本發(fā)明涉及分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種同時測定穿心蓮內(nèi)酯中多種有關(guān)物質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)系自爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮中提取得到的二萜內(nèi)酯類化合物，具有清熱解毒、涼血消腫等功能?，F(xiàn)已上市的或處于開發(fā)階段的制劑主要有穿心蓮內(nèi)酯片劑、膠囊、注射劑等。穿心蓮內(nèi)酯是以穿心蓮葉為原料，采用不同的提取工藝制備得到的制劑原料藥。由于其酯類結(jié)構(gòu)，在水溶液中，特別是高溫、強堿性環(huán)境中，易水解、開環(huán)、異構(gòu)化和樹脂化。穿心蓮內(nèi)酯原料藥及其制劑中除主要成分穿心蓮內(nèi)酯外，一般同時存在新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等二萜內(nèi)酯類雜質(zhì)。這些化合物有些是在提取過程中引入的，也有通過降解或內(nèi)部轉(zhuǎn)化而成。這些雜質(zhì)可能會影響穿心蓮內(nèi)酯的藥效，嚴(yán)重可能導(dǎo)致不良反應(yīng)，這對于藥品的安全性、有效性、質(zhì)量可控性都是極為不利的。因此，準(zhǔn)確測定穿心蓮內(nèi)酯原料及其制劑中有關(guān)物質(zhì)的含量，是評價穿心蓮內(nèi)酯原料藥及其制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)。

目前，對于穿心蓮內(nèi)酯有關(guān)物質(zhì)檢測方法的研究較少。文獻“穿心蓮藥材及其制劑中6個內(nèi)酯類成分的含量分析(藥物分析雜志，鄧貴華，林朝展，祝晨蔯，2011(2):231-235.)”提供了一種檢測穿心蓮多種成分的方法，但該法洗脫梯度程序較多，且檢測指標(biāo)僅限于內(nèi)酯類雜質(zhì)的檢測，且檢測時間較長；專利“一種穿心蓮內(nèi)酯有關(guān)物質(zhì)的測定方法”(cn102809625b)，采用了水-乙腈-甲醇三元體系，體系較為復(fù)雜，操作繁瑣，且其檢測的也只是新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等內(nèi)酯類分子結(jié)構(gòu)，但是對于其他含量較低但可能影響產(chǎn)品質(zhì)量安全的其他雜質(zhì)，沒有證據(jù)表明也可以同時檢測。文獻“一測多評法測定穿心蓮中5個內(nèi)酯類成分的含量(《中藥材》，王歡，林朝展，吳潤菁，祝晨蔯，第37卷第3期2014年3月，448-451)”提供了一測多評法同時測定穿心蓮藥材中5個內(nèi)酯類成分的含量的方法，但是經(jīng)發(fā)明人檢驗，該法在檢測穿心蓮內(nèi)酯堿破壞樣品時，不能將各有關(guān)物質(zhì)進行有效分離進而進行含量檢測。正如上文所述，穿心蓮內(nèi)酯中除了含有各內(nèi)酯類的雜質(zhì)外，還有其他如開環(huán)、異構(gòu)化、樹脂化的雜質(zhì)，因此，目前技術(shù)仍缺少一種簡便、靈敏、高效的穿心蓮內(nèi)酯有關(guān)物質(zhì)的測定方法，能夠快速準(zhǔn)確且全面地測定及評價穿心蓮內(nèi)酯原料、以及相關(guān)制劑制備及穩(wěn)定性試驗期間的有關(guān)物質(zhì)含量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種更為簡便、靈敏高效的測定穿心蓮內(nèi)酯多種有關(guān)物質(zhì)的方法，以能夠快速、準(zhǔn)確地、全面的同時測定穿心蓮內(nèi)酯原料藥及其制劑中有關(guān)物質(zhì)含量。

為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種采用高效液相色譜法同時測定穿心蓮內(nèi)酯多種有關(guān)物質(zhì)的方法，該法采用的色譜條件為：固定相是以十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱；流動相a是水，流動相b是乙腈；進行梯度洗脫，梯度條件為：梯度1流動相的體積比為：a：b＝75～80％：25～20％，進樣15～20min后流動相變化為梯度2，梯度2流動相的體積比為：a：b＝65～70％：35～30％，總運行時間為45～55min；檢測波長220～230nm，柱溫為30～35℃；洗脫流速為0.5～2.0ml/min。

在一些實施方案中，梯度1流動相優(yōu)選的體積比為：a：b＝77：23。

在一些實施方案中，梯度2流動相優(yōu)選的體積比為：a：b＝70：30。

在一些實施方案中，檢測波長優(yōu)選224nm。

在一些實施方案中，洗脫流速優(yōu)選1.0ml/min。

在一些實施方案中，進樣樣品檢測過程中，樣品進樣量為10～15μl。

在一些實施方案中，所述總運行時間45～55min后，再在梯度1條件下運行10～15min。

在一些實施方案中，所述色譜柱填料粒徑為2～5μm；顆粒平均直徑為4.6mm。

在一些實施方案中，所述色譜柱的填料粒徑為3μm。

在一些實施方案中，在穿心蓮內(nèi)酯對照品及待測樣品的配制過程中，選用良溶劑對穿心蓮內(nèi)酯進行溶解，所述良溶劑是對穿心蓮內(nèi)酯原料，制劑及對照品溶解性較好的且與體系相容的溶劑，是甲醇或乙腈，或二者混合物，優(yōu)選為甲醇。

本發(fā)明提到的測定方法，其洗脫流速設(shè)定為一般技術(shù)人員公知的常識，常見的范圍一般為0.5ml/min至2ml/min，本發(fā)明優(yōu)選0.9～1.1ml/min，更優(yōu)選1.0ml/min。

本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和積極效果：

(1)采用水-乙腈二元體系，兩段洗脫，更簡便，更高效。

(2)本發(fā)明采用破壞程度較大的堿破壞穿心蓮內(nèi)酯作為供試品進行色譜條件的篩選，除穿心蓮內(nèi)酯外，可以同時檢測9種有關(guān)物質(zhì)，且各有關(guān)物質(zhì)之間的分離度均可大于1.5，因此本發(fā)明的適用范圍更廣。

附圖說明

圖1為穿心蓮內(nèi)酯對照品經(jīng)強堿破壞(破壞程度6％)后的hplc色譜圖；

圖2為穿心蓮內(nèi)酯對照品經(jīng)強堿破壞(破壞程度47％)后的hplc色譜圖；

圖3為穿心蓮內(nèi)酯對照品經(jīng)強酸破壞后的hplc色譜圖；

圖4為穿心蓮內(nèi)酯對照品經(jīng)強堿破壞后，實施例4色譜條件下有關(guān)物質(zhì)檢測hplc色譜圖；

圖5為穿心蓮內(nèi)酯對照品經(jīng)強堿破壞后，實施例5色譜條件下有關(guān)物質(zhì)檢測hplc色譜圖；

圖6為0.001mg/ml穿心蓮內(nèi)酯原料藥甲醇溶液的hplc色譜圖；

圖7為1mg/ml穿心蓮內(nèi)酯原料藥甲醇溶液的hplc色譜圖。

圖8為文獻“一測多評法測定穿心蓮中5個內(nèi)酯類成分的含量”中色譜條件的嘗試；

圖9為文獻“穿心蓮藥材及其制劑中6個內(nèi)酯類成分的含量分析”中色譜條件的嘗試。

具體實施方案

下述是結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。但這些實施例僅限于說明本發(fā)明而不是用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。

下述實施例中，所述穿心蓮內(nèi)酯原料藥來自四川省玉鑫藥業(yè)有限公司，純度大于99.0％。穿心蓮內(nèi)酯對照品購于中國食品藥品檢定研究院，純度98.7％。

下述實施例中，檢測采用的儀器設(shè)備為：agilent1260infinity高效液相色譜儀(g1362a)(美國安捷倫公司)；dad檢測器(美國安捷倫公司)。

實施例1穿心蓮內(nèi)酯對照品經(jīng)強堿破壞(破壞程度6％)后，其有關(guān)物質(zhì)的檢測試驗

(1)取穿心蓮內(nèi)酯對照品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加甲醇約3ml，使其溶解，加入0.01mol/lnaoh溶液0.4ml，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分裝于西林瓶中2ml，壓蓋。置于65℃水浴放置15min后用0.01mol/l的hcl調(diào)節(jié)至中性以作為堿破壞待測溶液。

(2)采用hplc測定(1)步驟中的堿破壞溶液，色譜條件如下：色譜柱為thermoc18(150mm×4.6mm，3μm，熱電公司)；檢測波長為224nm；柱溫為30℃，流速為1.0ml/min；進樣量為10μl。以水(a)-乙腈(b)為流動相，進行梯度洗脫。梯度1流動相的體積比為：a：b＝77％：23％，進樣20min后流動相變化為梯度2；梯度2流動相的體積比為：a：b＝70％：30％?？傔\行時間為50min，后運行15min。記錄色譜圖，見圖1。

在圖1中，保留時間為12.716min色譜峰為穿心蓮內(nèi)酯色譜峰。結(jié)果顯示，堿破壞樣品的液相色譜中，降解產(chǎn)物間的分離度均大于1.5，穿心蓮內(nèi)酯降解程度約為6％。

表1穿心蓮內(nèi)酯對照品經(jīng)強堿破壞(破壞程度6％)后hplc色譜圖參數(shù)

實施例2穿心蓮內(nèi)酯對照品經(jīng)強堿破壞(破壞程度47％)后，其有關(guān)物質(zhì)的檢測試驗

取穿心蓮內(nèi)酯對照品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加甲醇約3ml，使其溶解，加入0.01mol/lnaoh溶液0.4ml，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分裝于西林瓶中2ml，壓蓋。置于70℃水浴放置1h后用0.01mol/l的hcl調(diào)節(jié)至中性以作為堿破壞待測溶液。

除上述條件改變其他色譜條件及具體步驟同實施例1。結(jié)果見圖2。

圖2中，保留時間為12.714min色譜峰為穿心蓮內(nèi)酯色譜峰。結(jié)果顯示，堿破壞樣品的液相色譜中，降解產(chǎn)物間的分離度均大于1.5，穿心蓮內(nèi)酯降解率約為47％。結(jié)果表明，增大破壞強度，各降解產(chǎn)物仍然能得到很好的分離。

表2穿心蓮內(nèi)酯原料藥經(jīng)強堿破壞(破壞程度47％)后hplc色譜圖參數(shù)

實施例3穿心蓮內(nèi)酯對照品經(jīng)強酸破壞后，其有關(guān)物質(zhì)的檢測試驗

(1)取穿心蓮內(nèi)酯對照品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加甲醇約3ml，使其溶解，加入0.01mol/l稀鹽酸0.4ml，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分裝于西林瓶中2ml，壓蓋。置于75℃水浴放置1h后用0.01mol/l的naoh調(diào)節(jié)至中性以作為酸破壞待測溶液。

除上述條件改變其他色譜條件及具體步驟同實施例1。結(jié)果見圖3。

圖3中，保留時間為12.771min色譜峰為穿心蓮內(nèi)酯色譜峰。結(jié)果顯示，酸破壞樣品的液相色譜中，降解產(chǎn)物間的分離度均大于1.5，穿心蓮內(nèi)酯降解率約為5％。

表3穿心蓮內(nèi)酯原料藥經(jīng)強酸破壞后hplc色譜圖參數(shù)

實施例4穿心蓮內(nèi)酯對照品經(jīng)強堿破壞后，不同色譜條件下有關(guān)物質(zhì)檢測試驗

由于強堿破壞試驗中產(chǎn)生的雜質(zhì)種類比酸破壞種類多，故以強堿破化穿心蓮內(nèi)酯原料藥在不同的色譜條件下進行有關(guān)物質(zhì)檢測試驗。

(1)取穿心蓮內(nèi)酯對照品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加甲醇約3ml，使其溶解，加入0.01mol/lnaoh溶液0.4ml，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分裝于西林瓶中2ml，壓蓋。置于65℃水浴放置30min后用0.01mol/l的hcl調(diào)節(jié)至中性以作為堿破壞待測溶液。

(2)采用hplc測定(1)步驟中的供試品溶液，色譜條件如下：檢測波長為230nm；柱溫為35℃流速為1ml/min；進樣量為15μl。以水(a)-乙腈(b)為流動相，進行梯度洗脫。梯度1流動相的體積比為：a：b＝80％：20％，進樣20min后流動相變化為梯度2；梯度2流動相的體積比為：a：b＝65％：35％?？傔\行時間為45min，后運行10min。

圖4中，保留時間為13.248min色譜峰為穿心蓮內(nèi)酯色譜峰，降解產(chǎn)物間的分離度均大于1.5，穿心蓮內(nèi)酯降解率約為12％。

表4穿心蓮內(nèi)酯原料藥經(jīng)強堿破壞后，不同色譜條件下檢測hplc色譜圖參數(shù)

實施例5穿心蓮內(nèi)酯對照品經(jīng)強堿破壞后，不同色譜條件下有關(guān)物質(zhì)檢測試驗

由于強堿破壞試驗中產(chǎn)生的雜質(zhì)種類比對照品種類多，故以強堿破化穿心蓮內(nèi)酯原料藥在不同的色譜條件下進行有關(guān)物質(zhì)檢測試驗。

(1)取穿心蓮內(nèi)酯原料約10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加甲醇約3ml，使其溶解，加入0.01mol/lnaoh溶液0.4ml，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分裝于西林瓶中2ml，壓蓋。置于65℃水浴放置30min后用0.01mol/l的hcl調(diào)節(jié)至中性以作為堿破壞待測溶液。

(2)采用hplc測定(1)步驟中的堿破壞溶液，色譜條件如下：檢測波長為220nm；柱溫為30℃流速為1.0ml·min^-1；進樣量為15μl。以水(a)-乙腈(b)為流動相，進行梯度洗脫。梯度1流動相的體積比為：a：b＝75％：25％，進樣20min后流動相變化為梯度2；梯度2流動相的體積比為：a：b＝70％：30％。總運行時間為55min，后運行10min。

圖5中，保留時間為11.653min色譜峰為穿心蓮內(nèi)酯色譜峰，降解產(chǎn)物間的分離度均大于1.5，穿心蓮內(nèi)酯降解率約為12％。

表5穿心蓮內(nèi)酯原料藥經(jīng)強堿破壞后，不同色譜條件下檢測hplc色譜圖參數(shù)

實施例6穿心蓮內(nèi)酯原料藥其有關(guān)物質(zhì)合格度檢測

(1)稱取穿心蓮內(nèi)酯原料藥，加甲醇配制成穿心蓮內(nèi)酯含量為0.001mg/ml的對照溶液；稱取穿心蓮內(nèi)酯原料，加甲醇配制成供試品溶液，所述供試品溶液中穿心蓮內(nèi)酯含量為對照溶液中穿心蓮內(nèi)酯含量的1000倍。

(2)采用hplc分別測定(1)步驟中的對照品溶液和供試品溶液，色譜條件及具體步驟同實施例1。結(jié)果見圖6及圖7。

圖6中，保留時間為12.805min的色譜峰為穿心蓮內(nèi)酯色譜峰，其峰面積為26.51258。圖7中，供試品溶液中單個雜質(zhì)峰的面積均小于對照品溶液色譜圖中穿心蓮內(nèi)酯峰面積。穿心蓮內(nèi)酯原料藥雜質(zhì)表觀含量在0.1％以下，無需進行雜質(zhì)結(jié)構(gòu)確證。

對比例1

采用文獻“一測多評法測定穿心蓮中5個內(nèi)酯類成分的含量”的色譜條件進行堿破壞有關(guān)物質(zhì)檢查。

(1)取穿心蓮內(nèi)酯對照品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加甲醇約3ml，使其溶解，加入0.01mol/lnaoh溶液0.4ml，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分裝于西林瓶中2ml，壓蓋。置于65℃水浴放置40min后用0.01mol/l的hcl調(diào)節(jié)至中性以作為堿破壞待測溶液。

(2)采用hplc測定(1)步驟中的堿破壞溶液，色譜條件如下：色譜柱：thermoc18(4.6mm×250mm，5μm)；檢測波長為226nm；柱溫為25℃流速為0.8ml/min；進樣量為10μl。以水(a)-乙腈(b)為流動相，進行梯度洗脫。0～15min，a：b＝90％：10％；15～25min，a：b＝75％：25％；25～40min，a：b＝60％：40％；40～50min，a：b＝60％：40％；50～70min，a：b＝20％：80％。hplc色譜圖見圖8。

圖8中，保留時間為23.640min色譜峰為穿心蓮內(nèi)酯色譜峰，出峰時間較晚，且雜質(zhì)峰明顯分離不好。因此此文獻方法不適用于穿心蓮內(nèi)酯有關(guān)物質(zhì)檢查。

對比例2

采用文獻“穿心蓮藥材及其制劑中6個內(nèi)酯類成分的含量分析”的色譜條件進行堿破壞有關(guān)物質(zhì)檢查。

(1)堿破壞待測溶液配制同對比例1。

(2)采用hplc測定(1)步驟中的供試品溶液，色譜條件如下：色譜柱：thermoc18(4.6mm×250mm，5μm)；檢測波長為226nm；柱溫為25℃；流速為1.0ml·min^-1；進樣量為10μl。以水(a)-乙腈(b)為流動相，進行梯度洗脫。0～10min，a：b＝70％：30％；10～20min，a：b＝60％：40％；20～25min，a：b＝60％：40％；25～40min，a：b＝50％：50％；40～70min，a：b＝35％：65％。hplc色譜圖見圖9。

圖9中，保留時間為8.600min色譜峰為穿心蓮內(nèi)酯色譜峰，雜質(zhì)峰23.986min、24.873min、25.260min色譜峰分離度均小于1.5。因此此文獻方法不適用于穿心蓮內(nèi)酯有關(guān)物質(zhì)檢查。

應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。