本發(fā)明涉及血清或血漿中抗苗勒氏管激素含量的檢測(cè)技術(shù)，尤其是涉及一種人抗苗勒氏管激素的流式檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗苗勒氏管激素(anti-mullerianhormone，amh)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的成員之一，由professoralfredjost首先發(fā)現(xiàn)。amh是由兩個(gè)相同的70×10³da亞基，通過二硫鍵連接組成的二聚糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為140×10³da；人類amh編碼基因位于19號(hào)染色體短臂，大小2.4～2.8kb，含有5個(gè)外顯子?？姑缋帐瞎芗に?amh)在性腺器官發(fā)育過程中起著重要作用，是男女性腺功能的重要標(biāo)記物之一。在男性中amh主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，始于胚胎形成并貫穿生命始終；在男性胎兒的發(fā)育過程中，amh導(dǎo)致苗勒氏管退化，形成正常發(fā)育的男性生殖管道。在女性中amh主要由卵巢顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，血清amh保持相對(duì)于男性較低的一個(gè)水平，從青春期開始，血清amh水平隨時(shí)間慢慢降低，并在更年期降低。

amh是由卵巢竇前卵泡和小竇狀卵泡顆粒細(xì)胞分泌的活性因子，不受促性腺激素(gn)的反饋調(diào)節(jié)，可抑制卵泡的募集和選擇，在始基卵泡上無表達(dá)，在初級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞上弱表達(dá)，在≤4mm的小竇卵泡中強(qiáng)表達(dá)，而在＞4mm竇卵泡中表達(dá)逐漸減弱至完全消失。抑制卵泡生長(zhǎng)，參與了卵泡形成的兩個(gè)重要調(diào)控，始基卵泡募集和周期募集。較其它卵巢評(píng)價(jià)指標(biāo)更能準(zhǔn)確地反映育齡期女性機(jī)體內(nèi)分泌狀態(tài)。人體內(nèi)，amh的平均半衰期為(27.6±0.8)h，完全清除約需8d。正常生育期女性血清amh與年齡呈負(fù)相關(guān)，在0.43～43.19pmol/l間波動(dòng)，峰值處于18～25歲，36歲后顯著下降，41～47歲時(shí)降至8.0pmol/l，各個(gè)年齡段amh的正常參考范圍均較大。隨著amh的作用被越來越多人所熟知，amh逐步被應(yīng)用于婦科內(nèi)分泌疾病、生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、性別異常等范疇。

多囊卵巢綜合征(pcos)是一種生殖功能障礙和糖代謝異常并存的內(nèi)分泌紊亂綜合征，存在于5％～10％的育齡期女性中，主要表現(xiàn)為稀少排卵或不排卵、閉經(jīng)、不孕，卵巢多囊樣改變、高雄激素和高胰島素血癥。amh水平與pcos的診斷和管理有潛在相關(guān)性。血清amh可預(yù)測(cè)卵巢功能減退及絕經(jīng)年齡。卵巢功能減退指卵巢產(chǎn)生卵母細(xì)胞的能力降低，卵泡質(zhì)量下降，進(jìn)一步可發(fā)展為卵巢早衰(pof)，嚴(yán)重影響女性生殖能力。

pof患者血清amh水平相當(dāng)于絕經(jīng)期婦女a(chǎn)mh水平，在絕經(jīng)前5年開始，逐漸降低，故認(rèn)為血清amh可以預(yù)測(cè)絕經(jīng)年齡。pof患者的竇前卵泡存在缺陷，分泌amh低，低amh水平加速原始卵泡的募集，形成惡性循環(huán)，使原始卵泡庫(kù)存提早衰竭。pof患者竇卵泡閉鎖或者黃素化，導(dǎo)致amh低表達(dá)，可能與顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)。胎兒性器官分化與amh密切相關(guān)，男性睪丸的發(fā)育和功能與amh亦有關(guān)，amh的檢測(cè)可以幫助分辨隱睪癥、單睪癥、持續(xù)性苗勒管綜合征(pmds)等。

有研究不斷證實(shí)amh是預(yù)測(cè)卵巢功能的最佳血清學(xué)指標(biāo)，聯(lián)合竇卵泡數(shù)(afc)和fsh時(shí)更為準(zhǔn)確。然而，隨著amh應(yīng)用的廣泛深入，對(duì)其實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)也提出了更高的要求，且目前尚存以下一些亟待解決的問題：(1)目前尚無統(tǒng)一的amh檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和校正衡量值；(2)由于檢測(cè)技術(shù)的原因，各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)值波動(dòng)較大；這為新的anh檢測(cè)技術(shù)提供的研發(fā)方向和應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種準(zhǔn)確快速的人抗苗勒管激素的流式檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng)用，該流式檢測(cè)試劑可有效檢測(cè)人血清或血液中的抗苗勒管激素，檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到0.01ng/ml。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：

1、一種人抗苗勒管激素的流式檢測(cè)試劑，包括用于檢測(cè)人血清或血液中抗苗勒管激素含量的抗體ab1-微球偶聯(lián)物和抗體ab2-熒光分子標(biāo)記物，其中抗體微球偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)通式如圖1所示，其中m為高分子材料制成的單分散微球，r為功能結(jié)合鍵，ab1為amh單克隆抗體1；所述的抗體熒光分子標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)通式如圖2所示，其中ab2為amh單克隆抗體2，f為熒光分子。

所述的抗體ab1和ab2為成熟amh蛋白片段免疫小鼠所制備的amh單克隆抗體對(duì)，所述的抗體ab1和ab2能同時(shí)與amh抗原結(jié)合，所述的成熟amh蛋白片段的氨基酸序列如下：sagataadgpcalrelsvdlraersvlipetyqanncqgvcgwpqsdrnprygnhvvlllkmqargaalarppccvptayagkllislseerisahhvpnmvatecgcr。

所述的amh單克隆抗體對(duì)是從20個(gè)鼠源amh單克隆抗體庫(kù)中利用十字交叉法篩選配對(duì)得到的配對(duì)效果最佳一對(duì)抗體。

所述的單分散微球的直徑為3-30微米，材質(zhì)為聚苯乙烯(ps)或二氧化硅(sio2)，所述的單分散微球的外表面功能化修飾有羧基、氨基、羥基或巰基；所述的功能結(jié)合鍵為羧基與氨基結(jié)合的酰胺鍵或者羥基與羧基的結(jié)合鍵或者巰基與羥基的結(jié)合鍵；所述的熒光分子為偶聯(lián)的熒光染料，所述的熒光染料為異硫氰酸熒光素(fitc)、藻紅蛋白(pe)、藻藍(lán)蛋白(apc)、異硫氰酸鹽羅丹明b、四甲基異硫氰酸羅丹明或花青染料(cy2/3/5)。

2、上述人抗苗勒管激素的流式檢測(cè)試劑的制備方法，具體步驟如下：

(1)amh單克隆抗體的制備

選取一段成熟amh蛋白片段序列作為制備抗苗勒管激素抗體庫(kù)的抗原，將抗原的堿基序列克隆至原核表達(dá)載體pet-41a上，e.coli原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出amh抗原蛋白，用親和層析的方法純化帶標(biāo)簽的amh抗原蛋白；所述的成熟amh蛋白片段的氨基酸序列如下：sagataadgpcalrelsvdlraersvlipetyqanncqgvcgwpqsdrnprygnhvvlllkmqargaalarppccvptayagkllislseerisahhvpnmvatecgcr；

將amh抗原蛋白用水溶性佐劑接種免疫5只6-8周齡balb/c品系小鼠，于第一天、第十四天、第二十一天和第三十五天分別進(jìn)行免疫，采集小鼠第一天和第三十五天的小鼠血清各100ul，elisa檢測(cè)血清效價(jià)；當(dāng)效價(jià)達(dá)到1：50000后，選取血清效價(jià)最高的小鼠，拉勁處死，取該小鼠的脾臟，獲取脾細(xì)胞，然后與小鼠balb/c品系骨髓瘤細(xì)胞sp2/0進(jìn)行3次融合；在融合24小時(shí)后，加hat選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)兩周，采用96孔板克隆化細(xì)胞，篩選出雜交瘤細(xì)胞；用elisa檢測(cè)克隆培養(yǎng)上清，檢測(cè)出抗原陽(yáng)性100-500個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)至48孔板，挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增，elisa檢測(cè)克隆培養(yǎng)上清，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，挑選40株效價(jià)最高的陽(yáng)性克隆進(jìn)行亞克隆化，每個(gè)亞克隆做96孔板有限稀釋培養(yǎng)，elisa篩選培養(yǎng)上清，每個(gè)母克隆挑選2個(gè)陽(yáng)性亞克隆；陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，elisa檢測(cè)上清效價(jià)大于1：20000，挑取20個(gè)效價(jià)最高的克隆做96孔板有限稀釋培養(yǎng)，放大培養(yǎng)至t-25flask培養(yǎng)，培養(yǎng)的上清用proteina或proteing純化即得到純度達(dá)到90％以上的amh單克隆抗體庫(kù)；

(2)雙抗夾心法篩選能夠配對(duì)的amh抗體對(duì)

將20個(gè)純化好的單克隆抗體用辣根過氧化物酶標(biāo)記，同時(shí)將這20個(gè)單克隆抗體包被板，采用十字交叉法檢測(cè)配對(duì)效果，以抗原濃度和標(biāo)記抗體的量為變量因素，設(shè)置陰性對(duì)照，空白對(duì)照，如果測(cè)定值為陰性值的2.1倍，則表示為陽(yáng)性，篩選出一對(duì)配對(duì)效果最佳的抗體對(duì)ab1和ab2，作為偶聯(lián)微球和熒光分子的前期材料；

(3)amh單克隆抗體ab1與微球偶聯(lián)

將碳二亞胺(edc)粉末和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)粉末加入到濃度為1mg/ml的amh單克隆抗體ab1溶液中，室溫避光反應(yīng)15分鐘，然后向反應(yīng)溶液中加入濃度為0.5wt％的單分散微球溶液，30℃避光震蕩反應(yīng)4小時(shí)，用含1wt％的sds溶液洗滌微球2次，濃度為0.5wt％吐溫-20的pbs溶液洗滌微球3次，即得到用于檢測(cè)血清或血液中amh含量的抗體ab1-微球偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式如圖1所示，其中m為高分子材料制成的單分散微球，r為功能結(jié)合鍵，ab1為amh單克隆抗體1，將抗體ab1-微球偶聯(lián)物保存于含0.5wt％nacl，ph＝7.4的pb溶液中，待用；

(4)amh單克隆抗體ab2的熒光分子標(biāo)記

將濃度為1-10mg/ml的待交聯(lián)的amh單克隆抗體ab2溶液，于4℃用交聯(lián)反應(yīng)液透析三次，至ph＝9.0得到抗體ab2溶液；將熒光分子溶于二甲基亞砜中配置成濃度為1mg/ml的熒光分子溶液；將熒光分子溶液緩慢加入抗體ab2溶液中，邊加邊輕輕晃動(dòng)使其與抗體混合均勻，避光4℃反應(yīng)8h；然后在反應(yīng)液中加入5mol/l的nh4cl直至nh4cl終濃度為50mmol/l，4℃終止反應(yīng)2h，然后在pbs緩沖液中透析四次以上直至透析液清亮，即得到用于檢測(cè)血清或血液中amh含量的抗體ab2-熒光分子標(biāo)記物，其結(jié)構(gòu)通式如圖2所示，其中ab2為amh單克隆抗體2，f為熒光分子，將抗體ab2-熒光分子標(biāo)記物置于ph＝7.4的含有0.1wt％nan3、1wt％bsa磷酸鹽緩沖液中，4℃避光保存。

步驟(2)所述的十字交叉法檢測(cè)配對(duì)效果具體方法如下：

a.將單克隆抗體用0.05mph＝9.0碳酸鹽包被緩沖液稀釋得到濃度為1-10μg/ml的抗體溶液，在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml抗體溶液，4℃包被過夜；次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液沖洗3次，每次3分鐘；

b.加樣：取4ng/ml、0.4ng/ml、40pg/ml和4pg/ml四個(gè)濃度的amh抗原樣品0.1ml分別上述已包被的反應(yīng)孔中，放置37℃孵育1小時(shí)，然后洗滌，同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔；

c.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體0.1ml，37℃孵育0.5-1小時(shí)，洗滌3次；

d.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的tmb底物溶液0.1ml，37℃顯色10-30分鐘；

e.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2m硫酸0.05ml，終止顯色反應(yīng)；

f.結(jié)果判定：在elisa檢測(cè)儀上，于450nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔o(hù)d值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照od值的2.1倍，即為陽(yáng)性，重復(fù)此實(shí)驗(yàn)三次，選取陽(yáng)性中od值最大的反應(yīng)孔所對(duì)應(yīng)的一對(duì)抗體，即為配對(duì)效果最佳的amh蛋白的單克隆配對(duì)抗體ab1和ab2。

步驟(3)中所述的單分散微球的直徑為3-30微米，材質(zhì)為聚苯乙烯(ps)、二氧化硅(sio2)，單分散微球的外表面具有功能化修飾羧基、氨基、羥基或巰基；所述的功能結(jié)合鍵為羧基與氨基結(jié)合的酰胺鍵或者羥基與羧基的結(jié)合鍵或者巰基與羥基的結(jié)合鍵。

所述的碳二亞胺、所述的n-羥基琥珀酰亞胺、所述的單分散微球溶液與所述的amh單克隆抗體ab1溶液的混合比例為28g：56g：2ml：1ml。

步驟(4)所述的抗體ab2蛋白與所述的熒光分子交聯(lián)時(shí)的比例為1mg：15μg。所述的熒光分子為偶聯(lián)的熒光染料，所述的熒光染料為異硫氰酸熒光素(fitc)、藻紅蛋白(pe)、藻藍(lán)蛋白(apc)、異硫氰酸鹽羅丹明b、四甲基異硫氰酸羅丹明或花青染料(cy2/3/5)。

上述人抗苗勒氏管激素的流式檢測(cè)試劑的應(yīng)用，將流式檢測(cè)試劑的用于檢測(cè)人抗苗勒氏管激素含量具體步驟如下：

將待測(cè)樣本人血清或血液加入到抗體ab1-微球偶聯(lián)物溶液中，然后加入一定體積的抗體ab2-熒光分子標(biāo)記物溶液，37度孵育30min，樣本中的inhb分別與ab1抗體微球偶聯(lián)物和ab2抗體熒光分子標(biāo)記物結(jié)合形成微球-ab1-amh-ab2-熒光分子復(fù)合體，經(jīng)流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)出熒光分子發(fā)射出的熒光，根據(jù)熒光強(qiáng)度與amh的濃度關(guān)系，計(jì)算獲得樣本中的人抗苗勒氏管激素含量，其中ab1抗體ab1-微球偶聯(lián)物與抗體ab2-熒光分子標(biāo)記物的摩爾比為1：1。

具體檢測(cè)原理如下：血清或血液等樣本加入到amh單克隆抗體ab1-微球偶聯(lián)物溶液中，然后加入一定體積的amh單克隆抗體ab2的熒光分子標(biāo)記物溶液，37度孵育30min。由于抗原抗體結(jié)合的特異性，樣本中的amh會(huì)分別與ab1-微球偶聯(lián)物和ab2的熒光分子標(biāo)記物結(jié)合形成微球-ab1-amh-ab2-熒光分子復(fù)合體，此復(fù)合體由于偶聯(lián)在微球上，具有一定粒徑大小，經(jīng)流式細(xì)胞儀上機(jī)，即可被識(shí)別，同時(shí)此復(fù)合體上標(biāo)記有熒光分子，經(jīng)流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)出熒光分子發(fā)射出的熒光，熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱與樣本中amh的含量成正相關(guān)性，根據(jù)amh濃度與體系中的熒光強(qiáng)度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以對(duì)通過流式細(xì)胞儀上未知樣本的熒光強(qiáng)度，對(duì)樣本中的amh進(jìn)行定量。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明本發(fā)明人抗苗勒氏管激素的流式檢測(cè)試劑及其制備方法，采用amh單克隆抗體庫(kù)篩選出一對(duì)特異性最高的單克隆抗體對(duì)，并且能夠很好的與血液中的amh結(jié)合，最大限度的減少了樣本中其他類似成分的干擾，使得檢測(cè)準(zhǔn)確度更高。其通過抗體微球偶聯(lián)技術(shù)和抗體熒光標(biāo)記技術(shù)，將檢測(cè)試劑做成即用型試劑，往試劑里加入血清或血樣后，根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合，樣本中的amh就能夠與抗體微球和熒光抗體結(jié)合，形成復(fù)合體，此復(fù)合體上含有的一定粒徑的微球和熒光分子能被流式細(xì)胞儀所識(shí)別，熒光強(qiáng)弱直接反應(yīng)了樣本中amh含量的多少，實(shí)現(xiàn)了樣本中amh的流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)。

綜上所述，本發(fā)明首次通過微球偶聯(lián)抗體技術(shù)和熒光標(biāo)記抗體技術(shù)實(shí)現(xiàn)了流式細(xì)胞儀檢測(cè)amh，根據(jù)熒光值的強(qiáng)弱直接判斷amh含量的高低，只需往試劑中添加血液樣本，就能得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，簡(jiǎn)化了檢測(cè)過程中的實(shí)驗(yàn)操作步驟，同時(shí)配合自動(dòng)加樣系統(tǒng)，就可實(shí)現(xiàn)高通量多樣本的連續(xù)檢測(cè)，極大的提高了檢測(cè)的效率，檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到0.01ng/ml。

附圖說明

圖1為本發(fā)明抗體微球偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)通式示意圖；其中m為高分子材料制成的單分散微球，r為功能結(jié)合鍵，ab1為amh單克隆抗體1；

圖2為本發(fā)明抗體熒光分子標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)通式示意圖，其中ab2為amh單克隆抗體2，f為熒光分子。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

具體實(shí)施一

一種人抗苗勒管激素的流式檢測(cè)試劑，包括用于檢測(cè)人血清或血液中抗苗勒管激素含量的抗體ab1-微球偶聯(lián)物和抗體ab2-熒光分子標(biāo)記物，其中抗體微球偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)通式如圖1所示，m為高分子材料制成的單分散微球，r為功能結(jié)合鍵，ab1為amh單克隆抗體1；抗體熒光分子標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)通式如圖2所示，其中ab2為amh單克隆抗體2，f為熒光分子。

上述抗體ab1和ab2為成熟amh蛋白片段免疫小鼠所制備的amh單克隆抗體對(duì)，所述的抗體ab1和ab2能同時(shí)與amh抗原結(jié)合。

上述amh單克隆抗體對(duì)是從20個(gè)鼠源amh單克隆抗體庫(kù)中利用十字交叉法篩選配對(duì)得到的配對(duì)效果最佳一對(duì)抗體。

上述單分散微球的直徑為3-30微米，材質(zhì)為聚苯乙烯(ps)或二氧化硅(sio2)，所述的單分散微球的外表面功能化修飾有羧基、氨基、羥基或巰基；所述的功能結(jié)合鍵為羧基與氨基結(jié)合的酰胺鍵或者羥基與羧基的結(jié)合鍵或者巰基與羥基的結(jié)合鍵；所述的熒光分子為偶聯(lián)的熒光染料，所述的熒光染料為異硫氰酸熒光素(fitc)、藻紅蛋白(pe)、藻藍(lán)蛋白(apc)、異硫氰酸鹽羅丹明b、四甲基異硫氰酸羅丹明或花青染料(cy2/3/5)。

具體實(shí)施例二

人抗苗勒管激素的流式檢測(cè)試劑的制備方法，具體步驟如下：

(1)amh單克隆抗體的制備

首先從uniprot網(wǎng)站上獲取完整的amh蛋白的編碼序列和翻譯成熟的相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，用蛋白相關(guān)軟件分析氨基酸序列的穩(wěn)定性，抗原表位性，以及生理?xiàng)l件下amh的結(jié)構(gòu)與序列；選取一段成熟amh蛋白序列(成熟片段較穩(wěn)定，不會(huì)被降解)(其中成熟amh蛋白片段的氨基酸序列如下所示：sagataadgpcalrelsvdlraersvlipetyqanncqgvcgwpqsdrnprygnhvvlllkmqargaalarppccvptayagkllislseerisahhvpnmvatecgcr)作為制備抗苗勒管激素抗體庫(kù)的抗原，將抗原的堿基序列克隆至原核表達(dá)載體pet-41a上，e.coli原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出amh抗原蛋白，用親和層析的方法純化帶標(biāo)簽的amh抗原蛋白；

將amh抗原蛋白用水溶性佐劑接種免疫5只6-8周齡balb/c品系小鼠，于第一天、第十四天、第二十一天和第三十五天分別進(jìn)行免疫，采集小鼠第一天和第三十五天的小鼠血清各100ul，elisa檢測(cè)血清效價(jià)；當(dāng)效價(jià)達(dá)到1：50000后，選取血清效價(jià)最高的小鼠，拉勁處死，取該小鼠的脾臟，獲取脾細(xì)胞，然后與小鼠balb/c品系骨髓瘤細(xì)胞sp2/0進(jìn)行3次融合；在融合24小時(shí)后，加hat選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)兩周，采用96孔板克隆化細(xì)胞，篩選出雜交瘤細(xì)胞；用elisa檢測(cè)克隆培養(yǎng)上清，檢測(cè)出抗原陽(yáng)性100-500個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)至48孔板，挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增，elisa檢測(cè)克隆培養(yǎng)上清，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，挑選40株效價(jià)最高的陽(yáng)性克隆進(jìn)行亞克隆化，每個(gè)亞克隆做96孔板有限稀釋培養(yǎng)，elisa篩選培養(yǎng)上清，每個(gè)母克隆挑選2個(gè)陽(yáng)性亞克??；陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，elisa檢測(cè)上清效價(jià)大于1：20000，挑取20個(gè)效價(jià)最高的克隆做96孔板有限稀釋培養(yǎng)，放大培養(yǎng)至t-25flask培養(yǎng)，培養(yǎng)的上清用proteina或proteing純化即得到純度達(dá)到90％以上的amh單克隆抗體庫(kù)；

(2)雙抗夾心法篩選能夠配對(duì)的amh抗體對(duì)

將20個(gè)純化好的單克隆抗體用辣根過氧化物酶標(biāo)記，同時(shí)將這20個(gè)單克隆抗體包被板，采用十字交叉法檢測(cè)配對(duì)效果，以抗原濃度和標(biāo)記抗體的量為變量因素，設(shè)置陰性對(duì)照，空白對(duì)照，如果測(cè)定值為陰性值的2.1倍，則表示為陽(yáng)性，篩選出一對(duì)配對(duì)效果最佳的抗體對(duì)ab1和ab2，作為偶聯(lián)微球和熒光分子的前期材料；

其中十字交叉法檢測(cè)配對(duì)效果具體方法如下：

a.將單克隆抗體用0.05mph＝9.0碳酸鹽包被緩沖液稀釋得到濃度為1-10μg/ml的抗體溶液，在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml上述抗體溶液，4℃包被過夜；次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液沖洗3次，每次3分鐘；

b.加樣：取4ng/ml、0.4ng/ml、40pg/ml和4pg/ml四個(gè)濃度的amh抗原樣品0.1ml分別上述已包被的反應(yīng)孔中，放置37℃孵育1小時(shí)，然后洗滌，同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔；

c.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋(經(jīng)滴定后的稀釋度分別為0.5k、1k和2k)的酶標(biāo)抗體0.1ml，37℃孵育0.5-1小時(shí)，洗滌3次；

d.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的tmb底物溶液0.1ml，37℃顯色10-30分鐘；

e.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2m硫酸0.05ml，終止顯色反應(yīng)；

f.結(jié)果判定：在elisa檢測(cè)儀上，于450nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔o(hù)d值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照od值的2.1倍，即為陽(yáng)性，重復(fù)此實(shí)驗(yàn)三次，選取陽(yáng)性中od值最大的反應(yīng)孔所對(duì)應(yīng)的一對(duì)抗體，即為配對(duì)效果最佳的amh蛋白的單克隆配對(duì)抗體ab1和ab2；

(3)amh單克隆抗體ab1與微球偶聯(lián)

將碳二亞胺(edc)粉末和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)粉末加入到濃度為1mg/ml的amh單克隆抗體ab1溶液中，室溫避光反應(yīng)15分鐘，然后向反應(yīng)溶液中加入濃度為0.5wt％的單分散微球溶液，30℃避光震蕩反應(yīng)4小時(shí)，用含1wt％的sds溶液洗滌微球2次，濃度為0.5wt％吐溫-20的pbs溶液洗滌微球3次，即得到用于檢測(cè)血清或血液中amh含量的抗體ab1-微球偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式如圖1所示，其中m為高分子材料制成的單分散微球，r為功能結(jié)合鍵，ab1為amh單克隆抗體1，將抗體ab1-微球偶聯(lián)物保存于含0.5wt％nacl，ph＝7.4的pb溶液中，待用；其中單分散微球的直徑為3-30微米，材質(zhì)為聚苯乙烯(ps)、二氧化硅(sio2)，單分散微球的外表面具有功能化修飾羧基、氨基、羥基或巰基；功能結(jié)合鍵為羧基與氨基結(jié)合的酰胺鍵或者羥基與羧基的結(jié)合鍵或者巰基與羥基的結(jié)合鍵；碳二亞胺、n-羥基琥珀酰亞胺、單分散微球溶液與amh單克隆抗體ab1溶液的混合比為28g：56g：2ml：1ml；

(4)amh單克隆抗體ab2的熒光分子標(biāo)記

將濃度1-10mg/ml的待交聯(lián)的amh單克隆抗體ab2溶液，于4℃用交聯(lián)反應(yīng)液(交聯(lián)反應(yīng)液的主要成分為：0.09mnahco3，0.01mna2co3，0.125mnacl)透析三次，至ph＝9.0得到抗體ab2溶液；將熒光分子溶于二甲基亞砜中配置成濃度為1mg/ml的熒光分子溶液(每次交聯(lián)使用的熒光分子溶液均應(yīng)新鮮配制，避光)；將熒光分子溶液緩慢加入抗體ab2溶液中，邊加邊輕輕晃動(dòng)使其與抗體混合均勻，避光4℃反應(yīng)8h；然后在反應(yīng)液中加入5mol/l的nh4cl直至nh4cl終濃度為50mmol/l，4℃終止反應(yīng)2h，然后在pbs緩沖液中透析四次以上直至透析液清亮，即得到用于檢測(cè)血清或血液中amh含量的抗體ab2-熒光分子標(biāo)記物，其結(jié)構(gòu)通式如圖2所示，其中ab2為amh單克隆抗體2，f為熒光分子，將抗體ab2-熒光分子標(biāo)記物置于ph＝7.4的含有0.1wt％nan3、1wt％bsa磷酸鹽緩沖液中，4℃避光保存；其中抗體ab2蛋白與熒光分子交聯(lián)時(shí)的比例為1mg：15μg，熒光分子為偶聯(lián)的熒光染料，熒光染料為異硫氰酸熒光素(fitc)、藻紅蛋白(pe)、藻藍(lán)蛋白(apc)、異硫氰酸鹽羅丹明b、四甲基異硫氰酸羅丹明或花青染料(cy2/3/5)。

具體實(shí)施例三

上述人抗苗勒氏管激素的流式檢測(cè)試劑的應(yīng)用，將流式檢測(cè)試劑的用于檢測(cè)人抗苗勒氏管激素含量具體步驟如下：將待測(cè)樣本人血清或血液加入到抗體ab1-微球偶聯(lián)物溶液中，然后加入一定體積的抗體ab2-熒光分子標(biāo)記物溶液，37度孵育30min，樣本中的inhb分別與ab1抗體微球偶聯(lián)物和ab2抗體熒光分子標(biāo)記物結(jié)合形成微球-ab1-amh-ab2-熒光分子復(fù)合體，經(jīng)流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)出熒光分子發(fā)射出的熒光，根據(jù)熒光強(qiáng)度與amh的濃度關(guān)系，計(jì)算獲得樣本中的人抗苗勒氏管激素含量，其中抗體ab1-微球偶聯(lián)物與抗體ab2-熒光分子標(biāo)記物的摩爾比為1：1。

上述說明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

序列表

<110>浙江星博生物科技股份有限公司

<120>人抗苗勒氏管激素的流式檢測(cè)試劑及其制備方法和應(yīng)用

<130>

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>109

<212>氨基酸

<213>人工序列

<220>

<223>成熟amh蛋白片段

<400>1

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