分析進行差異化合物篩選，確定和鑒定標志性代謝物。

對得到的真蜂蜜樣品與糖漿的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)采用compoundsdiscoverer軟件進行預(yù)處理，該預(yù)處理是指對總離子流圖原始數(shù)據(jù)中的色譜峰的提取、峰對齊、去噪音、未知物的檢測等處理，得到各個峰的保留時間、峰高、峰面積和質(zhì)荷比數(shù)據(jù)，并通過多元統(tǒng)計分析方法主成分分析模型得到pca得分圖和載荷圖，篩選出標志性代謝物，進而鑒定標志性代謝物。

pca得分圖和載荷圖可在compoundsdiscoverer軟件中進行pca分析得到，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)手段，再此不再贅述。

本發(fā)明采用載荷圖篩選差異性代謝物是一種簡單的方法，在獲得載荷圖時，本發(fā)明通過設(shè)定ratio＞20或＜0.5，p值＜0.01，來篩選潛在的標志性代謝物。其中，所述ratio為該代謝物在兩組中的峰面積的比值。

經(jīng)過超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜方法的檢測，發(fā)現(xiàn)蜂蜜中的代謝物非常多，為了便于尋找兩者差異最大的代謝物，本發(fā)明將pca模型中的ratio設(shè)定為大于20，本發(fā)明中的ratio是指真蜂蜜中的某種代謝物的峰面積與糖漿中的該種代謝物的峰面積的比值，經(jīng)過這樣的設(shè)定，能夠快速篩選兩者的差異性較大的代謝物。對篩選出來的潛在的標志性代謝物首先進行假陽性離子的排除，所述假陽性離子為返回總離子流圖中提取不到色譜峰的物質(zhì)；獲得陽離子模式下的標志性代謝物信息，包括分子式，分子離子準確質(zhì)量數(shù)以及保留時間等，準確質(zhì)量數(shù)的最大偏差在5ppm以內(nèi)，保留時間偏差在0.2分鐘內(nèi)；同樣的，根據(jù)獲得的分子式，在陰離子模式下對潛在的標志性代謝物的分子離子進行提取，并根據(jù)陰陽離子模式下分子離子峰單位準確質(zhì)量數(shù)對潛在的標志性代謝物進行推測，最終獲得區(qū)別于糖漿摻假蜂蜜的真蜂蜜標志性代謝物。

在鑒定標志性代謝物時，通過四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜的二級質(zhì)譜設(shè)定高能碰撞誘導(dǎo)裂解技術(shù)(hcd)的高能碰撞池三個能量級來尋找標志性代謝物的碎片離子，從而實現(xiàn)對真蜂蜜樣本標志性代謝物的鑒定分析。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

(1)用代謝組學(xué)方法結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以實現(xiàn)對蜂蜜和糖漿中的幾乎全部的代謝物信息進行獲取。

本發(fā)明的分析方法不同于之前的對蜂蜜摻假進行測定的方法，只針對某一種或者某幾種常規(guī)化合物進行定性定量檢測來判斷摻假，這就會導(dǎo)致不法分子會根據(jù)最新出臺的蜂蜜摻假方法來對摻假技術(shù)進行調(diào)整。而本發(fā)明的方法是在對真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜的代謝物信息進行一個全面的獲取后，結(jié)合多元統(tǒng)計分析，對蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜進行全面分析，建立模型，完成對糖漿摻假蜂蜜的檢測。

采用本發(fā)明的分析方法能夠有效區(qū)分真蜂蜜和糖漿摻假蜂蜜，結(jié)果以pca得分圖的形式展示，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠直觀的判別其真假情況，無需再進行相關(guān)驗證和分析，可以得到真假結(jié)論，檢測結(jié)果準確可靠。

(2)蜂蜜樣品前處理方法簡單快捷，方法建立后對檢測人員操作技術(shù)要求較低。

在整個前處理過程，為了保證盡可能多的獲取蜂蜜樣品以及糖漿摻假蜂蜜樣品的代謝物信息，提取試劑用的是甲醇和水的混合溶劑(含甲酸)對測試樣品進行溶解，超聲后離心過有機濾膜即可上機檢測，前處理步驟簡單，易于操作。經(jīng)過實驗驗證，不合適的前處理方法不能最大限度地提取真蜂蜜的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，將會造成不容易區(qū)分的檢測結(jié)果，使得檢測結(jié)果不準確。

(3)檢測模型建立后，可用于對糖漿摻假蜂蜜樣品進行批量檢測。

上機檢測后的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過compoundsdiscoverer軟件對蜂蜜樣品與糖漿摻假蜂蜜樣品進行總離子流圖色譜峰的提取、峰對齊、去噪音、未知物的檢測等差異性分析，最后通過多元統(tǒng)計分析pca圖的形式對區(qū)分結(jié)果進行展示。此檢測方法建立后，對于未知的糖漿摻假蜂蜜樣品與真蜂蜜的區(qū)分可按相同流程進行操作。

(4)優(yōu)于其他檢測方法，不需要對某一或某些靶向物質(zhì)進行定性定量測定，是一種宏觀非靶向的種類區(qū)分的方法。

附圖說明

構(gòu)成本發(fā)明的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。

圖1是荊條蜜與摻假1％、5％、10％大米糖漿，1％玉米糖漿，1％甜菜糖漿，1％蜂蜜專用糖漿摻假荊條蜜的pca得分圖。

圖2是洋槐蜜與摻假1％、5％、10％大米糖漿，1％玉米糖漿，1％甜菜糖漿，1％蜂蜜專用糖漿摻假洋槐蜜的pca得分圖。

圖3是棗花蜜與摻假1％、5％、10％大米糖漿，1％玉米糖漿，1％甜菜糖漿，1％蜂蜜專用糖漿摻假棗花蜜的pca得分圖。

圖4是陽離子模式下荊條蜜樣本與f55大米糖漿樣本總離子流圖。

圖5是荊條蜜樣本組與糖漿樣本組pca得分圖。

圖6是荊條蜜樣本組與糖漿樣本組載荷圖。

圖7是篩選后荊條蜜樣本組與糖漿樣本組載荷圖。

圖8是陽離子模式下洋槐蜜樣本與f55大米糖漿樣本總離子流圖。

圖9是洋槐蜜樣本組與糖漿樣本組pca得分圖。

圖10是洋槐蜜樣本組與糖漿樣本組載荷圖。

圖11是篩選后的洋槐蜜樣本組與糖漿樣本組載荷圖。

圖12是陽離子模式下棗花蜜樣本與f55大米糖漿樣本總離子流圖。

圖13是棗花蜜樣本與糖漿樣本pca得分圖。

圖14是棗花蜜樣本與糖漿樣本載荷圖。

圖15是篩選后的棗花蜜樣本與糖漿樣本載荷圖。

圖16a、圖16b、圖16c是苯丙氨酸的碎片離子質(zhì)譜圖。

圖17a、圖17b是亮氨酸碎片離子質(zhì)譜圖。

具體實施方式

應(yīng)該指出，以下詳細說明都是示例性的，旨在對本發(fā)明提供進一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當理解的是，當在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。

術(shù)語解釋：

多元統(tǒng)計分析方法是建立在多元統(tǒng)計分布基礎(chǔ)上的一類處理多元統(tǒng)計數(shù)據(jù)方法的總稱，是統(tǒng)計學(xué)中的具有豐富理論成果和眾多應(yīng)用方法的重要分支。常用的多元統(tǒng)計分析方法主要包括：多元回歸分析、聚類分析、判別分析、主成分分析、因子分析、對應(yīng)分析、典型相關(guān)分析等。本發(fā)明主要采用主成分分析法。

儀器與設(shè)備：

acquityuplcbehc18分析柱美國waters公司(2.1×75mm,1.7μm)；

thermoscientificqexactivethermoscientifictmultimate3000美國thermofisher公司；

sigma3-18k高速冷凍離心機德國sigma公司；

milli-q-a-11超純水機密理博公司；

超聲波清洗機寧波新芝生物科技有限公司；

ikams3basic渦旋混合器ika公司；

材料與試劑：

真蜂蜜不同蜂農(nóng)處收集；

糖漿山東省食品藥品檢驗院；

超純水milli-q-a-11；

乙腈賽默飛世爾科技有限公司；

甲醇賽默飛世爾科技有限公司；

無水甲酸天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實施例詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實施例1

(1)本發(fā)明的方法原理：

對真蜂蜜樣品與糖漿摻假蜂蜜樣品用相同的前處理方法處理后，應(yīng)用uhplc串聯(lián)thermofisherqexactivemassspectrometer儀器實現(xiàn)對樣品中化學(xué)成分的分離與測定，應(yīng)用compoundsdiscoverer軟件對儀器獲得原始數(shù)據(jù)進行色譜峰的提取，峰對齊以及未知化合物的搜庫分析。應(yīng)用多元統(tǒng)計分析pca分析區(qū)分真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜。

(2)樣品前處理

稱取1g蜂蜜樣品(一個樣品的重復(fù)次數(shù)為6次)于50ml離心管中，加入20ml提取劑(提取劑為含1％甲酸的甲醇與超純水等體積混合)，渦旋混合至蜂蜜樣品完全溶解，將離心管置于超聲清洗機中超聲25分鐘，1000rpm離心5分鐘，將上清液用0.22μm有機濾膜過濾以備上樣。

分別稱取0.99g，0.95g，0.90g蜂蜜樣品(一個樣品的重復(fù)次數(shù)為6次)于50ml離心管中，分別稱取0.1g，0.5g，1g糖漿樣品于100ml錐形瓶中，蜂蜜樣品中加入19ml提取劑(提取劑為含1％甲酸的甲醇與超純水等體積混合)，糖漿樣品中加入10ml提取劑，混勻溶解后，再分別取1ml加入到蜂蜜樣品中做人為摻假蜂蜜，渦旋混合至蜂蜜樣品完全溶解，將離心管置于超聲清洗機中超聲25分鐘，1000rpm離心5分鐘，將上清液用0.22μm有機濾膜過濾以備上樣。

(3)應(yīng)用uhplc串聯(lián)thermofisherqexactivemassspectrometer儀器實現(xiàn)對樣品中化學(xué)成分的分離與測定。

色譜條件：

a相：乙腈，b相：10mm醋酸銨水溶液，梯度洗脫流程：0-2min1％a,2-3.25min1％-5％a，3.25-4.25min5％a,4.25-7.75min5％-55％a，7.75-9.75min55％-90％a，9.75-11.75min90％a，11.75-12min90％-1％a,12-15min1％a。流速：0.3ml/min，柱溫35攝氏度，進樣量3微升。

質(zhì)譜條件：

正譜條件：分辨率，70000；鞘氣流速，40個單位；輔助氣流速，10個單位；反吹氣流速，0個單位；噴霧電壓，3.5kv；毛細管溫度，320℃；輔助氣溫度，350℃。掃描范圍，m/z：70-1050。掃描模式：fullms。

(4)數(shù)據(jù)處理與多元統(tǒng)計分析：

對得到的真蜂蜜樣品和糖漿摻假蜂蜜樣品的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)采用compoundsdiscoverer軟件進行預(yù)處理，該預(yù)處理是指對總離子流圖原始數(shù)據(jù)中的色譜峰的提取，峰對齊，去噪音，未知物的檢測等處理，得到各個峰的保留時間、峰高、峰面積和質(zhì)荷比數(shù)據(jù)，然后通過多元統(tǒng)計分析方法pca得分圖的形式對區(qū)分結(jié)果進行展示。

pca得分圖是pca模型的一種分布圖，由于pca分析是建立在同一個數(shù)據(jù)集x基礎(chǔ)上，經(jīng)過投影方法計算pca第一主成分后，可以得到各個樣品點在第一個主成分的得分t1，再得到各個樣品點的第二個主成分上的得分t2，比如圖1～圖3。各個樣品在各個主成分的得分就是其在計算的數(shù)學(xué)模型中的空間坐標，自然也就決定了其在模型中的具體位置，并直接反映各個樣品在數(shù)學(xué)模型空間中的分布情況。

(5)不同應(yīng)用對象的成果展示：

1)樣品為荊條蜜(采用的樣品個數(shù)是12個，從不同蜂農(nóng)處收集，每個樣品重復(fù)6次試驗)，糖漿為大米糖漿、玉米糖漿、甜菜糖漿、網(wǎng)購蜂蜜專用糖漿，按照(1)～(4)的流程進行操作，得到荊條蜜與摻假1％、5％、10％大米糖漿，1％玉米糖漿，1％甜菜糖漿，1％網(wǎng)購蜂蜜專用糖漿摻假荊條蜜的區(qū)分。

結(jié)果如圖1所示，pca得分圖中，1r、5r、10r、1c、1b、1h分別表示的是摻假1％、5％、10％大米糖漿的摻假荊條蜜，摻假1％玉米糖漿的摻假荊條蜜，摻假1％甜菜糖漿的摻假荊條蜂蜜，摻假1％蜂蜜專用糖漿的摻假荊條蜂蜜。從pca得分圖可以看出各個樣品的聚集、離散程度，每一個點代表一個樣品，其中，荊條蜜包括12個樣品(每個樣品六次重復(fù)，只選取了該樣品的其中一次在圖1中進行說明)，該12個樣品點全部相對集中在圖1中的坐標軸的右上部分，這說明這12個真荊條蜜樣品含有的代謝物組成和濃度很接近，組內(nèi)差異較小，而與其他糖漿摻假的荊條蜜的樣品點距離很大，這說明真荊條蜜樣品含有的代謝物組成和濃度與糖漿摻假蜂蜜區(qū)別較大，采用該方法可以有效區(qū)分真荊條蜜與糖漿摻假蜂蜜，這個結(jié)果非常顯而易見；1r、5r、10r、1c、1b、1h均包括3個樣品(每個樣品六次重復(fù)，只選取了該樣品的其中一次在圖1中進行說明)，在圖1中顯示的是三個點，從圖中可以看出，有些糖漿摻假的荊條蜜可以很明顯的區(qū)分開，比如1r、5r、1c和10r、1h、1b兩組的樣品點遠離程度大，能夠有效區(qū)分。而有些糖漿摻假的荊條蜜并不能有效區(qū)分，如圖1所示，1r、5r、1c樣品點大致集中在左上部分；10r、1h、1b樣品點全部集中在右下部分，并且樣品點距離很近，無法有效區(qū)別，而10r和1h、1b的差異較大，至少從摻假含量來看，差異還是比較大的，但是10r和1h、1b卻無法有效區(qū)分，從這點可以看出，即使兩種不同的樣品采用該代謝組學(xué)方法也不一定能夠有效區(qū)分，這也就是說，針對兩種樣品，本領(lǐng)域技術(shù)人員也并不能有效預(yù)期采用代謝組學(xué)的方法能否有效區(qū)分。綜上，經(jīng)過圖1可得，本方法能將真荊條蜜與摻假1％、5％、10％大米糖漿的摻假荊條蜜，摻假1％玉米糖漿的摻假荊條蜜，摻假1％甜菜糖漿的摻假荊條蜜，摻假1％蜂蜜專用糖漿的摻假荊條蜜進行很好的區(qū)分。

2)樣品為洋槐蜜(采用的樣品個數(shù)是15個，從不同蜂農(nóng)處收集，每個樣品重復(fù)6次試驗)，糖漿為大米糖漿、玉米糖漿、甜菜糖漿、網(wǎng)購蜂蜜專用糖漿，按照(1)～(4)的流程進行操作，得到洋槐蜜與摻假1％、5％、10％大米糖漿，1％玉米糖漿，1％甜菜糖漿，1％蜂蜜專用糖漿摻假洋槐蜜的區(qū)分。

結(jié)果如圖2所示，pca得分圖中，1r、5r、10r、1c、1b、1h分別表示的是摻假1％、5％、10％大米糖漿的摻假洋槐蜜，摻假1％玉米糖漿的摻假洋槐蜜，摻假1％甜菜糖漿的摻假洋槐蜜，摻假1％蜂蜜專用糖漿的摻假洋槐蜜。從pca得分圖可以看出各個樣品的聚集、離散程度，每一個點代表一個樣品，其中，洋槐蜜包括15個樣品(每個樣品六次重復(fù)，只選取了該樣品的其中一次在圖2中進行說明)，該15個樣品點全部相對集中在圖2中的左下部分，這說明這15個真洋槐蜜樣品含有的分子的組成和濃度很接近，組內(nèi)差異較小，而與其他糖漿摻假的洋槐蜜的樣品點距離很大，這說明真洋槐蜜樣品含有的分子組成和濃度與糖漿摻假蜂蜜區(qū)別較大，采用該方法可以有效區(qū)分真洋槐蜜與糖漿摻假蜂蜜，這個結(jié)果非常顯而易見；1r、5r、10r、1c、1h均包括3個樣品，1b包括2個樣品(每個樣品六次重復(fù)，只選取了該樣品的其中一次在圖2中進行說明)，在圖2中顯示的是三個點(1r、5r、10r、1c、1h)或兩個點(1b)，從圖中可以看出，有些糖漿摻假的洋槐蜜可以很明顯的區(qū)分開，比如1r、5r和1c、10r、1h、1b兩組的樣品點遠離程度大，能夠有效區(qū)分。而有些糖漿摻假的洋槐蜜并不能有效區(qū)分，如圖2所示，10r、1h、1b樣品點全部集中在右下部分，并且樣品點距離很近，無法直觀有效區(qū)分，而10r和1h、1b的差異較大，至少從摻假含量來看，差異還是比較大的，但是10r和1h、1b卻無法直觀有效區(qū)分，從這點可以看出，即使兩種差異較大的樣品采用該代謝組學(xué)方法也不一定能夠有效區(qū)分。

綜上，經(jīng)過圖2可得，本方法能將真洋槐蜜與摻假1％、5％、10％大米糖漿的摻假洋槐蜜，摻假1％玉米糖漿的摻假洋槐蜜，摻假1％甜菜糖漿的摻假洋槐蜜，摻假1％蜂蜜專用糖漿的摻假洋槐蜜進行很好的區(qū)分。

3)樣品為棗花蜜(采用的樣品個數(shù)是5個，從同蜂農(nóng)處收集，每個樣品重復(fù)6次試驗)，糖漿為大米糖漿、玉米糖漿、甜菜糖漿、網(wǎng)購蜂蜜專用糖漿，按照(1)～(4)的流程進行操作，得到棗花蜜與摻假1％、5％、10％大米糖漿，1％玉米糖漿，1％甜菜糖漿，1％蜂蜜專用糖漿摻假棗花蜜的區(qū)分。

結(jié)果如圖3所示，pca得分圖中，1r、5r、10r、1c、1b、1h分別表示的是摻假1％、5％、10％大米糖漿的摻假棗花蜜，摻假1％玉米糖漿的摻假棗花蜜，摻假1％甜菜糖漿的摻假棗花蜜，摻假1％蜂蜜專用糖漿的摻假棗花蜜。從pca得分圖可以看出各個樣品的聚集、離散程度，每一個點代表一個樣品，其中，棗花蜜包括5個樣品(每個樣品六次重復(fù)，只選取了該樣品的其中一次在圖3中進行說明)，該5個樣品點全部集中在圖3中的左下區(qū)域的靠左部分，這說明這5個真棗花蜜樣品含有的分子的組成和濃度很接近，而與其他糖漿摻假的棗花蜜的樣品點距離很大，這說明真棗花蜜樣品含有的分子組成和濃度與糖漿摻假蜂蜜區(qū)別較大，采用該方法可以有效區(qū)分真棗花蜜與糖漿摻假蜂蜜，這個結(jié)果相對顯而易見；1r、5r、10r、1c、1h、1b均包括3個樣品(每個樣品六次重復(fù)，只選取了該樣品的其中一次在圖3中進行說明)，在圖3中顯示的是三個點(1r、5r、10r、1c、1h)，從圖中可以看出，有些糖漿摻假的棗花蜜可以很明顯的區(qū)分開，比如1c和10r、1h、1b兩組的樣品點遠離程度大，能夠有效區(qū)分。而有些糖漿摻假的棗花蜜并不能有效區(qū)分，如圖3所示，10r、1h、1b樣品點全部集中在右下部分，并且樣品點距離很近，無法直觀有效區(qū)分，而10r和1h、1b的摻假含量差異較大，但是10r和1h、1b卻無法直觀有效區(qū)分，從這點可以看出，即使兩種差異較大的樣品采用該代謝組學(xué)方法也不一定能夠有效區(qū)分。

綜上，經(jīng)過圖3可得，本方法能將真棗花蜜與摻假1％、5％、10％大米糖漿的摻假棗花蜜，摻假1％玉米糖漿的摻假棗花蜜，摻假1％甜菜糖漿的摻假棗花蜜，摻假1％蜂蜜專用糖漿的摻假棗花蜜進行很好的區(qū)分。

實施例2

基于uhplc串聯(lián)thermofisherqexactivemassspectrometer結(jié)合代謝組學(xué)方法篩選真蜂蜜標志性代謝物的方法，包括以下步驟：

(1)樣品前處理

將1g真蜂蜜樣品于50ml離心管中，加入20ml提取劑(提取劑為含1％甲酸的甲醇與超純水等體積混合)，渦旋混合至蜂蜜樣品完全溶解，將離心管置于超聲清洗機中超聲25分鐘，1000rpm離心5分鐘，將上清液用0.22μm有機濾膜過濾以備上樣。

將1g糖漿樣品于50ml離心管中，加入20ml提取劑(提取劑為含1％甲酸的甲醇與超純水等體積混合)，渦旋混合至糖漿樣品完全溶解，將離心管置于超聲清洗機中超聲25分鐘，1000rpm離心5分鐘，將上清液用0.22μm有機濾膜過濾以備上樣。

其中，所述真蜂蜜的種類并沒有特別限定，但是基于鑒別和篩選效果來講，真蜂蜜樣品為荊條蜜、洋槐蜜和棗花蜜；所述糖漿并沒有特別限定，涵蓋目前摻假所用的c3、c4糖漿所有種類，包括：大米糖漿、玉米糖漿、甜菜糖漿、復(fù)合果葡糖漿、網(wǎng)購蜂蜜專用糖漿或其它糖漿。

(2)應(yīng)用uhplc串聯(lián)thermofisherqexactivemassspectrometer儀器實現(xiàn)對樣品中化學(xué)成分的分離與測定。其中，色譜條件與實施例1中的相同，質(zhì)譜條件如下所述：

一級質(zhì)譜條件：

負譜條件：分辨率，70000(fwhm)；鞘氣，40個單位；輔助氣，10個單位；反吹氣，0個單位；噴霧電壓，2.8kv；毛細管溫度，320℃；輔助氣溫度，350℃。掃描范圍，m/z：70-1050。掃描模式：fullms。

正譜條件：分辨率，70000(fwhm)；鞘氣，40個單位；輔助氣，10個單位；反吹氣，0個單位；噴霧電壓，3.5kv；毛細管溫度，320℃；輔助氣溫度，350℃。掃描范圍，m/z：70-1050。掃描模式：fullms。

二級質(zhì)譜條件：

正譜條件：分辨率，175000(fwhm)；鞘氣，40個單位；輔助氣，10個單位；反吹氣，0個單位；噴霧電壓，3.5kv；毛細管溫度，320℃；輔助氣溫度，350℃。掃描范圍，m/z：70-1050。hcd高能碰撞池能量,50、100、150。掃描模式：fullmss。

(3)數(shù)據(jù)處理與多元統(tǒng)計分析

對得到的真蜂蜜樣品與糖漿的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)采用compoundsdiscoverer軟件進行預(yù)處理，該預(yù)處理是指進行總離子流圖色譜峰的提取，峰對齊，去噪音，未知物的檢測等處理，并通過多元統(tǒng)計分析方法得到pca得分圖和載荷圖，進而篩選出標志性代謝物。

pca得分圖和載荷圖是pca模型分析得到的兩種分布圖。載荷圖表示了所檢測的變量(如質(zhì)荷比)的分布情況，載荷圖中的變量分布與得分圖中樣品的分布和位置相對應(yīng)。

(4)不同應(yīng)用對象的具體操作方法：

1)樣品為荊條蜜(采用的樣品個數(shù)是12個，從不同蜂農(nóng)處收集，每個樣品重復(fù)6次試驗)和f55大米糖漿(采用的樣品個數(shù)是12個，每個樣品重復(fù)6次試驗)：

按照(1)～(3)的流程進行操作，經(jīng)過質(zhì)譜檢測后，獲得荊條蜜樣本和f55大米糖漿樣本的總離子流圖，如圖4所示，在陽離子模式下在保留時間2-7分鐘以及9-13分鐘荊條蜜樣本與f55大米糖漿也有顯著的不同，荊條蜜總離子流圖出峰總數(shù)大于f55大米糖漿總離子流圖出峰總數(shù)，說明荊條蜜與糖漿相比可能含有更多的代謝物。具體差異物質(zhì)的尋找還需要進行進一步分析。在compoundsdiscoverer軟件中進行pca分析，圖5為荊條蜜樣本組和糖漿樣本組的pca得分圖，在得分圖中，荊條蜜樣本組(右半部分的點)與糖漿樣本組(左半部分的點)在第一主成分上就可以實現(xiàn)很好地分離，說明荊條蜜樣本與糖漿樣本代謝物存在很大的差異，這也為我們實驗下一步尋找荊條蜜樣本的標志性代謝物工作提供了實驗數(shù)據(jù)依據(jù)，也證明了本發(fā)明的試驗方法用于鑒別真假蜂蜜的可行性，因為目前蜂蜜摻假常用的方法是通過摻入糖漿來造假，本研究所用的糖漿樣本組包括大米糖漿、玉米糖漿、甜菜糖漿、復(fù)合果葡糖漿、網(wǎng)購蜂蜜專用糖漿，涵蓋目前摻假所用的c3、c4糖漿所有種類。本研究方法數(shù)據(jù)分析獲得的pca得分圖可以將荊條蜜樣本組和糖漿樣本組進行完全分離，也說明了試驗方法能夠?qū)⑶G條蜜與假蜂蜜進行區(qū)分的可行性，荊條蜜樣本組與糖漿樣本組代謝物存在很大差異，圖6為荊條蜜樣本組與糖漿樣本組的載荷圖，圖中的每個點代表通過compoundsdiscoverer軟件分析從荊條蜜與糖漿樣本組中提取出的一種代謝物(所有樣品的代謝物)，從圖6可以看出荊條蜜樣本組提取的代謝物要多于糖漿樣本組，通過對圖6的載荷圖上的代謝物進行篩選，來尋找荊條蜜樣本組的標志性代謝物。通常來說設(shè)置ratio值＞20或者＜0.5，p值＜0.01篩選到的物質(zhì)就可以作為差異代謝物，其中每一種代謝物的ratio值為該代謝物在兩組中的平均峰面積的比值，但考慮到提取到的代謝物個數(shù)龐大，且研究的目的是尋找差異最大的物質(zhì)，在差異代謝物的尋找步驟中，將ratio值設(shè)為＞20或者＜0.5，p值＜0.01來尋找荊條蜜樣本組標志性代謝物。如圖7為經(jīng)過篩選后的載荷圖，載荷圖需要結(jié)合pca得分圖來進行分析，pca得分圖上各組對應(yīng)的位置，相應(yīng)的就是載荷圖上個點的組別歸屬，在圖5的pca得分圖中荊條蜜樣本組位于第一主成分的右半部分，那么對應(yīng)圖7篩選后的載荷圖中，就可以從篩選出的右半部分的點中來尋找荊條蜜樣本組的差異性代謝物。對篩選出的物質(zhì)首先進行假陽性離子的排除，假陽性離子為返回總離子流圖中提取不到色譜峰的物質(zhì)，獲得陽離子模式下的標志性代謝物信息，包括分子式，分子離子準確質(zhì)量數(shù)以及保留時間等，準確質(zhì)量數(shù)的最大偏差在5ppm以內(nèi)，保留時間偏差在0.2分鐘內(nèi)，同樣的根據(jù)獲得的分子式，在陰離子模式下對標志物的分子離子進行提取，并根據(jù)陰陽離子模式下分子離子峰單位準確質(zhì)量數(shù)對標志物進行推測，最終獲得的可能的荊條蜜樣本標志性代謝物有苯丙氨酸、亮氨酸、泛酸、對香豆酸、肉桂酸、白楊素、酪氨酸。如表1為荊條蜜樣本標志性代謝物完整信息。其中，本發(fā)明中的陰陽離子模式條件：色譜條件相同，質(zhì)譜條件包括正譜條件和負譜條件。

表1荊條蜜樣本標志性代謝物分子離子信息表

表中上標1為[m+nh4]+，上標2為[m+h-h2o]+

荊條蜜標志性代謝物的鑒定

根據(jù)一級質(zhì)譜全掃模式給出的信息，找出荊條蜜樣本可能的標志性代謝物，為了對這七種物質(zhì)進行進一步確定，通過二級質(zhì)譜設(shè)定hcd高能碰撞池三個能量級來尋找標志性代謝物的碎片離子，從而實現(xiàn)對找到的荊條蜜樣本標志性代謝物的定性分析。如表1為荊條蜜樣本標志性代謝物的碎片離子信息表，在設(shè)定的hcd高能碰撞池三個能量下，每種標志性代謝物都找到了至少一個碎片離子，那么每種荊條蜜標志性代謝物正負離子模式下的兩個分子離子和一個碎片離子得分為5分，已經(jīng)滿足歐盟的一個分析物定性至少要達到4分以上的要求，一個分子離子得1分，高分辨質(zhì)譜一個碎片離子得3分。可以對找到的標志物進行定性，最終確定荊條蜜樣本的標志性代謝物為苯丙氨酸、亮氨酸、泛酸、對香豆酸、肉桂酸、白楊素、酪氨酸。通過四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜的二級質(zhì)譜設(shè)定高能碰撞誘導(dǎo)裂解技術(shù)(hcd)可獲得荊條蜜標志性代謝物hcd高能碰撞池在設(shè)定的三個不同能量下獲得的碎片離子質(zhì)譜圖，其中苯丙氨酸一共獲得三個碎片離子見圖16a、圖16b和圖16c，在hcd能量設(shè)定為50時獲得質(zhì)核比為120.08075的碎片離子，是苯丙氨酸分子離子失去一個羧基獲得的碎片離子；在hcd能量設(shè)定為100時獲得質(zhì)核比為103.05440的碎片離子，是苯丙氨酸分子離子失去一個羧基和氨基后得到的碎片離子；在hcd能量設(shè)定為150時獲得質(zhì)核比為79.05478的碎片離子，苯丙氨酸中的苯環(huán)基團的碎片離子。亮氨酸獲得兩個碎片離子如圖17a和圖17b，在hcd能量設(shè)定為50時獲得質(zhì)核比為86.09689的碎片離子，是亮氨酸分子離子失去一個羧基后得到的碎片離子；hcd能量設(shè)定100獲得質(zhì)核比為69.07057的碎片離子，為亮氨酸失去一個羧基和氨基后得到的碎片離子。泛酸在hcd能量設(shè)定為50時獲得一個失去一個羥基和氨基丙酸基團后的碎片離子，質(zhì)核比為116.03441。對香豆酸僅在hcd能量設(shè)定為50時就獲得4個碎片離子，質(zhì)核比分別為120.05233、109.06503、95.04947、73.02895，分別是失去一個羧基后的碎片離子、分子離子從雙鍵處斷裂后的碎片離子、苯酚基團碎片離子、丙烯酸基團碎片離子。肉桂酸在hcd設(shè)定50時獲得兩個碎片離子，分別是丙烯酸支鏈雙鍵處斷裂后碎片離子質(zhì)核比為91.05464，質(zhì)核比104.05780的碎片離子為掉一個羧基后的碎片離子；肉桂酸在hcd設(shè)定為150時獲得的碎片離子，準確質(zhì)量數(shù)為79.05458，是苯環(huán)基團的碎片離子。白楊素在hcd能量設(shè)定為50時獲得質(zhì)核比為147.04364的碎片離子，是白楊素分子離子失去一個苯環(huán)和兩個羥基后的碎片離子。酪氨酸在hcd能量設(shè)定為50和150時分別獲得兩個和一個碎片離子，質(zhì)核比為136.07545的碎片離子為掉一個羧基后的碎片離子，119.04916為掉一個羧基和氨基后的碎片離子，95.04958為苯酚集團碎片離子。

表2荊條蜜標志性代謝物碎片離子信息表

2)樣品為洋槐蜜(采用的樣品個數(shù)是15個，從不同蜂農(nóng)處收集，每個樣品重復(fù)6次試驗)和f55大米糖漿(采用的樣品個數(shù)是11個，每個樣品重復(fù)6次試驗)：

按照(1)～(3)的流程進行操作，經(jīng)過質(zhì)譜檢測后，獲得洋槐蜜樣本和f55大米糖漿樣本的總離子流圖，如圖8所示，在陽離子模式下，洋槐蜜樣本和f55大米糖漿總離子流圖都有明顯的差異，在陽離子模式下洋槐蜜樣本的總離子流圖出的色譜峰更多更豐富，也說明了蜂蜜樣本比糖漿樣本除了糖之外含有更多種類的代謝物。

圖9為洋槐蜜樣本組與糖漿樣本組pca得分圖，從圖中看出洋槐蜜樣本組(左半部分的點)與糖漿樣本組(右半部分的點)在第一主成分上就能實現(xiàn)完全分離，說明洋槐蜜與糖漿的代謝物組成存在很大的差異，圖10中的每個點表示為通過compoundsdiscoverer軟件分析提取出的洋槐蜜和糖漿中的代謝物(所有樣品的代謝物)，一共提取出580種代謝物，通過設(shè)定ratio＞20或＜0.5，p值＜0.01，對提取出的580種代謝物進行篩選，尋找洋槐蜜與糖漿的差異性代謝物，即洋槐蜜的標志性代謝物。圖11為經(jīng)過篩選后的差異性物質(zhì)，通過對應(yīng)圖9的pca得分圖，在第一主成分左邊部分篩選出的點中來尋找洋槐蜜的標志性代謝物，通過帶入原始總離子流

圖進行假陽性離子剔除，因陽離子模式下進行分子離子的準確質(zhì)量數(shù)匹配，最終找到洋槐蜜潛在的標志性代謝物：色氨酸、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、視黃酸、對香豆酸、脫落酸、肉桂酸、白楊素。表3為洋槐蜜標志性代謝物分子離子信息表。其中準確質(zhì)量數(shù)偏差在5ppm之內(nèi)，保留時間最大偏差在0.2分鐘內(nèi)。

表3洋槐蜜標志性代謝物分子離子信息表

表中上標1為[m+nh4]+，上標2為[m+h-h2o]+

洋槐蜜標志性代謝物的鑒定

對洋槐蜜潛在的標志性代謝物進行定性，hcd高能碰撞池設(shè)定50、100、150三個能量下進行二級碎裂，尋找洋槐蜜標志性代謝物的碎片離子。表4為洋槐蜜標志性代謝物的碎片離子信息表。找到的九個洋槐蜜標志性代謝物中，每個代謝物都至少找到了一個碎片離子，可以確定洋槐蜜的標志性代謝物為色氨酸、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、視黃酸、對香豆酸、脫落酸、肉桂酸、白楊素。通過四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜的二級質(zhì)譜設(shè)定高能碰撞誘導(dǎo)裂解技術(shù)(hcd)可獲得洋槐蜜標志性代謝物碎片離子質(zhì)譜圖。其中色氨酸在hcd能量設(shè)定為50時獲得兩個碎片離子，質(zhì)核比分別為159.09142、118.06522，159.09142是色氨酸分子離子失去一個羧基后的碎片離子，118.06522是掉去氨基丙酸支鏈后的碎片離子。亮氨酸在hcd能量設(shè)定為50和150時分別獲得一個碎片離子，質(zhì)核比為86.09692的離子為掉羧基后形成的碎片離子，質(zhì)核比為69.07056的離子為掉羧基和氨基后形成的碎片離子。酪氨酸在hcd設(shè)定為50時就獲得三個碎片離子，質(zhì)核比分別為136.07545、119.01908、109.06507，分別為是失去羧基后形成的碎片離子，失去羧基和氨基后形成的碎片離子，失去氨基羧甲基基團后的碎片離子；在hcd設(shè)定為100時獲得一個質(zhì)核比為95.04950的碎片離子，是苯酚基團碎片離子。脯氨酸只在hcd能量設(shè)定為100時獲得一個質(zhì)核比為72.04499，失去羧基后的碎片離子。視黃酸在hcd設(shè)定為50和150時各獲得一個碎片離子，質(zhì)核比分別為83.08620、240.23172，是環(huán)己烯基團碎片離子和從羧基端最近的雙鍵處斷裂后形成的碎片離子。對香豆酸在hcd設(shè)定為50時獲得三個碎片離子，質(zhì)核比為79.05478的離子為苯環(huán)基團碎片離子，91.05460為從苯環(huán)上支鏈雙鍵處斷裂形成的碎片離子，104.05782為掉一個羧基后形成的碎片離子。脫落酸在能量設(shè)定為50時獲得兩個碎片離子，質(zhì)核比為137.09534和111.04428，137.09534為掉長支鏈和羥基后形成的碎片離子，111.04428為長支鏈基團形成的碎片離子；hcd能量設(shè)定為150時獲得質(zhì)核比為61.02914乙酸基團碎片離子。肉桂酸在hcd能量設(shè)定50時獲得三個碎片離子，質(zhì)核比為79.05478為苯環(huán)基團碎片離子，91.05460為從苯環(huán)上支鏈雙鍵處斷裂形成的碎片離子，104.05782為掉一個羧基后形成的碎片離子。白楊素僅在hcd能量設(shè)定為50時獲得一個碎片離子，質(zhì)核比為147.04382，為掉苯環(huán)和兩個羥基形成的碎片離子。

表4洋槐蜜標志性代謝物碎片離子信息表

3)樣品為棗花蜜(采用的樣品個數(shù)是5個，從不同蜂農(nóng)處收集，每個樣品重復(fù)6次試驗)和f55大米糖漿(采用的樣品個數(shù)是10個，每個樣品重復(fù)6次試驗)：

按照(1)～(3)的流程進行操作，經(jīng)過質(zhì)譜檢測后，獲得棗花蜜樣本和f55大米糖漿樣本的總離子流圖，如圖12所示，在陽離子模式下，棗花蜜樣本總離子流圖與f55糖漿總離子流圖在2-7分鐘存在很大的差異，具體差異還需要進一步分析。

圖13為棗花蜜樣本組和糖漿樣本組pca得分圖，從圖中可以看出棗花蜜樣本組(右半部分的點)與糖漿樣本組(左半部分的點)在第一主成分上就能實現(xiàn)完全分離，圖12以及13說明棗花蜜樣本組與糖漿樣本組代謝物存在很大差異，圖14為通過compoundsdiscoverer軟件分析后提取出的棗花蜜樣本組與糖漿樣本組的代謝物，每個點表示提取出的一種代謝物(所有樣品的代謝物)，一共提取到631種物質(zhì)。設(shè)定ratio值＞20或＜0.5、p值＜0.01進行差異性代謝物的篩選，圖15為篩選后的差異性代謝物，對應(yīng)圖13棗花蜜樣本組與糖漿樣本組的pca得分圖，圖15中第一主成分有半部分的點為棗花蜜樣本組的差異性代謝物，因此從這些點中尋找棗花蜜樣本的標志性代謝物，將篩選出的點現(xiàn)代回原始總離子流圖進行假陽性離子的排除，在陰陽離子模式下對找到的標志性代謝物分子離子準確質(zhì)量數(shù)進行匹配，最終找到棗花蜜潛在的標志性代謝物：褪黑激素、n-乙酰羥色胺、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、對香豆酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、白楊素。表5為棗花蜜樣本標志性代謝物分子離子信息。

表5棗花蜜樣本標志性代謝物分子離子信息表

表中上標1為[m+nh4]+，上標2為[m+h-h2o]+

棗花蜜標志性代謝物的鑒定

對棗花蜜潛在的標志性代謝物進行定性，hcd高能碰撞池設(shè)定50、100、150三個能量下進行二級碎裂，尋找棗花蜜標志性代謝物的碎片離子。表6為棗花蜜標志性代謝物的碎片離子信息表。棗花蜜樣本的每個標志性代謝物都至少獲得一個碎片離子，可以滿足對代謝物的定性要求，因此棗花蜜樣本的標志性代謝物為：褪黑激素、n-乙酰羥色胺、亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、對香豆酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、白楊素。通過四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜的二級質(zhì)譜設(shè)定高能碰撞誘導(dǎo)裂解技術(shù)(hcd)可獲得棗花蜜標志性代謝物碎片離子的質(zhì)譜圖。其中褪黑激素在hcd高能碰撞池能量設(shè)定為50時獲得兩個碎片離子，質(zhì)核比為86.06047的離子為含有羰基的支鏈形成的碎片離子，118.06503為掉支鏈后獲得的碎片離子。n-乙酰羥色胺在hcd設(shè)定為50時獲得質(zhì)核比144.08087，掉羥基和從支鏈上的仲氨與亞甲基處斷裂后形成的碎片離子；在hcd能量設(shè)定為150時獲得失去支鏈與羥基后的環(huán)狀結(jié)構(gòu)形成的碎片離子，質(zhì)核比為118.06058。亮氨酸在能量設(shè)定為100時獲得兩個碎片離子，質(zhì)核比為86.09691的離子為掉羧基后的碎片離子，69.03431為掉羧基和氨基后的碎片離子。酪氨酸在hcd設(shè)定為50時獲得兩個碎片離子質(zhì)核比為136.07536和109.06509，136.07536為掉羧基后的碎片離子，109.06509為掉氨基羧甲基基團后的碎片離子；在hcd能量設(shè)定為100時獲得質(zhì)核比為95.04945苯酚基團碎片離子。脯氨酸只在hcd能量設(shè)定為50時獲得一個質(zhì)核比為72.08139，為掉羧基后的碎片離子。對香豆酸在hcd能量設(shè)定為50時獲得三個碎片離子，質(zhì)核比分別為109.07584、95.04949、73.02905，其中109.07584為從支鏈上的雙鍵處斷裂后形成的碎片離子，95.04949為苯酚基團碎片離子，73.02901為丙烯酸基團碎片離子。肉桂酸在hcd能量設(shè)定為50時獲得兩個碎片離子，質(zhì)核比分別為104.05772和91.05469，91.05463為甲苯基團碎片離子，121.03979為苯環(huán)上支鏈上的雙鍵處斷裂形成的碎片離子。4-甲氧基肉桂酸在hcd能量設(shè)定為50時也獲得兩個碎片離子，質(zhì)核比分別為121.03979和91.05463，91.05463為甲苯基團碎片離子，121.03979為苯環(huán)上支鏈上的雙鍵處斷裂形成的碎片離子。白楊素在hcd能量設(shè)定為50和100時各獲得一個碎片離子，質(zhì)核比分別為147.04381、79.05477，147.04381為掉苯環(huán)和兩個羥基后的碎片離子，79.05477為苯環(huán)基團碎片離子。

表6棗花蜜標志性代謝物碎片離子信息表

本實施例主要是對真蜂蜜和大米糖漿的代謝物差異進行分析，其他糖漿可采用與本實施例相同的方法進行研究。

本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。