本發(fā)明涉及殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化顯色體系的酸性磷酸酶及其抑制劑的測定方法，屬于分析化學和納米技術領域。

背景技術：

酸性磷酸酶是一種在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無機磷酸的一種水解酶，廣泛分布在一些植物或是哺乳動物的組織中。農(nóng)業(yè)方面，酸性磷酸酶對判斷農(nóng)作物生長的最適ph有重要作用。醫(yī)學方面，其可作為肝炎、甲狀旁腺功能亢進、紅血球病變等疾病的重要診斷指標。因此，酸性磷酸酶含量的測定有著深遠意義。但目前酸性磷酸酶的測定還存在諸多局限，例如，現(xiàn)有方法主要選用4-硝基苯磷酸二鈉作為底物，然而水解反應產(chǎn)生的硝基苯需要在堿性條件下才有比較強的信號，這與酸性磷酸酶的最適催化條件（ph=5.0）相矛盾。故發(fā)展一種更有效、準確的比色方法來測定酸性磷酸酶具有非常重要的實際意義。

酸性磷酸酶在溫度為37℃，ph為5.0的條件下可以水解抗壞血酸磷酸酯，生成抗壞血酸。而具有強還原型的抗壞血酸可以抑制氧化酶對3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽的催化氧化作用，使得3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色不明顯。酸性磷酸酶的含量越高，體系的吸收度值越小?；诖?，可實現(xiàn)對酸性磷酸酶進行定量測定。

本發(fā)明以抗壞血酸磷酸酯為酸性磷酸酶底物，以殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化氧化3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系為檢測信號源，建立了一種比色測定酸性磷酸酶的方法。酸性磷酸酶催化水解反應和殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化氧化3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色反應可在同一ph下進行。該方法簡便、快捷，不涉及任何復雜、貴重的儀器，檢測成本低。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化氧化3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系，以抗壞血酸磷酸酯為底物，從而測定酸性磷酸酶及其抑制劑的方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

本發(fā)明所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的酸性磷酸酶測定方法，其特征是在抗壞血酸磷酸酯和酸性磷酸酶反應產(chǎn)物中加入3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，反應后加入硫酸溶液終止反應，根據(jù)溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，用于酸性磷酸酶含量的測定；所使用的殼聚糖-鉑模擬氧化酶是用殼聚糖作為穩(wěn)定劑，硼氫化鈉還原氯鉑酸得到，具體合成步驟如下：稱取0.1g殼聚糖溶解于50ml濃度為1v/v%的醋酸中，攪拌15分鐘使殼聚糖完全溶解即得到濃度為0.2m/v%的殼聚糖溶液，將2ml濃度為10mmol/l氯鉑酸加入到47ml濃度為0.2m/v%殼聚糖溶液中，攪拌30分鐘，然后逐滴加入1ml濃度為0.2mol/l新配制的硼氫化鈉溶液并在5分鐘之內加完，置于暗處攪拌90分鐘，得到殼聚糖-鉑模擬氧化酶，所得產(chǎn)物避光冷藏保存。

所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的酸性磷酸酶測定方法，其特征是將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl不同濃度的酸性磷酸酶加入到200μlph為5，濃度為50mmol/l的醋酸鹽緩沖液中，混合均勻后在37℃下反應30分鐘，然后依次加入632.5μlph為5，濃度為50mmol/l的醋酸鹽緩沖液、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應，測定溶液的吸光度值a450。

所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的酸性磷酸酶測定方法，其特征是在在0.25~2.5u/l范圍內，吸光度變化值△a450與酸性磷酸酶濃度呈線性關系，檢測限為0.0161u/l。

本發(fā)明所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的測定人血清酸性磷酸酶的方法，其特征是包括如下步驟：將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl人血清加入到200μlph為5，濃度為50mmol/l的醋酸鹽緩沖液中，混合均勻后在37℃下反應30分鐘，依次將632.5μlph為5，濃度為50mmol/l的醋酸鹽緩沖液、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液加入到上述反應液中，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應，測定溶液的吸光度值a450，根據(jù)酸性磷酸酶標準曲線計算人血清中的堿性磷酸酶含量；所使用的殼聚糖-鉑模擬氧化酶是用殼聚糖作為穩(wěn)定劑，硼氫化鈉還原氯鉑酸得到，具體合成步驟如下：稱取0.1g殼聚糖溶解于50ml濃度為1v/v%的醋酸中，攪拌15分鐘使殼聚糖完全溶解即得到濃度為0.2m/v%的殼聚糖溶液，將2ml濃度為10mmol/l氯鉑酸加入到47ml濃度為0.2m/v%殼聚糖溶液中，攪拌30分鐘，然后逐滴加入1ml濃度為0.2mol/l新配制的硼氫化鈉溶液并在5分鐘之內加完，置于暗處攪拌90分鐘，得到殼聚糖-鉑模擬氧化酶。

所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的測定人血清酸性磷酸酶的方法，其特征是得人血清樣品測定的回收率為97.4%~107.8%，相對標準偏差為2.4~6.4%。

本發(fā)明所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的酸性磷酸酶抑制劑的測定方法，其特征是在抗壞血酸磷酸酯、酸性磷酸酶和酸性磷酸酶抑制劑的反應產(chǎn)物中加入3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，反應后加入硫酸溶液終止反應，根據(jù)溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，用于堿性磷酸酶抑制劑抑制率的測定；所使用的殼聚糖-鉑模擬氧化酶是用殼聚糖作為穩(wěn)定劑，硼氫化鈉還原氯鉑酸得到，具體合成步驟如下：稱取0.1g殼聚糖溶解于50ml濃度為1v/v%的醋酸中，攪拌15分鐘使殼聚糖完全溶解即得到濃度為0.2m/v%的殼聚糖溶液，將2ml濃度為10mmol/l氯鉑酸加入到47ml濃度為0.2m/v%殼聚糖溶液中，攪拌30分鐘，然后逐滴加入1ml濃度為0.2mol/l新配制的硼氫化鈉溶液并在5分鐘之內加完，置于暗處攪拌90分鐘，得到殼聚糖-鉑模擬氧化酶。

所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的酸性磷酸酶抑制劑的測定方法，其特征是將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl濃度為0.1u/ml的酸性磷酸酶溶液加入到200μl含不同濃度氟化鈉的ph為5，濃度為50mmol/l的醋酸鹽緩沖液中，混合均勻后在37℃下反應30分鐘，依次加入632.5μlph為5，濃度為50mmol/l的醋酸鹽緩沖液、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應，測定溶液的吸光度值a450，計算抑制率，通過軟件擬合得到氟化鈉的ic50為0.896mmol/l。

具體地說，本發(fā)明采用如下技術方案：

（一）殼聚糖-鉑模擬氧化酶的制備：稱取0.1g殼聚糖溶解于50ml濃度為1%（v/v）的醋酸中，攪拌15分鐘使殼聚糖完全溶解即得到濃度為0.2%（m/v）的殼聚糖溶液。將2ml濃度為10mmol/l氯鉑酸加入到47ml濃度為0.2%殼聚糖溶液中，攪拌30分鐘，然后逐滴加入1ml濃度為0.2mol/l新配制的硼氫化鈉溶液（5分鐘之內加完），置于暗處攪拌90分鐘，得到殼聚糖-鉑模擬氧化酶，所得產(chǎn)物避光冷藏保存。

（二）酸性磷酸酶的測定：將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl不同濃度的酸性磷酸酶加入到200μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）中，混合均勻后在37℃下反應30分鐘；依次加入632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl步驟（一）制備的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應，測定溶液在450nm波長處的吸光度值（a450），繪制標準曲線進行酸性磷酸酶含量測定。

（三）酸性磷酸酶抑制劑的測定：將50μl濃度為0.1u/ml的酸性磷酸酶溶液和50μl濃度為4mmol/l抗壞血酸磷酸酯溶液加入到200μl含不同濃度氟化鈉的醋酸鹽緩沖溶液中（ph5，50mmol/l），搖勻后在37℃下反應30分鐘。依次加入632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl步驟（一）制備的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應，測定溶液吸光度值a450。通過軟件擬合，得到氟化鈉的半抑制濃度ic50。

本發(fā)明的優(yōu)點

（1）本發(fā)明利用酸性磷酸酶水解抗壞血酸磷酸酯生成抗壞血酸，從而抑制殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化顯色反應體系，結合溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，直接用于酸性磷酸酶及其抑制劑含量的測定。

（2）本發(fā)明制備的殼聚糖-鉑模擬氧化酶由殼聚糖作為穩(wěn)定劑，硼氫化鈉還原氯鉑酸得到，其制備過程簡單快速。

（3）本發(fā)明檢測步驟簡單，不涉及任何復雜、貴重的儀器，檢測成本低。

（4）本發(fā)明檢測靈敏度高，酸性磷酸酶的檢測限為0.0161u/l。

附圖說明

圖1為外觀圖。圖中的a對照組：殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽；圖中的b對照組:殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽+抗壞血酸磷酸酯；圖中的c對照組:殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽+酸性磷酸酶；圖中的d實驗組：殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽+抗壞血酸磷酸酯+酸性磷酸酶。

圖2為紫外吸收光譜圖。圖中的a對照組：殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽；圖中的b對照組:殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽+抗壞血酸磷酸酯；圖中的c對照組:殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽+酸性磷酸酶；圖中的d實驗組：殼聚糖-鉑模擬氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽+抗壞血酸磷酸酯+酸性磷酸酶。

圖3為酸性磷酸酶濃度與殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化顯色體系吸光度值a450的線性關系圖。

圖4為酸性磷酸酶測定干擾實驗。數(shù)字0~11依次分別代表空白、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、焦磷酸水解酶、乙酰膽堿酯酶、α-葡萄糖苷酶、膽堿氧化酶、蛋白酶k、過氧化氫酶、溶菌酶和脲酶。

圖5為氟化鈉抑制率曲線圖。

具體實施方式

實施例1：

稱取0.1g殼聚糖溶解于50ml濃度為1%（v/v）的醋酸中，攪拌15分鐘使殼聚糖完全溶解即得到濃度為0.2%（m/v）的殼聚糖溶液。將2ml濃度為10mmol/l氯鉑酸加入到47ml濃度為0.2%（m/v）殼聚糖溶液中，攪拌30分鐘，然后逐滴加入1ml濃度為0.2mol/l新配制的硼氫化鈉溶液（5分鐘之內加完），置于暗處攪拌90分鐘，得到深褐色的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液。產(chǎn)物避光冷藏保存。以上過程中使用的所有玻璃器皿均經(jīng)過王水浸泡，并用雙蒸水徹底清洗，晾干。

實施例2：

將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl濃度為0.1u/ml的酸性磷酸酶加入到200μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）中，混合均勻后在37℃下反應30分鐘。依次加入632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl實施例1制得的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應，目視觀察顏色的變化或測定溶液的紫外-可見吸收光譜。目視觀察顏色變化時，對照組溶液顏色均為深黃色，實驗組溶液顏色變?yōu)闊o色（見圖1）。測定紫外-可見吸收光譜時，對照組的吸收光譜幾乎不發(fā)生變化，而實驗組的吸收光譜在350~550nm區(qū)域的吸收明顯減?。ㄒ妶D2）。

實施例3：

將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl不同濃度的酸性磷酸酶加入到200μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）中，混合均勻后在37℃下反應30分鐘。依次加入632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl實施例1制得的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應，測定溶液的吸光度值a450。由圖3可知，隨著酸性磷酸酶濃度的增大，吸光度值a450的變化值（△a450）逐漸增大。在0.25~2.5u/l范圍內，△a450與酸性磷酸酶濃度呈線性關系，最低檢測限為0.0161u/l。

實施例4：

將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl濃度為0.0125u/ml的酸性磷酸酶加入到200μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）中，混合均勻后在37℃下反應30分鐘。依次加入632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl實施例1制得的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應，測定溶液的吸光度值a450。重復上述實驗步驟9次，得相對標準偏差（rsd）為3.9%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

實施例5：

取正常人血清，與不同濃度的酸性磷酸酶按照1:4的體積比充分混合，得到樣品溶液。將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl上述樣品溶液加入到200μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）中，混合均勻后在37℃下反應30分鐘。在上述反應液中依次加入632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl實施例1制得的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應，測定溶液的吸光度值a450。結合實施例3計算正常人血清中酸性磷酸酶的含量，測定回收率為97.4%~107.8%，相對標準偏差為2.4~6.4%。

實施例6：

酸性磷酸酶測定干擾實驗：將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl濃度為1u/ml其他酶溶液加入到200μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）中，混合均勻后在37℃下反應30分鐘。依次加入632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl實施例1制得的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，立即加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應，測定溶液的吸光度值a450。由圖4可知，即使其他酶的濃度比酸性磷酸酶高10倍，仍不能產(chǎn)生明顯的干擾，表明本方法對酸性磷酸酶具有良好的選擇性。

實施例7：

將50μl濃度為4mmol/l的抗壞血酸磷酸酯和50μl濃度為0.1u/ml的酸性磷酸酶溶液加入到200μl含不同濃度氟化鈉的醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）中，混合均勻后在37℃下反應30分鐘。依次加入632.5μl醋酸鹽緩沖液（ph5，50mmol/l）、50μl濃度為3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和17.5μl實施例1制得的殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，加入200μl濃度為2mol/l的硫酸溶液終止反應，測定溶液的吸光度值a450，計算抑制率。結果如圖5所示，通過軟件擬合得到氟化鈉的ic50為0.896mmol/l。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改，等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。