本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品及其功能成分的指紋圖譜分析領(lǐng)域，具體涉及一種蓮藕多糖HPSEC指紋圖譜的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

蓮藕是我國栽培最廣、銷售量和銷售范圍最大的水生蔬菜。據(jù)中藥大辭典所述，蓮藕生用可清熱、涼血、散疲、治熱病煩渴，熟用可健脾、開胃、益血、生肌、止瀉。上述功效可能部分與多糖有關(guān)，蓮藕多糖經(jīng)研究證實具有抗疲勞(周桃英，2011)、降血糖(羅登宏，2011)、抗氧化(羅登宏，2011；嚴(yán)浪，2008；Jiang,2011)和免疫調(diào)節(jié)(Jiang,2011)等活性。新鮮蓮藕中多糖提取得率可達(dá)5％(孫杰，2016；王瑜，2007)，且藕皮、藕節(jié)和藕渣等傳統(tǒng)加工副產(chǎn)物中也含有豐富的多糖(李正一，2016；嚴(yán)浪，2007)。目前，蓮藕加工科技水平薄弱，產(chǎn)品“同質(zhì)化”現(xiàn)象嚴(yán)重，經(jīng)濟(jì)附加值不高，且加工過程中產(chǎn)生大量的藕皮、藕節(jié)和藕渣等副產(chǎn)物均未得到有效開發(fā)利用。相應(yīng)地，蓮藕多糖的高值開發(fā)利用有助于完善產(chǎn)品結(jié)構(gòu)和拓展產(chǎn)業(yè)鏈，在功能食品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用前景良好，而多糖的質(zhì)量控制極為關(guān)鍵。

蓮藕種質(zhì)資源極為豐富，在“國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃”中保存資源已達(dá)310份，而人工選育品種達(dá)12種(柯衛(wèi)東，2015)。韓延闖(2004)、劉月光(2006)、全志武(2008)和李長春(2011)均采用分子生物學(xué)技術(shù)研究了蓮藕種質(zhì)資源的遺傳多態(tài)性，并構(gòu)建生物指紋圖譜用于品種鑒別，但相關(guān)技術(shù)因無法直接用于藕原料的分析鑒別而與實際生產(chǎn)脫節(jié)，亦無法反應(yīng)蓮藕中的生物活性成分信息。

基于物質(zhì)群體的認(rèn)識，指紋圖譜可實現(xiàn)資源真實性鑒別、質(zhì)量一致性評價和產(chǎn)品穩(wěn)定性分析(李強(qiáng)，2013)。多糖的組成與結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜，導(dǎo)致一般的理化分析和結(jié)構(gòu)鑒定很難辨識多糖的質(zhì)量優(yōu)劣，但卻為多糖的識別提供了豐富的指紋信息。多糖的指紋圖譜技術(shù)在多糖及其原料質(zhì)量控制方面有廣泛的應(yīng)用。枸杞多糖(高向東，2014)、猴頭菇多糖(周春暉，2016)、鐵皮石斛多糖(羅建平，2009)、決明子多糖(高新開，2014)、蘆薈多糖(董銀卯，2015)的指紋圖譜技術(shù)不僅可以突破多糖品質(zhì)與真?zhèn)舞b別，還可以實現(xiàn)原料品種及產(chǎn)地的區(qū)別。然而，蓮藕多糖的指紋圖譜技術(shù)尚未見報道。

蓮藕中多糖具有良好的開發(fā)價值，急需研發(fā)可靠的質(zhì)量評價技術(shù)。原料質(zhì)量控制是多糖品質(zhì)的重要保障，蓮藕的種質(zhì)資源豐富，現(xiàn)有的品種鑒別技術(shù)尚無法直接應(yīng)用于藕精深加工產(chǎn)品質(zhì)量控制。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種蓮藕多糖HPSEC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其可用于蓮藕品種的鑒別。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種蓮藕多糖HPSEC指紋圖譜的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：

1)取蓮藕洗凈后切分為藕段和藕節(jié)，藕段刨取皮部，藕節(jié)切除須根，得到藕皮、食用部位和藕節(jié)三個供試部位，分別粉碎至5～20目待用；

2)將步驟1)中粉碎的藕皮、食用部位和藕節(jié)三個供試部位分別進(jìn)行多糖提取處理，分別得到相應(yīng)的三份蓮藕多糖樣品；

3)以步驟2)得到的三份蓮藕多糖樣品為測試對象，采用HPSEC檢測多糖樣品的分子量分布，檢測時將UV檢測器和RI檢測器串聯(lián)使用，得到藕皮、食用部位和藕節(jié)三個供試部位相應(yīng)的多糖HPSEC-UV圖譜和多糖HPSEC-RI圖譜；

4)多次重復(fù)步驟1)、2)和3)分別得到多個不同品種蓮藕的藕皮、食用部位和藕節(jié)三個供試部位的多糖HPSEC-UV圖譜和多糖HPSEC-RI圖譜(HPSEC-UV-RI二元圖譜)，以所有多糖HPSEC-UV指紋圖譜的平均向量構(gòu)建得多糖HPSEC-UV標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以所有多糖HPSEC-RI圖譜的平均向量構(gòu)建得多糖HPSEC-RI標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，則完成蓮藕多糖HPSEC指紋圖譜的構(gòu)建。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以有如下進(jìn)一步的具體選擇。

具體的，步驟2)中的多糖提取處理的具體內(nèi)容為：將供試部位按料液比1g:15mL加入蒸餾水，在12000r/min的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)處理5min后轉(zhuǎn)入90℃水浴恒溫浸提2h；浸提結(jié)束后，采用4500r/min離心10min，過濾分離多糖提取液；調(diào)節(jié)多糖提取液pH至6.5，加入α-淀粉酶在70℃水浴中酶解至碘液反應(yīng)呈陰性，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)至pH 4.5，加入糖化酶在55℃水浴中酶解至還原糖含量不再增加，升溫至95℃并保持10min滅酶；酶解提取液在70℃下真空濃縮至原體積1/4，采用Sevage法脫蛋白后加入無水乙醇至80％乙醇體積濃度，于4℃靜置過夜；采用4500r/min離心10min分離沉淀多糖；多糖經(jīng)80％乙醇洗滌后揮發(fā)乙醇，以少量水復(fù)溶后冷凍干燥得到蓮藕多糖樣品。

具體的，步驟3)中HPSEC檢測的具體條件為：色譜柱為Ultrahydrogel250，柱溫為45℃，流動相為0.1mol/L硝酸鈉，洗脫流速為0.5mL/min，進(jìn)樣體積為15μL，采用0.1mol/L硝酸鈉配制2.5mg/mL的蓮藕多糖樣液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進(jìn)樣分析。

具體的，所述多糖HPSEC-UV標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜包括5個共有特征峰，其對應(yīng)的保留時間依次為：12.55min、13.23min、13.53min、13.84min、15.39min。

具體的，所述多糖HPSEC-UV標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜包括7個共有特征峰，其對應(yīng)的保留時間依次為：13.00min、13.82min、14.30min、15.07min、15.47min、15.90min、16.80min。

具體的，步驟4)中多個不同品種蓮藕的數(shù)量為13個以上。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明以不同品種及不同部位的蓮藕多糖為研究對象，以多個蓮藕多糖樣品HPSEC-RI圖譜的平均向量構(gòu)建得多糖HPSEC-RI標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以此為參照圖譜，采用相關(guān)系數(shù)(R)和夾角余弦(cosθ)分析不同品種及不同部位蓮藕多糖HPSEC-RI圖譜的相似性，發(fā)現(xiàn)不同品種及不同部位蓮藕多糖的HPSEC-RI指紋特征具有明顯差異，可以作為蓮藕品種鑒別的重要依據(jù)；本發(fā)明同時還以多個蓮藕多糖樣品HPSEC-UV圖譜的平均向量構(gòu)建得多糖HPSEC-UV標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以此為參照圖譜，采用相關(guān)系數(shù)(R)和夾角余弦(cosθ)進(jìn)行相似性分析，發(fā)現(xiàn)有一些品種蓮藕的不同部位對應(yīng)多糖的HPSEC-UV圖譜相似度較高，而另一些品種蓮藕的不同部位對應(yīng)的HPSEC-UV圖譜的指紋特征具有明顯異，故HPSEC-UV指紋圖譜可作為HPSEC-RI指紋圖譜的補(bǔ)充，兩者配合可更加準(zhǔn)確的反映蓮藕多糖的結(jié)構(gòu)特征，彌補(bǔ)單一HPSEC圖譜指紋信息單薄的缺陷，以更加準(zhǔn)確有效的對蓮藕品種進(jìn)行鑒別，同時也可進(jìn)行蓮藕多糖的真實性鑒別；以從多個品種蓮藕的藕皮、藕節(jié)和食用部位提取的多糖為研究對象，整合蓮藕資源中多糖的多維數(shù)據(jù)體系，增加了指紋圖譜信息的全面性和可靠性。

附圖說明

圖1為蓮藕多糖的HPSEC-RI指紋圖譜，其中a和b分別為蓮藕食用部位多糖HPSEC-RI指紋圖譜及其標(biāo)準(zhǔn)圖譜、c和d分別為藕皮多糖HPSEC-RI指紋圖譜及其標(biāo)準(zhǔn)圖譜；e和f分別為藕節(jié)多糖HPSEC-RI指紋圖譜及其標(biāo)準(zhǔn)圖譜；g為不同品種及不同部位蓮藕多糖HPSEC-RI標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

圖2為蓮藕多糖的HPSEC-RI指紋圖譜，其中a和b分別為蓮藕食用部位多糖HPSEC-UV指紋圖譜及其標(biāo)準(zhǔn)圖譜；c和d分別為藕皮多糖HPSEC-UV指紋圖譜及其標(biāo)準(zhǔn)圖譜；e和f分別為藕節(jié)多糖HPSEC-UV指紋圖譜及其標(biāo)準(zhǔn)圖譜；g為不同品種及不同部位蓮藕多糖HPSEC-UV標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

本發(fā)提供一種蓮藕多糖HPSEC指紋圖譜的構(gòu)建方法，該包括如下具體內(nèi)容：

1.蓮藕供試樣品的制備

鄂蓮5號、鄂蓮6號、鄂蓮7號、鄂蓮8號、應(yīng)城白蓮、走馬羊、貴溪浮藕、巴河藕、白泡子、博白藕、武植2號、8143、常州漂江，共計13個品種蓮藕由國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃提供，取樣時間為2015年10月。

取蓮藕洗凈后切分為藕段和藕節(jié)；藕段刨取皮部，藕節(jié)切除須根，得到藕皮、食用部位和藕節(jié)三個供試部位；供試部位分別粉碎至5～20目待用。

2.蓮藕多糖的制備

稱取步驟1)中蓮藕供試樣品100g，按料液比(g/mL)1:15加入蒸餾水，在12000r/min的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)處理5min后轉(zhuǎn)入90℃水浴恒溫浸提2h；浸提結(jié)束后，采用4500r/min離心10min，過濾分離多糖提取液；調(diào)節(jié)多糖提取液pH至6.5，加入α-淀粉酶在70℃水浴中酶解至碘液反應(yīng)呈陰性，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)至pH 4.5，加入糖化酶在55℃水浴中酶解至還原糖含量不再增加，升溫至95℃并保持10min滅酶；酶解提取液在70℃下真空濃縮至原體積1/4，采用Sevage法脫蛋白后加入無水乙醇至80％乙醇體積濃度，于4℃靜置過夜；采用4500r/min離心10min分離沉淀多糖；多糖經(jīng)80％乙醇洗滌后揮發(fā)乙醇，以少量水復(fù)溶后冷凍干燥得到蓮藕多糖。

3.蓮藕多糖HPSEC指紋圖譜的構(gòu)建

(1)蓮藕多糖的HPSEC分析方法

采用HPSEC法檢測蓮藕多糖的分子量分布，色譜分析條件為：UV(或PDA)檢測器(280nm)和RI檢測器串聯(lián)使用，色譜柱為Ultrahydrogel250，柱溫為45℃，流動相為0.1mol/L硝酸鈉，洗脫流速為0.5mL/min，進(jìn)樣體積為15μL。采用0.1mol/L硝酸鈉配制2.5mg/mL的多糖樣液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進(jìn)樣分析。

(2)蓮藕多糖的HPSEC-RI標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜構(gòu)建及分析

不同品種及不同部位蓮藕多糖的HPSEC-RI指紋圖譜如圖1所示。蓮藕不同部位多糖的分子量分布存在相似之處，但亦存在明顯的差異(表1)。相似之處在于：不同部位多糖均在保留時間13.00、13.82、14.30、15.47和15.90min附近出現(xiàn)色譜峰，對應(yīng)分子量分別約18.45、11.57、9.18、5.94和5.30kDa，其共有特征峰所占總峰面積百分比均超過89％。不同之處在于：各共有特征峰所占總峰面積百分比大小不同，食用部位多糖和藕節(jié)多糖均以5.94kDa組分含量最高，而藕片多糖以11.57kDa組分含量最高；食用部位多糖和藕皮多糖含有少量分子量為6.75kDa的組分；藕皮多糖和藕節(jié)多糖含有少許分子量為4.60kDa的組分；藕節(jié)多糖中低分子組分含量較高，含有唯一的4.33kDa組分。

以39個多糖樣品HPSEC-RI圖譜的平均向量構(gòu)建多糖HPSEC-RI標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜(圖1g所示)，以此為參照圖譜，采用相關(guān)系數(shù)(R)和夾角余弦(cosθ)分析不同品種及不同部位多糖的HPSEC-RI指紋圖譜相似性，由表2可見。39個多糖樣品的相關(guān)系數(shù)值介于0.0775～0.9936，而夾角余弦值介于0.5143～0.9947，不同品種及不同部位多糖的HPSEC-RI指紋特征具有明顯差異，可以作為蓮藕品種鑒別的重要依據(jù)。

表1.蓮藕多糖HPSEC-RI指紋圖譜共有峰信息

表2.蓮藕多糖HPSEC-RI指紋圖譜的相似度分析

(3)蓮藕多糖的HPSEC-UV標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建

13個品種蓮藕的食用部位、皮部、節(jié)部制備所得多糖的HPSEC-UV指紋圖譜如圖2所示。蓮藕不同部位多糖中蛋白特征色譜峰位于保留時間約12.55、13.23、13.53、13.84、14.55和15.39min處，對應(yīng)分子量分別約17.56、11.66、9.93、8.52、6.29和4.79kDa，如表3所示。因分子量分布檢測中RI和UV檢測器為串聯(lián)使用，標(biāo)準(zhǔn)品的RI信號較PDA信號延遲0.45～0.65min。以此判斷，HPSEC-UV指紋圖譜共有峰1和5分別對應(yīng)HPSEC-RI指紋圖譜共有峰1和4，即相應(yīng)組分為多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，而其余組分為多糖或蛋白質(zhì)。不同部位多糖之間的HPSEC-UV指紋圖譜存在顯著差異：食用部位多糖中不含分子量約11.66和4.79kDa的蛋白組分；藕節(jié)多糖中不含分子量約9.93和6.29kDa的蛋白組分。

以39個多糖樣品HPSEC-UV圖譜的平均向量構(gòu)建多糖HPSEC-UV標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜(圖2g所示)，以此為參照圖譜，采用相關(guān)系數(shù)(R)和夾角余弦(cosθ)分析不同品種及不同部位多糖的HPSEC-UV指紋圖譜相似性，如表4所示。13個蓮藕品種中，不同部位多糖HPSEC-UV指紋圖譜相似度均達(dá)0.9以上的有6種。不同品種及不同部位多糖的HPSEC-UV指紋特征具有明顯差異，可用于蓮藕品種和不同部位蓮藕原料的鑒別，其作為HPSEC-RI標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的補(bǔ)充，提供更多蓮藕多糖的結(jié)構(gòu)特征，以更準(zhǔn)確的判斷蓮藕品種。

表3.蓮藕多糖HPSEC-UV指紋圖譜共有峰信息

表4.蓮藕多糖HPSEC-UV指紋圖譜的相似度分析

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。