本發(fā)明涉及一種基于發(fā)光細(xì)菌法的大氣顆粒物中有機(jī)污染物毒性檢測(cè)方法，屬于發(fā)光細(xì)菌的綜合毒性檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,城市建設(shè)規(guī)模的擴(kuò)大,大氣總懸浮顆粒物(tsp)污染已成為我國各大城市面臨的重要問題。大部分有機(jī)污染物容易吸附在顆粒物上，研究表明有機(jī)物是大氣細(xì)顆粒物中最重要的組分占大氣顆粒物40%。從大氣顆粒物中檢測(cè)出的有機(jī)污染物種類繁多,且多數(shù)物質(zhì)對(duì)人體有害。如多環(huán)芳烴類物質(zhì),苯并[a]芘、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[ghi]芘等均為致癌物;環(huán)境樣品已中檢出百余種多環(huán)芳烴類物質(zhì)。由于多環(huán)芳烴種類多,在環(huán)境中分布廣泛,對(duì)人們的康健危害性也大。苯酚類尤其是多氯酚、苯胺類和硝基芳香烴類均為有毒物質(zhì);酞酸酯類物質(zhì)已被證實(shí)是環(huán)境激素類污染物。因此,對(duì)大氣顆粒物中有機(jī)污染物毒性的測(cè)定對(duì)研究大氣污染狀況和治理是很有必要的。

捕集大氣顆粒物后必須進(jìn)行高效提取后才能測(cè)定,有人對(duì)超聲波提取條件進(jìn)行了詳細(xì)研究,并于索氏抽提效果進(jìn)行了比較。前人認(rèn)為以正己烷+丙酮（1:1）為提取劑,微波提取功率為40w,提取時(shí)間為20min時(shí)最為合適,,將試樣提取并凈化后用gc-ms法測(cè)定的報(bào)道較多,也有用hplc一熒光檢測(cè)器或化學(xué)發(fā)光監(jiān)測(cè)器測(cè)定的報(bào)道。此外用大氣壓離子化lc一ms法測(cè)定苯并花,及傅里葉變換熒光顯微鏡測(cè)定顆粒中的多環(huán)芳烴也有報(bào)道。用gc一ms法同時(shí)測(cè)定多環(huán)芳烴和正構(gòu)烷烴及有機(jī)氯化物的報(bào)道較多。但是上述檢測(cè)方法操作復(fù)雜，耗時(shí)較多，成本較高，不利于大氣環(huán)境的常規(guī)檢測(cè)和應(yīng)急檢測(cè)。目前,我國尚未建立大氣顆粒物樣品有機(jī)物毒性檢測(cè)的規(guī)范方法,因此,構(gòu)建一種成本低、操作簡(jiǎn)便的方法,對(duì)大氣顆粒物中有機(jī)污染物毒性進(jìn)行及時(shí)、快速、準(zhǔn)確、定量的檢測(cè)的工作對(duì)人們的健康和生活有重大意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于發(fā)光細(xì)菌法的大氣顆粒物中有機(jī)污染物毒性檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法采用丙醇-正己烷混合溶液為萃取劑的加壓流體萃取方法對(duì)樣品中的非水溶性有毒物質(zhì)進(jìn)行浸提，利用發(fā)光細(xì)菌對(duì)有毒有害物質(zhì)的靈敏性和較低的檢測(cè)限，建立一種簡(jiǎn)便快速的大氣顆粒物中有機(jī)物綜合毒性檢測(cè)方法,降低了對(duì)采樣量的要求。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：一種基于發(fā)光細(xì)菌法的大氣顆粒物中有機(jī)污染物毒性檢測(cè)方法,所述方法包括以下步驟：

（1）樣品的采集與保存：利用大氣顆粒物采樣器采集大氣顆粒物樣品,采樣結(jié)束后,用鋁箔紙包裹好載有大氣顆粒物樣品的濾膜,密閉低溫保存,防止樣品中毒性物質(zhì)的損失；

（2）樣品的萃?。簩⑤d有大氣顆粒物樣品的濾膜破碎成細(xì)小碎片,選用丙醇-正己烷混合溶劑做萃取劑，對(duì)樣品中的有機(jī)污染物用加壓流體萃取法進(jìn)行萃取，加壓流體萃取裝置設(shè)置載氣壓力0.8mpa，萃取池壓1200-2000psi，加熱溫度120-180℃，加熱5分鐘，萃取結(jié)束后加入二甲基亞砜,然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除丙醇-正己烷混合溶劑,獲得樣品液；同時(shí)以空白濾膜按照載有大氣顆粒物樣品的濾膜相同的處理方法得到的萃取液作為對(duì)照液；

（3）樣品的毒性檢測(cè):調(diào)節(jié)樣品液的ph并將樣品液稀釋，使ph達(dá)到7,且樣品液中二甲基亞砜含量為1%(v/v）,然后將發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)液、經(jīng)稀釋的樣品液、15%nacl溶液和純凈水按體積比為1：2：4：13的比例混勻,進(jìn)行發(fā)光細(xì)菌毒性試驗(yàn)，測(cè)定對(duì)發(fā)光細(xì)菌15min的發(fā)光強(qiáng)度，同時(shí)將對(duì)照液按照樣品液相同處理后進(jìn)行發(fā)光細(xì)菌毒性試驗(yàn)作為空白對(duì)照，測(cè)定對(duì)發(fā)光細(xì)菌15min的發(fā)光強(qiáng)度；

（4）樣品毒性的表達(dá):采用發(fā)光細(xì)菌15min的發(fā)光抑制率或同氯化汞進(jìn)行綜合毒性的當(dāng)量濃度比對(duì),來表征大氣顆粒物中有機(jī)污染物的綜合毒性水平。

所述發(fā)光細(xì)菌為費(fèi)氏弧菌或明亮發(fā)光桿菌。

所述丙醇-正己烷混合溶劑為農(nóng)殘級(jí)丙醇與農(nóng)殘級(jí)正己烷的按體積比為1:1的比例混合而成。

所述樣品液和對(duì)照液均設(shè)3組平行測(cè)定發(fā)光抑制率,發(fā)光抑制率相對(duì)偏差不超過10%,結(jié)果取3組測(cè)定發(fā)光抑制率的平均值。

有益效果：

本發(fā)明的檢測(cè)方法能夠適應(yīng)樣品量小的物質(zhì)的綜合毒性檢測(cè)，其選擇丙酮-正己烷混合溶液作為浸提液對(duì)樣品中的毒性物質(zhì)進(jìn)行浸提，比傳統(tǒng)的水提法具有更好的浸提效果。然后將丙酮-正己烷混合溶液中的毒性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到對(duì)發(fā)光細(xì)菌低毒的二甲基亞砜溶劑中，提高了檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度。本方法利用發(fā)光細(xì)菌法進(jìn)行檢測(cè)，樣品與發(fā)光細(xì)菌的反應(yīng)時(shí)間僅為15分鐘，能夠迅速獲得檢測(cè)結(jié)果，靈敏度高、適應(yīng)性強(qiáng)、重復(fù)性好，適應(yīng)大批量樣品的快速檢測(cè)，大大縮短了綜合毒性的檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。

附圖說明

圖1、為不同濃度的二甲基亞砜對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本發(fā)明,并使本發(fā)明的上述優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂,下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1

基于發(fā)光細(xì)菌法的大氣顆粒物中有機(jī)物染物毒性檢測(cè)方法，其具體操作分為以下4個(gè)步驟：

（1）樣品的采集與保存：嚴(yán)格按照環(huán)境空氣質(zhì)量監(jiān)測(cè)規(guī)范等相關(guān)規(guī)范流程,利用大氣顆粒物采樣器采集大氣顆粒物樣品,本實(shí)例中利用大氣顆粒物采樣器采集大氣顆粒物pm2.512小時(shí),采樣結(jié)束后,取下濾膜,用鋁箔紙包裹好后置于聚乙烯自封袋中,排盡空氣,密閉保存于-20℃的冰箱中,以防止樣品中毒性物質(zhì)的損失。

（2）樣品的浸提：將載有大氣顆粒物樣品的濾膜破碎成細(xì)小碎片,選擇體積比1：1的農(nóng)殘級(jí)丙醇和正己烷溶劑混合液對(duì)樣品中毒性物質(zhì)用加壓流體萃取法進(jìn)行萃取。加壓流體萃取裝置設(shè)置載氣壓力0.8mpa,萃取池壓1200-2000psi，加熱溫度120-180℃；萃取池壓優(yōu)選1500psi；加熱溫度優(yōu)選150℃，然后加熱5分鐘，萃取3次。在對(duì)樣品進(jìn)行萃取后,再在萃取液中加入二甲基亞砜,然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除丙醇-正己烷混合溶液,以獲得含有有機(jī)污染樣品的二甲基亞砜溶液。同時(shí)以空白濾膜按照載有大氣顆粒物樣品的濾膜相同的處理方法得到的萃取液作為對(duì)照液。

由于大氣顆粒物中的有機(jī)污染物多為脂溶性物質(zhì)，因此本試驗(yàn)利用加壓流體萃取法對(duì)毒性物質(zhì)進(jìn)行抽提。本發(fā)明中所有方法中采用的提取液為丙酮/正己烷（體積比1：1），通過兩種不同極性的溶液以不同比例配置成混合提取液，高效率地提取全部有機(jī)物，要比單一的提取液效果更佳。

以蒸餾水為對(duì)照，分別測(cè)定了甲醇、二甲亞砜、丙酮-正己烷混合液對(duì)發(fā)光細(xì)菌的生物毒性。結(jié)果表明，丙酮-正己烷混合溶劑對(duì)發(fā)光細(xì)菌具有強(qiáng)毒性，而二甲亞砜的毒性較小，不同有機(jī)溶劑對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響見下表1。

表1不同有機(jī)溶劑對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響

二甲基亞砜相對(duì)于其他有機(jī)溶劑對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性較小,故檢測(cè)大氣顆粒物中有機(jī)污染物生物毒性時(shí)常用二甲基亞砜交換極性的萃取溶劑獲取污染物提取液。本實(shí)驗(yàn)采用二甲基亞砜配制多環(huán)芳烴化合物測(cè)試液,并為使其對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響減至最小,在溶解和測(cè)試過程中保持樣品溶液中二甲基亞砜濃度≤0.1%(v/v)。由圖1可知當(dāng)二甲基亞砜濃度為0.1%～0.75%(v/v)時(shí)對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度無甚影響,其相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度保持在97%～99%間。當(dāng)二甲亞砜濃度>1%(v/v)時(shí)對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響顯著,且隨二甲亞砜濃度的升高而發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度逐漸減弱,二者間存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(p<0.001)。

本試驗(yàn)首先采用丙酮-正己烷混合溶劑對(duì)大氣顆粒物進(jìn)行萃取，然后在丙醇-正己烷提取物中加入對(duì)發(fā)光細(xì)菌低毒的二甲基亞砜，最后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除丙酮-正己烷混合溶劑，以獲得大氣顆粒物樣品提取物的二甲亞砜溶液作為大氣顆粒物生物測(cè)定所需的最終浸提液，不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

（3）浸提液的毒性檢測(cè):調(diào)節(jié)樣品液的ph并將樣品液稀釋，調(diào)節(jié)ph達(dá)到7，經(jīng)稀釋的樣品液中二甲基亞砜含量為1%(v/v）,通過計(jì)算經(jīng)稀釋的樣品液的體積,確定取體積比為1：2：4：13發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)液、經(jīng)稀釋的樣品液、15%nacl和純凈水,使?jié)舛鹊陀谫M(fèi)氏弧菌的最適鹽度濃度,可以通過調(diào)節(jié)濃度達(dá)到最適鹽度,不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。取50μl發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)液，加入100μl經(jīng)稀釋的樣品液、200μl15%nacl溶液和650μl純凈水，混勻，放置15min，然后利用sdimicrotoxmodel500溫控毒性儀（自帶溫控和校準(zhǔn)裝置）及標(biāo)配的費(fèi)氏弧菌進(jìn)行測(cè)定，該測(cè)試方法還適用于明亮發(fā)光桿菌等海洋發(fā)光細(xì)菌。發(fā)光細(xì)菌可選用發(fā)光細(xì)菌凍干粉或新鮮細(xì)菌培養(yǎng)液。但由于發(fā)光細(xì)菌凍干粉價(jià)格昂貴,因此本試驗(yàn)擬使用發(fā)光細(xì)菌的新鮮培養(yǎng)液。測(cè)定其對(duì)發(fā)光細(xì)菌一費(fèi)氏弧菌15分鐘后的發(fā)光強(qiáng)度，同時(shí)將對(duì)照液按照樣品液相同處理后進(jìn)行發(fā)光細(xì)菌毒性試驗(yàn)作為空白對(duì)照，測(cè)定對(duì)發(fā)光細(xì)菌15min的發(fā)光強(qiáng)度。

樣品液和對(duì)照液平行測(cè)定3次發(fā)光抑制率，發(fā)光抑制率相對(duì)偏差不超過10%，結(jié)果分別取3次測(cè)定發(fā)光抑制率的平均值。

(4)樣品毒性的表達(dá):采用發(fā)光細(xì)菌15min的發(fā)光抑制率,來表征大氣顆粒物中有機(jī)污染物的綜合毒性水平。

發(fā)光抑制率=（對(duì)照發(fā)光強(qiáng)度-樣品發(fā)光強(qiáng)度）/對(duì)照發(fā)光強(qiáng)度×100%

發(fā)光抑制率越大,樣品浸提液的毒性越大,發(fā)光抑制率越小,樣品浸提液的毒性越小。采用國標(biāo)gb/t15441-1995方法，急性毒性水平利用參比氯化汞濃度（mg/l）來表征詳見表2：

表2水質(zhì)急性毒性（發(fā)光細(xì)菌法）的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

本實(shí)例中,sdimicrotoxmodel500溫控毒性儀三次測(cè)定的發(fā)光抑制率結(jié)果分別為85.8%、84.5%和86.6%,其最終的發(fā)光抑制率測(cè)定結(jié)果為85.6%,相對(duì)發(fā)光率為14.4%，毒性級(jí)別為高毒。