本發(fā)明涉及醫(yī)學中腫瘤標志物檢測領域，具體是利用標記物構建比色免疫傳感器，實現(xiàn)對癌胚抗原的檢測。

背景技術：

腫瘤標記物是腫瘤細胞產(chǎn)生的，含量遠高于正常細胞的特異性物質（w.chen,r.zheng,p.baade,s.zhang,h.zeng,f.bray,a.jemal,x.yu,j.he,ca.cancerj.clin.66(2016)115–132.）。癌胚抗原是目前公認的一種腫瘤標志物，它的臨床檢測在評估病變范圍、預測療效、監(jiān)測復發(fā)等方面具有較高參考價值，檢測cea有助于提高腫瘤患者的診斷率，監(jiān)測腫瘤早期轉移，并可為患者根治性手術后是否進行輔助化療、療效判斷、復發(fā)轉移等具有一定的指導意義，對患者的病情預后判斷有著至關重要的臨床意義?；诳乖?抗體特異性反應的免疫分析法是檢測cea最為常用的方法，最近幾年，多種多樣的免疫分析技術被開發(fā)利用，如光電免疫分析，電化學免疫分析，elisa，表面加強拉曼散射免疫分析，比色免疫分析（a.hlavá?ek,z.farka,m.hübner,v.horňáková,d.něme?ek,r.niessner,p.skládal,d.knopp,h.gorris,anal.chem.88(2016)6011–6017；z.yang,y.cao,j.li,m.lu,z.jiang,x.hu,acsappl.mater.interfaces8(2016)12031–12038；n.zhang,y.ruan,z.ma,w.zhao,j.xu,h.chen,biosens.bioelectron.85(2016)294–299；x.cai,s.weng,r.guo,l.lin,w.chen,z.zheng,z.huang,x.lin,biosens.bioelectron.81(2016)173–180.）等等。其中比色分析方法是一種靈敏度和準確度均很高的分析方法，只需裸眼觀察就可進行半定量分析，結合紫外可見分光光度計能實現(xiàn)微量甚至痕量檢測。由于其價格低廉、設備小型化、操作簡便等優(yōu)點，比色分析方法被廣泛應用于環(huán)境、醫(yī)學、食品檢測等領域，已成為檢測抗生素的有力方法。

傳統(tǒng)的比色分析方法往往需要生物酶和催化底物的參與，但是生物酶的結構容易發(fā)生變化、在生物體內含量很低、儲存條件比較苛刻等因素大大限制了其實際應用。由于納米材料模擬酶對酸、堿、溫度具有較好的穩(wěn)定性且催化活性較高,已成為生命分析化學等相關領域的研究熱點之一。納米材料模擬酶在比色傳感、生物傳感、降解環(huán)境污染物、電化學傳感等方面已顯示出誘人的應用前景（dutta,s.,ray,c.,mallick,s.,sarkar,s.,sahoo,r.,negishi,y.,pal,t.,2015.j.phys.chem.c.119,23790-23800.qin,w.,su,l.,yang,c.,ma,y.,zhang,h.,chen,x.,2014.j.agric.food.chem.62,5827-5834.zhao,h.,dong,y.,jiang,p.,wang,g.,zhang,j.,2015.acsappl.mater.interfaces.7,6451-6461.）。從實際應用的角度考慮,探尋具有高催化活性的、穩(wěn)定的、可重復利用的模擬酶納米材料尤為重要。

盡管如此，模擬酶納米材料在比色分析方法中的應用也需要過氧化氫的參與，為了減小添加底物帶來的誤差，近幾年，一些光催化納米材料也被發(fā)現(xiàn)具有氧化tmb顯色的活性，且不需要過氧化氫的參與，如石墨烯，tio2,agi等（wang,g.,xu,x.,qiu,l.,dong,y.,li,z.,zhang,c.,2014a.acsappl.mater.interfaces.6,6434?6442.wang,g.,xu,x.,wu,x.,cao,g.,dong,y.,li,z.j.,2014b.j.phys.chem.c.118,28109-28117.wang,g.,jin,l.,dong,y.,wu,x.,li,z.,2015.biosens.bioelectron.64,523-529.）。本文選擇制備ag3po4/ag復合納米材料，并用其作為標記物構建比色免疫傳感器，用于cea的檢測。納米材料的制備方法簡單、快速、成本低，以此構建的比色免疫傳感器具有較好的選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是：如何提供一種快速檢測癌胚抗原的比色免疫傳感分析方法，實現(xiàn)對癌胚抗原的檢測，并具有較低的檢測限，且能用于實際血清樣品的檢測。

本發(fā)明所采用的技術方案是：一種快速的檢測癌胚抗原的比色分析方法，按照如下的步驟進行

步驟一、制備ag3po4/ag納米復合材料并將其修飾癌胚抗原抗體，將硝酸銀和乙二醇溶液混合均勻形成第一溶液，將na2hpo4·12h2o和乙二醇溶液混合均勻形成第二溶液，將第一溶液和第二溶液混合均勻后攪拌1-3小時形成第三溶液，第三溶液在160°c油浴條件下攪拌30分鐘，通過離心和清洗，得到ag3po4/ag納米球分散液，將cea抗體加入到ag3po4/ag納米球分散液中，在4°c下孵育8-12小時，磁性分離并清洗得到抗體標記的ag3po4/ag結合物即ab2-ag3po4/ag納米球分散液；

步驟二、制備fe3o4/ag納米復合材料并將其修飾癌胚抗原抗體，將四氧化三鐵和多巴胺加入到二次水中混合均勻，再將硝酸銀加入到該混合溶液中，攪拌5-7小時，通過磁性分離得到沉淀物，經(jīng)清洗后得到fe3o4@ag納米球分散液，將cea抗體加入到fe3o4@ag納米球分散液中，在4°c下孵育8-12小時，磁性分離并清洗得到抗體標記的fe3o4@ag結合物即fe3o4@ag-ab1納米球分散液；

步驟三、將fe3o4@ag-ab1納米球分散液依次孵育不同濃度的癌胚抗原cea30分鐘，然后用水清洗2-5次，再用ab2-ag3po4/ag納米球分散液孵育30分鐘，構建成免疫傳感器，加入abs緩沖液和四甲基聯(lián)苯胺tmb溶液，通過紫外分光光度計檢測tmb的紫外吸收來定量cea的濃度。

作為一種優(yōu)選方式：步驟一中，第一溶液中硝酸銀的量為1-1.8a毫克，乙二醇的量為20-36a毫升，濃度為0.1毫摩爾/升；第二溶液中na2hpo4·12h2o的量為20-36a毫升，質量分數(shù)為0.5%，乙二醇的量為20-36a毫升，濃度為0.1毫摩爾/升；cea抗體的量為20-36a毫升，濃度為0.1毫摩爾/升；步驟二中四氧化三鐵的量為1-1.8a毫克；多巴胺的量為15-27a毫克；二次水的量為8-10a毫升；硝酸銀的量為11-20a毫克；cea抗體的量為500-900a微升，濃度為1毫克/毫升；a為正整數(shù)。

作為一種優(yōu)選方式：步驟三中，依次孵育不同濃度的癌胚抗原cea30分鐘是指依次在濃度為2.5納克/毫升、2納克/毫升、1.5納克/毫升、1納克/毫升、0.8納克/毫升、0.5納克/毫升、0.2納克/毫升的癌胚抗原cea中在室溫下孵育30分鐘。

作為一種優(yōu)選方式：步驟三中，fe3o4@ag-ab1的量為1-1.8b毫升，ab2-ag3po4/ag的量為1-1.8b毫升；abs緩沖液的量為2-3.6b毫升，ph為3；tmb的量為100-180b微升，濃度為5毫摩爾/升，b為正整數(shù)。

作為一種優(yōu)選方式：通過紫外分光光度計檢測tmb的紫外吸收來定量cea的濃度是指，根據(jù)cea濃度與吸光度成線性相關性建立對應的線性方程為y=0.297x+0.176，x是cea的濃度，單位是納克/毫升，y是檢測的吸光度。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明方法利用ag3po4/ag氧化tmb顯色，構建比色免疫傳感器對癌胚抗原進行檢測。此比色免疫分析方法具有較好的靈敏度，并且檢測速度快，準確率高，檢測癌胚抗原有較好的專一性。

附圖說明

圖1是ag3po4/ag復合物透射電子顯微鏡（tem）圖；

圖2是fe3o4@ag復合物透射電子顯微鏡（tem）圖；

圖3是比色免疫分析方法的構建示意圖；

圖4是癌胚抗原的濃度與tmb吸光度的線性圖。

具體實施方式

一種快速的檢測癌胚抗原的比色分析方法，按照如下的步驟進行

步驟一、配置第一溶液：將1-1.8毫克硝酸銀和20-36毫升乙二醇溶液混合均勻，配置第二溶液，將20-36毫升濃度為0.1毫摩爾/升的na2hpo4·12h2o和20-36毫升乙二醇溶液混合均勻，將第一溶液和第二溶液混合均勻攪拌2小時形成第三溶液，第三溶液在160°c油浴條件下攪拌30分鐘，通過離心和清洗，得到ag3po4/ag納米球分散液，其透射電鏡如圖1所示。將500-900微升，濃度為1毫克/毫升的cea抗體加入到該ag3po4/ag納米球分散液中，在4°c下孵育過夜，最后磁性分離清洗得到抗體標記的ag3po4/ag結合物（記為ab2-ag3po4/ag）。

步驟二、將1-1.8毫克四氧化三鐵和15-27毫克多巴胺加入到8-10毫升的二次水中混合均勻，再將11-20毫克硝酸銀加入到該混合溶液中，攪拌6個小時，通過磁性分離得到沉淀物，經(jīng)清洗后得到fe3o4@ag納米球，其透射電鏡圖如圖2所示。進一步，將500-900微升，濃度為1毫克/毫升的cea抗體加入到該fe3o4@ag納米球分散液中，在4°c下孵育過夜，最后磁性分離清洗得到抗體標記的fe3o4@ag結合物（記為fe3o4@ag-ab1）。

利用ag3po4/ag和fe3o4/ag復合物構建比色免疫分析方法檢測癌胚抗原的方法，示意圖如圖3所示，將1-1.8a毫升fe3o4@ag-ab1依次孵育2.5納克/毫升、2納克/毫升、1.5納克/毫升、1納克/毫升、0.8納克/毫升、0.5納克/毫升、0.2納克/毫升的癌胚抗原（cea）30分鐘，然后用二次水清洗2-5次，進一步孵育1-1.8毫升ab2-ag3po4/ag30分鐘，構建成免疫傳感器，隨后加入2-3.6毫升，ph為3的abs緩沖液和100-180a微升，濃度為5毫摩爾/升四甲基聯(lián)苯胺（tmb）溶液，通過紫外分光光度計檢測tmb的紫外吸收來定量cea的濃度。

通過紫外分光光度計檢測tmb的紫外吸收來定量cea的濃度是指，將發(fā)生反應后的tmb溶液在200-800波長范圍內進行紫外光譜掃描，當cea的濃度在0納克/毫升時，觀察到空白緩沖液的紫外吸收峰為0.210，當cea的濃度在0.2納克/毫升時，得到的紫外吸收峰開始大于0.210，cea的濃度檢測范圍是2.5納克/毫升到0.2納克/毫升，如圖4，在此范圍內，cea的濃度與紫外吸收成線性相關性，其線性方程為y=0.297x+0.176其中，x是cea的濃度，單位是納克/毫升，y是紫外吸光度。其最低檢測限為0.03納克/毫升(信噪比為3)，與其它檢測方法相比，構建的比色免疫分析方法具有較低的檢測限和較寬的檢測范圍。

cea濃度與吸光度的對應關系如下表所示：

實際樣品分析

用構建的比色免疫分析方法檢測血清中的癌胚抗原，檢測結果與商業(yè)化的酶聯(lián)免疫分析法檢測結果相對比，兩組結果相對比，通過t驗證法計算，得到的t值都小于tcrit（4.30），證明該免疫分析方法可以用來檢測實際血清樣品中的癌胚抗原的濃度。

比色方法結果和酶聯(lián)免疫分析法結果如下表所示：

專一性分析

將制得的比色免疫傳感器分別在空白緩沖溶液、10納克/毫升的不同干擾物質（ca²⁺，mg²⁺,zn²⁺，fe²⁺，h2o2，葡萄糖）的緩沖溶液中孵育30分鐘后，用二次水充分洗滌，然后檢測，構建的比色傳感器與上述六種干擾物質作用后，測得的吸光度值與空白組比較（0.210）相差不大（<2%）。相反，當構建的比色傳感器與1納克/毫升的cea作用時，吸光度值變化顯著，為0.513。說明基于ag3po4/ag復合物構建的比色免疫分析方法對檢測cea有較好的專一性。