本發(fā)明涉及一種精子頂體酶的提取技術(shù)，尤其是涉及一種精子頂體酶的快速提取方法及其活性的流式檢測方法。
背景技術(shù)：
：人類精子進入女性生殖道后，必須經(jīng)過一段成熟過程，獲得受精能力，此期間精子所發(fā)生的一系列生理變化稱為獲能。獲能后的精子穿過卵丘、放射冠，到達透明帶時，經(jīng)過精卵識別、質(zhì)膜變化、頂體酶釋放、透明帶酶解，精子細胞核進入卵細胞與核相溶，這一系列復(fù)雜的過程構(gòu)成了廣義上的頂體反應(yīng)，而狹義頂體反應(yīng)主要包括透明帶誘發(fā)的質(zhì)膜融合與頂體酶的釋放兩個關(guān)鍵過程。目前的實驗室研究以及臨床診斷最關(guān)注的也是這兩個過程的分子機制和臨床檢測。其中質(zhì)膜融合主要檢測方法是通過體外模擬誘發(fā)精子頂體膜發(fā)生變化，并利用特異性染色的方法進行觀察，頂體酶釋放過程主要關(guān)注釋放出的酶的活性檢測。頂體酶存在于精子頂體內(nèi)膜及赤道部膜上，它是受精過程中重要的蛋白水解酶，通常以無活性的酶原形式存在于頂體內(nèi)。當(dāng)精子頭部進入卵透明帶時，頂體酶原被活化為頂體酶水解卵透明帶，使精子穿過卵透明帶最終與卵子融合。頂體酶活性是判斷男性精子功能和生育力強弱的重要評價指標(biāo)。同時，因頂體酶活性越高，精子穿透能力就越強，故將其作為輔助生殖技術(shù)(ART)助孕方式選擇的評價指標(biāo)之一。頂體酶活性定量檢測是輔助生殖中心常用的檢測項目。頂體酶的檢測最開始是利用頂體酶抗體進行放射免疫法或熒光免疫法進行檢測，通過觀察精子頂體內(nèi)頂體酶的數(shù)量判斷精子受精的能力。由于此方法具有很多局限性，后來Kennedy等人發(fā)現(xiàn)了一種能夠被頂體酶所酶切的底物，Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽(BAPNA)，此底物被頂體酶水解后能夠顯色，通過將精子頂體酶提取，然后酶切BAPNA底物，通過最終反應(yīng)體系顏色的深淺來判斷頂體酶活性的高低。該方法得出的指標(biāo)更能反應(yīng)精子頂體酶的生理功能，現(xiàn)已成為男科學(xué)實驗室的普遍檢測方法。但由于精子樣本中頂體酶本身的活性并不高，通常為μIU級別，因此對于一些酶活較低的樣本存在靈敏度不夠高難以準(zhǔn)確定量的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種實現(xiàn)精子頂體酶的快速釋放和分離的精子頂體酶的快速提取方法，同時提供一種靈敏度高，檢測速度快的精子頂體酶活性的流式檢測方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：1、一種精子頂體酶的快速提取方法，包括以下步驟：(1)將含有7.5*106個精子數(shù)目的精液加入到離心管中，于10000rpm離心2min，吸去離心后管內(nèi)的精漿部份，保留下層精子沉淀；(2)在含有精子沉淀的離心管中加入200uL破膜液，使精子沉淀團均勻懸浮后，于7000rpm離心2min后，去掉上清，然后加入400uL提取液，使精子于37℃懸浮10min，再于12000rpm離心3min后，收集上清，即獲得頂體酶提取物，其中每100ml破膜液中含磷酸二氫鈉1.2g，Triton-1000.2-0.4ml和疊氮鈉0.05g；每100ml提取液中含BSA1g、氯化鈉0.35g、磷酸一氫鈉1.19g、二水磷酸二氫鈉0.25g和疊氮鈉0.05g。所述的破膜液的配制方法如下：準(zhǔn)確稱量磷酸二氫鈉1.2g、疊氮鈉0.05g和0.2-0.4mlTriton-100溶于80亳升去離子水中，用1NHCl調(diào)節(jié)pH至4-6后，用去離子水定容至100毫升，用0.22微米的濾膜過濾后即得到破膜液。破膜液采用了Triton-100和磷酸鹽緩沖液，可以加快酶的釋放速度和促進酶的穩(wěn)定，triton-100破壞精子膜，便于頂體酶的釋放，磷酸鹽緩沖液維持低pH，保持酶活；疊氮鈉為防腐劑。所述的提取液的配制方法如下：準(zhǔn)確稱量牛血清白蛋白(BSA)1g，氯化鈉0.35g，磷酸一氫鈉1.19g，二水磷酸二氫鈉0.25g和疊氮鈉0.05g，溶于80亳升去離子水中，用1N氫氧化鈉調(diào)pH至7.0-8.0，然后用去離子水定容至100亳升，用0.22微米的濾膜過濾后即得到提取液。提取液采用了BSA和磷酸鹽緩沖液，可以加快酶的釋放速度和促進酶的穩(wěn)定，磷酸鹽緩沖液維持恒定pH，便于頂體酶的釋放，BSA保持穩(wěn)定的酶活；疊氮鈉為防腐劑。2、一種精子頂體酶活性的流式檢測方法，包括以下步驟：(1)收集樣本：將新鮮采集、液化完全的精子樣本通過精子計數(shù)儀計數(shù)后，取7.5*106個精子數(shù)目的精液，于10000rpm離心2min，用槍頭吸棄上清，留下精子樣本沉淀待用；(2)裂解細胞：向步驟(1)中得到的精子細胞沉淀里加入200uL破膜液，用槍頭上下吹打細胞，使精子細胞充分重懸，將重懸液7000rpm離心2-4min后(不能超過5min否則將影響頂體酶活性)，用槍頭吸去上清液，留下沉淀待用；(3)溶解頂體酶：向步驟(2)中的沉淀細胞團里加入400uL提取液，用槍頭上下吸打，充分混勻沉淀，在37攝氏度金屬浴上孵育10min后，12000rpm離心2min，吸取上清液即為的體酶提取液；溫度過高或者過低、時間過長或者過短都會影響提取的頂體酶活性；(4)酶切熒光微球：吸取步驟(3)中得到的頂體酶提取液100uL，加入100uLPB緩沖溶液，再加入含有5*104個頂體酶底物熒光微球的溶液，使酶切體系為250uL，24攝氏度孵育1小時后，加入終止劑終止反應(yīng)1-2min；(5)流式檢測：將步驟(4)中酶切反應(yīng)后的混合液在流式細胞儀上進行檢測；(6)酶活計算：根據(jù)流式細胞儀上得到的熒光值，計算熒光衰減率，根據(jù)酶活衰減率標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.0001X2+0.0355X+67.324，計算獲得頂體酶的酶活，其中y代表頂體酶酶活性，單位為μIU，X代表熒光衰減率。步驟(2)中所述的破膜液配方為：每100ml破膜液中含磷酸二氫鈉1.2g，TritonX-1000.2-0.4ml和疊氮鈉0.05g。步驟(3)中所述的提取液配方為：每100ml提取液中含BSA1g、氯化鈉0.35g、磷酸一氫鈉1.19g、二水磷酸二氫鈉0.25g和疊氮鈉0.05g。步驟(4)中所述PB緩沖溶液的配方為：0.1MNaH2PO4，0.5MNaCl，pH值為7-8，配置好的緩沖液用0.22微米的濾膜過濾。步驟(4)中所述的終止劑是含有苯甲脒的去離子水溶液，每100ml終止液中含有17.46g苯甲脒。步驟(4)中所述的頂體酶底物熒光微球包括直徑為微米級的微球，所述的微球上偶聯(lián)有能被頂體酶酶切的多肽或蛋白質(zhì)，所述的多肽或蛋白質(zhì)標(biāo)記有熒光分子基團，所述的熒光分子基團在流式細胞儀上被激發(fā)光照射后發(fā)射出的熒光能夠被流式細胞儀所檢測。所述的微球的材質(zhì)為聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、二氧化硅(SiO2)、聚乳酸(PLA)或聚乳酸羥基乙酸聚合物(PLGA)；所述的多肽是指含有能夠被頂體酶識別的精氨酸或賴氨酸的多肽，所述的蛋白質(zhì)是指含有能夠被頂體酶識別的精氨酸或賴氨酸的蛋白質(zhì)具體檢測原理如下：將精子細胞離心收集后，加入含有TritonX-100的破膜液重懸，低濃度的TritonX-100能夠增加細胞膜的通透性，使得頂體酶能夠很好的釋放到細胞外，加入提取液后，精子細胞內(nèi)的頂體酶得到很好的釋放，提取液里的鹽離子能夠使酶保持較高的活性。加入酶切底物熒光微球后，頂體酶能夠切掉微球上標(biāo)記有熒光的多肽或者蛋白，使熒光分子從微球上脫落下來，酶切后的體系經(jīng)流式細胞儀檢測，熒光值就會減小。減去對照組的熒光值后就可以算出此酶切的熒光衰減率，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.0001X2+0.0355X+67.324后就能得到頂體酶的酶活。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明首次公開了精子頂體酶的快速提取方法及其活性的流式檢測方法，快速提取方法中破膜液促進精子釋放頂體酶，然后加入提取液提取精子中的頂體酶，破膜液利用Triton-100溫和的使精子細胞破膜，然后加入提取液使得頂體酶能夠釋放且保持頂體酶酶活，整個實驗過程能夠在15min中內(nèi)完成?，F(xiàn)有文獻報道的酸處理提取方式，需要16h以上。具有省時，處理溫和，安全的特點。此外，本發(fā)明提取的頂體酶可以在-20℃條件下保持一周，滿足了某些項目對原始頂體酶(不含精子細胞)的需求。同時，本發(fā)明提供了一種精子頂體酶活性的流式檢測方法，首次通過微球多肽蛋白偶聯(lián)技術(shù)和多肽蛋白熒光標(biāo)記技術(shù)實現(xiàn)了流式細胞儀檢測頂體酶的活性，根據(jù)熒光值的強弱直接判斷頂體酶活性的高低，簡化了檢測過程中的實驗操作步驟，同時適合于高通量多樣本的連續(xù)檢測，極大的提高了檢測的效率，實現(xiàn)了樣本中頂體酶的流式細胞儀定量檢測。。另外，本發(fā)明通過優(yōu)化提取配方，能夠提取精子細胞內(nèi)較多的頂體酶，使得一些酶活很低的樣本也能得到很好的檢測，提高了檢測的靈敏性，同時采用本發(fā)明所述的終止劑終止反應(yīng)后，在常溫放置2小時后，上流式檢測發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果無明顯改變，說明本酶切體系較穩(wěn)定，解除了流式檢測要反應(yīng)后即時進行檢測的局限，顯著拓寬了流式檢測的應(yīng)用場合和應(yīng)用范圍。本發(fā)明通過快速提取和流式檢測結(jié)合，使得檢測效率大大提高。附圖說明圖1為具體實施例二酶切樣品上流式細胞儀后，SSC-A和FSC-A密度散點圖和R1門；圖2為具體實施例二熒光微球酶切前后在流式細胞儀上的熒光強度峰值。具體實施方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。具體實施例一一種精子頂體酶的快速提取方法，包括以下步驟：(1)將含有7.5*106個精子數(shù)目的精液加入到離心管中，于10000rpm離心2min，吸去離心后管內(nèi)的精漿部份，保留下層精子沉淀；(2)在含有精子沉淀的離心管中加入200uL破膜液，使精子沉淀團均勻懸浮后，于7000rpm離心2min后，去掉上清，然后加入400uL提取液，使精子于37℃懸浮10min，再于12000rpm離心3min后，收集上清，即獲得頂體酶提取物，其中每100ml破膜液中含磷酸二氫鈉1.2g，Triton-1000.2-0.4ml和疊氮鈉0.05g；每100ml提取液中含BSA1g、氯化鈉0.35g、磷酸一氫鈉1.19g、二水磷酸二氫鈉0.25g和疊氮鈉0.05g。提取的頂體酶保存在-20℃可保存一周上述破膜液的配制方法如下：準(zhǔn)確稱量磷酸二氫鈉1.2g、疊氮鈉0.05g和0.2-0.4mlTriton-100溶于80亳升去離子水中，用1NHCl調(diào)節(jié)pH至4-6后，用去離子水定容至100毫升，用0.22微米的濾膜過濾后即得到破膜液。上述提取液的配制方法如下：準(zhǔn)確稱量牛血清白蛋白(BSA)1g，氯化鈉0.35g，磷酸一氫鈉1.19g，二水磷酸二氫鈉0.25g和疊氮鈉0.05g，溶于80亳升去離子水中，用1N氫氧化鈉調(diào)pH至7.0-8.0，然后用去離子水定容至100亳升，用0.22微米的濾膜過濾后即得到提取液。具體實施例二一種精子頂體酶活性的流式檢測方法，包括以下步驟：(1)收集樣本：將新鮮采集、液化完全的精子樣本通過精子計數(shù)儀計數(shù)后，取7.5*106個精子數(shù)目的精液，于10000rpm離心2min，用槍頭吸棄上清，留下精子樣本沉淀待用；(2)裂解細胞：向步驟(1)中得到的精子細胞沉淀里加入200uL破膜液，用槍頭上下吹打細胞，使精子細胞充分重懸，將重懸液7000rpm離心2-4min后(不能超過5min否則將影響頂體酶活性)，用槍頭吸去上清液，留下沉淀待用；其中破膜液配方為：每100ml破膜液中含磷酸二氫鈉1.2g，Triton-1000.2-0.4ml和疊氮鈉0.05g；(3)溶解頂體酶：向步驟(2)中的沉淀細胞團里加入400uL提取液，用槍頭上下吸打，充分混勻沉淀，在37攝氏度金屬浴上孵育10min后，12000rpm離心2min，吸取上清液即為的體酶提取液；其中提取液配方為：每100ml提取液中含BSA1g、氯化鈉0.35g、磷酸一氫鈉1.19g、二水磷酸二氫鈉0.25g和疊氮鈉0.05g；(4)酶切熒光微球：吸取步驟(3)中得到的頂體酶提取液100uL，加入100uLPB緩沖溶液，再加入含有5*104個頂體酶底物熒光微球的溶液，使酶切體系為250uL，24攝氏度孵育1小時后，加入終止劑終止反應(yīng)1-2min；其中PB緩沖溶液的配方為：0.1MNaH2PO4，0.5MNaCl，pH值為7-8，配置好的緩沖液用0.22微米的濾膜過濾；該終止劑是含有苯甲脒的去離子水溶液，每100ml終止液中含有17.46g苯甲脒；該頂體酶底物熒光微球包括直徑為微米級的微球，該微球上偶聯(lián)有能被頂體酶酶切的多肽或蛋白質(zhì)，多肽或蛋白質(zhì)標(biāo)記有熒光分子基團，熒光分子基團在流式細胞儀上被激發(fā)光照射后發(fā)射出的熒光能夠被流式細胞儀所檢測；該微球的材質(zhì)為聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、二氧化硅(SiO2)、聚乳酸(PLA)或聚乳酸羥基乙酸聚合物(PLGA)；多肽是指含有能夠被頂體酶識別的精氨酸或賴氨酸的多肽，蛋白質(zhì)是指含有能夠被頂體酶識別的精氨酸或賴氨酸的蛋白質(zhì)；(5)流式檢測：將步驟(4)中酶切反應(yīng)后的混合液在流式細胞儀上進行檢測；以BD公司的C5流式細胞儀為例(也可采用C6，Calibur或其他型號的流式細胞儀)，檢測參數(shù)均為在slow模式，根據(jù)SSC-A和FSC-A的密度散點圖進行圈門R1(見說明書附圖1)，收集R1內(nèi)5000個點，將這5000個點的平均熒光強度作為結(jié)果的輸出值，由圖1表明熒光微球的FSC的范圍為0.40-0.76(*106)和SSC的范圍為0.11-0.50(*106)，R1門指的是圖1中矩形黑色方框內(nèi)所示的區(qū)域；圖2為熒光微球酶切前后在流式細胞儀上的熒光強度峰值，由圖2說明熒光微球酶切前后，其熒光數(shù)值發(fā)生變化，熒光峰圖發(fā)生位移，圖顯示酶切后微球的熒光峰減小，峰圖向左偏移。酶切前后微球的平均熒光值Mean和CV值如下表所示，#SampleGateCount％R1MeanXCVX1酶切后R15.101100.00％10.09018.98％2酶切前R1-5.078100.00％14.50519.46％由上表說明酶切前后，熒光微球的參數(shù)，其中Mean值最有意義，代表酶切效果，與酶切前Mean值14505比較，酶切后的熒光值為10090，熒光值衰減了，表示發(fā)生了酶切反應(yīng)。(6)酶活計算：根據(jù)流式細胞儀上得到的熒光值，計算熒光衰減率，根據(jù)酶活衰減率標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.0001X2+0.0355X+67.324，計算獲得頂體酶的酶活，其中y代表頂體酶酶活性，單位為μIU，X代表熒光衰減率。上述熒光衰減率的計算公式為(酶切后熒光值-對照組熒光值)/對照組熒光值*100％，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制過程為：采用已注冊上市的頂體酶定量檢測試劑盒(廠家為深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司、型號為20人份/盒，產(chǎn)品注冊號為：粵食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第2400314號)對一定濃度的精子樣本測定得到一系列酶活值作為縱坐標(biāo)，同時等量精子樣本采用本專利所述方法進行酶切熒光微球，計算得到的一系列衰減率值作為橫坐標(biāo)，將兩方法所對應(yīng)的一系列的數(shù)據(jù)點模擬得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.0001X2+0.0355X+67.324，其中y代表頂體酶酶活性，單位為pIU，X代表熒光衰減率。上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3