(一)技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種檢測谷胱甘肽的熒光生物傳感方法，屬于生物分析檢測技術(shù)領域。

(二)

背景技術(shù)：

谷胱甘肽(gsh)是由谷氨酸、半胱氨酸以及甘氨酸組成的三肽，是活細胞中含量最多的非蛋白硫醇，是抵抗毒素的第一道防線。它在保持細胞平衡、細胞信號轉(zhuǎn)導、基因調(diào)控、解毒等方面具有重要作用。通常，gsh的失衡會引起多種疾病發(fā)生，如肝病、艾滋病、糖尿病、癌癥等。所以，發(fā)展靈敏高效的gsh檢測方法具有重要意義。

目前，對于gsh的檢測有電化學法、高效液相色譜法、比色法、熒光法等。其中，熒光法具有高靈敏度、非破壞性、操作簡單等優(yōu)點。近來，有多種有機探針被開發(fā)用于gsh檢測，如利用邁克爾加成反應，二硫鍵斷裂、巰基親核取代反應等。盡管取得良好效果，但是大部分有機探針合成及純化步驟較多，成本較高，限制了其應用。也有一些熒光納米材料如量子點、金納米簇、熒光碳納米材料、上轉(zhuǎn)換納米顆粒被開發(fā)用于gsh檢測，但是有一些不足存在，如量子點合成時用到重金屬鎘，金簇或熒光碳納米材料用到汞離子來淬滅熒光、上轉(zhuǎn)換納米顆粒合成復雜及成本高。所以，開發(fā)操作簡單、高靈敏度、高選擇性的熒光檢測gsh方法仍具有較高科學價值和實用價值。

(三)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于改善現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡單、靈敏高、選擇性高的gsh熒光檢測方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種檢測谷胱甘肽的熒光生物傳感方法，所述方法包括：

(1)化學還原法合成二氧化錳納米材料，配制鄰苯二胺溶液；

(2)將二氧化錳納米材料與鄰苯二胺溶液混合反應，對反應產(chǎn)物進行熒光光譜測定，獲得熒光參照值f0；反應溫度為20～90℃，反應時間為1分鐘～1小時，二氧化錳納米材料濃度為1μg/ml～500μg/ml，鄰苯二胺濃度為0.1mm～100mm，二氧化錳納米材料：鄰苯二胺質(zhì)量用量之比為1：1～50；

(3)將梯度濃度谷胱甘肽標準溶液與二氧化錳納米材料進行反應，將反應后溶液與鄰苯二胺溶液混合共反應，二氧化錳納米材料與鄰苯二胺溶液用量同步驟(2)，測定反應產(chǎn)物熒光值f，以谷胱甘肽濃度為橫坐標，以f0-f值為縱坐標，得到不同濃度谷胱甘肽響應標準曲線；

(4)待測含谷胱甘肽樣品溶液與二氧化錳納米材料反應，將反應后溶液與鄰苯二胺溶液混合共反應，二氧化錳納米材料與鄰苯二胺溶液用量同步驟(2)，測定反應產(chǎn)物熒光值，對照標準曲線，獲得樣品中谷胱甘肽濃度值。

本發(fā)明以二氧化錳納米材料為氧化劑和識別元件，在無gsh時，二氧化錳納米材料催化氧化鄰苯二胺產(chǎn)生氧化鄰苯二胺產(chǎn)物用于熒光檢測，在gsh存在下，gsh降解二氧化錳納米材料，抑制二氧化錳對鄰苯二胺的氧化能力，減弱熒光信號。通過比較熒光值的變化實現(xiàn)對gsh的檢測。該發(fā)明原理示意圖如圖1所示。

優(yōu)選的，所述步驟(1)二氧化錳納米材料合成方法如下：高錳酸鉀溶液加入2-(n-嗎啉)乙磺酸緩沖液中，超聲反應得到棕色產(chǎn)物，離心洗滌3～5次，重新分散于二次水中使得濃度為1mg/ml；其中，高錳酸鉀濃度為0.1～100mm，2-(n-嗎啉)乙磺酸緩沖液濃度為1mm～1m、ph值為5.0～7.4，超聲時間為10分鐘～2小時。

所述步驟(1)鄰苯二胺溶液配制方法如下：稱取108mg鄰苯二胺固體，加入0.5ml乙醇溶解后再加入9.5ml二次水配制成100mm鄰苯二胺溶液。

步驟(3)谷胱甘肽溶液濃度為0～100μm，反應時間為1分鐘～1小時。

步驟(4)中谷胱甘肽樣品溶液可為水溶液、緩沖溶液、血清樣品或細胞裂解液樣品等。待測樣品若濃度較高，可稀釋之后再進行檢測。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明操作更為簡便，靈敏度高、簡單、成本低廉，可特異性檢測gsh；本發(fā)明的檢測方法可有效應用于生物液體樣品中g(shù)sh的檢測。

(四)附圖說明

圖1為本發(fā)明的檢測谷胱甘肽的原理示意圖。

圖2為本發(fā)明制備的二氧化錳納米片表征圖；(a)高錳酸鉀溶液及生成二氧化錳的吸收圖；(b)二氧化錳納米片的透射電鏡圖；(c)二氧化錳納米片的拉曼光譜圖；(d)二氧化錳納米片的x射線光電子能譜圖(mn2p)。

圖3為二氧化錳納米片用于檢測不同濃度的谷胱甘肽熒光光譜圖及線性圖，(a)熒光響應圖；(b)相應的熒光與濃度響應線性相關(guān)圖。其中，f0為未加入谷胱甘肽時的熒光值，f為加入不同濃度谷胱甘肽后熒光值。

圖4為二氧化錳納米片檢測谷胱甘肽的選擇性實驗圖，所選擇干擾物分別為：磷酸鹽緩沖液(pbs)、氯化鉀溶液(kcl)、氯化鈉(nacl)、氯化鎂(mgcl2)，以上濃度為100mm；葡萄糖(glucose)、甘氨酸(gly)、絲氨酸(ser)、賴氨酸(lys)、天冬氨酸(asp)，以上濃度為10mm；牛血清白蛋白(bsa)、人血清白蛋白(hsa)、葡萄糖氧化酶(gox)，以上濃度為10mg/ml。

圖5為二氧化錳納米片檢測細胞裂解液中谷胱甘肽的熒光光譜圖。(a)檢測不同數(shù)目細胞裂解液中的谷胱甘肽；(b)細胞裂解液經(jīng)nem預處理后，熒光響應變化。

圖6為二氧化錳納米片檢測血清中谷胱甘肽的熒光光譜圖。

(五)具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：

實施例1：

二氧化錳納米材料的合成：1ml高錳酸鉀溶液(10mm)與2.5mlmes緩沖液(0.1m,ph6.0)混勻后，再加入6.5ml二次水；之后，置于超聲清洗器中超聲反應30分鐘，至棕色絮狀產(chǎn)物形成。將反應后棕色產(chǎn)物8000轉(zhuǎn)每分鐘10分鐘離心及水洗3次，以除去未反應的離子。最后，將所獲得二氧化錳納米片超聲分散于二次水中，濃度為1mg/ml。圖2證明成功合成了二氧化錳材料，其中，(a)圖為高錳酸鉀溶液及生成二氧化錳后的吸收對比圖；(b)圖為合成后的透射電鏡圖片，證明合成了納米尺寸的二氧化錳納米片；(c)圖為二氧化錳納米片的拉曼光譜圖；(d)圖為二氧化錳納米片的x射線光電子能譜圖(xps)。以上結(jié)果證明二氧化錳納米片的成功合成。

實施例2：

熒光檢測谷胱甘肽：2.5μl的二氧化錳納米片(1mg/ml)與200μl不同濃度谷胱甘肽溶液(0，10，20，30，40μm)與室溫反應5分鐘；之后，加入5μl6.8mm的鄰苯二胺(opda)溶液混勻，于50℃烘箱或者水浴鍋中反應10分鐘后。冷卻至室溫，420nm波長激發(fā)下測試568nm的熒光發(fā)射光譜。做選擇性實驗時，將不同干擾物與2.5μl的二氧化錳納米片(1mg/ml)室溫反應5分鐘；之后，加入5μl6.8mm的鄰苯二胺(opda)溶液混勻，于50℃烘箱或者水浴鍋中反應10分鐘后。冷卻至室溫后，再測試熒光光譜圖。谷胱甘肽的熒光響應如圖3所示。該方法對谷胱甘肽檢測的選擇性，如圖4所示，除了谷胱甘肽外，其它非目標分子無明顯抑制二氧化錳氧化鄰苯二胺的能力，證明本發(fā)明的檢測方法對谷胱甘肽具有良好的選擇性。

實施例3：

細胞裂解溶液中谷胱甘肽的檢測：hela細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清、青霉素(100u/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的rpmi1640培養(yǎng)基中于37℃高濕度含5％二氧化碳培養(yǎng)箱中。將生長好的hela細胞離心后，用冷的pbs洗滌3次后，利用細胞計數(shù)器計算細胞的濃度。將細胞懸浮液分散至冷的pbs中，使得每100μl溶液中含有500、5000、10000、20000、30000、40000個等不同數(shù)目的細胞，將細胞懸浮液置于4℃冰浴條件下超聲5分鐘，10000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分后，取上清液用于測試。上清液稀釋至200μl與2.5μl的二氧化錳納米片(1mg/ml)混合反應5分鐘后，加入5μl6.8mm的鄰苯二胺(opda)溶液混勻，于50℃烘箱或者水浴鍋中反應10分鐘后。冷卻至室溫后，420納米波長激發(fā)下測試568納米處的熒光發(fā)射光譜。另外，有一組細胞裂解液先與0.1mm乙基馬來酰亞胺(n-ethylmaleimide，nem)反應以封閉硫醇物質(zhì)，用于證明熒光信號變化是來自于細胞中的谷胱甘肽。結(jié)果如圖5所示。證明該方法可以用于細胞裂解液中的谷胱甘肽檢測。

實施例4：

血清中谷胱甘肽的檢測：血清樣品先于10000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘后，取上清液稀釋50倍。在血清稀釋液中添加不同濃度谷胱甘肽后，將200μl含谷胱甘肽稀釋樣品與2.5μl二氧化錳納米片(1mg/ml)混合反應5分鐘后，加入5μl6.8mm的鄰苯二胺溶液混勻，于50℃烘箱或者水浴鍋中反應10分鐘后。冷卻至室溫后，420nm波長激發(fā)下測試568nm處的熒光發(fā)射光譜。如圖6所示，隨著谷胱甘肽濃度增大，熒光信號逐漸降低，證明該方法可用于血清中谷胱甘肽的檢測。