本發(fā)明涉及應(yīng)用酶學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的測定方法。

背景技術(shù)：

研究酶解反應(yīng)動力學(xué)的經(jīng)典和公認(rèn)的方程即為米氏方程，米氏方程v＝vmax[s]/(km+[s])是酶學(xué)中極為重要的可以描述多種非變異構(gòu)酶動力學(xué)現(xiàn)象、表示一個酶促反應(yīng)的起始速度v與底物濃度[s]關(guān)系的方程，可用于分析不同底物濃度下的起始反應(yīng)速率。上述方程中，vmax表示酶被底物飽和時的反應(yīng)速度，km值稱為米氏常數(shù)，代表了酶與底物的結(jié)合能力，是酶重要的特征參數(shù)之一，km值等于酶促反應(yīng)速度v為最大酶促反應(yīng)速度值一半時的底物濃度。

酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)在研究酶促反應(yīng)中起著非常重要的作用。比如km，只與酶的性質(zhì)有關(guān)而與酶的濃度無關(guān)，km可以反應(yīng)酶同底物的親和力，km越小，酶同底物的親和力越大。因此，在實際應(yīng)用中，通過測定km，可以鑒別不同來源或相同來源但在不同發(fā)育階段，不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否屬于同一種酶；也是通過km的不同，找出酶的最適底物和底物的最適反應(yīng)濃度；還可以判斷反應(yīng)方向或趨勢、不同抑制劑對酶的抑制類型等等。

根據(jù)米氏方程，測定米氏常數(shù)km和最大酶促反應(yīng)速率vmax，需要測定不同濃度的酶催化反應(yīng)速率，然而，在酶解反應(yīng)動力學(xué)的研究中，酶解反應(yīng)速率的實際測量存在一定難度，而且在終止反應(yīng)速率操作中，人為誤差難以避免，造成米氏常數(shù)的測定存在較大偏差。

申請公布號為cn105675797a的專利文獻(xiàn)公開了一種等溫滴定量熱法測定酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的方法，屬于酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)檢測技術(shù)領(lǐng)域，所述等溫滴定量熱法測定酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的方法是通過將底物滴加到含酶的溶液中，檢測出每次滴加后底物與酶反應(yīng)的熱功率，設(shè)定滴加底物的間隔時間，計算出不同底物濃度時熱功率的變化，測定得到酶促反應(yīng)的米氏常數(shù)km和最大酶促反應(yīng)速率vmax。該方法是對傳統(tǒng)酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)測定的改進(jìn)，具有快速、微量、靈敏、操作簡單的特點，可有效降低酶促動力學(xué)參數(shù)測定中對酶和底物的消耗，簡化測定酶促反應(yīng)過程，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

申請公布號為cn104697990a的專利文獻(xiàn)公開了一種脲酶米氏常數(shù)測試方法，通過米氏方程轉(zhuǎn)化得到的雙倒數(shù)方程1/v＝km/(vmax[s])+1/vmax，通過酶促反應(yīng)速率的倒數(shù)1/v對底物尿素濃度的倒數(shù)1/[s]作圖，得到直線在x軸上的截距為-1/km，從而可以進(jìn)一步計算得到km的值。該發(fā)明提供的測試方法是以一系列不同濃度的尿素溶液為底物，酚紅為指示劑，在脲酶的作用下，尿素分解產(chǎn)氨，ph值上升，在酚紅指示劑的作用下，體系的顏色變深，吸光度增加，用分光光度計或酶標(biāo)儀測吸光度。酶促反應(yīng)速率與吸光度值的增加成正比，因此可以用吸光度增加值的倒數(shù)1/△a代替雙倒數(shù)方程1/v＝km/(vmax[s])+1/vmax中的1/v，對底物尿素濃度的倒數(shù)1/[s]作圖，根據(jù)雙倒數(shù)方程可得直線在x軸上的截距即為-1/km，求得km值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種測定蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中因酶解反應(yīng)速率實際測量存在難度從而影響酶解反應(yīng)動力學(xué)的研究。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的測定方法，包括：

(1)測量蛋白質(zhì)在不同酶解時間生成目標(biāo)肽段的濃度；

(2)將酶解時間和對應(yīng)酶解時間目標(biāo)肽段的濃度代入方程

擬合得到常數(shù)a，k，m；

其中，c為對應(yīng)酶解時間t時目標(biāo)肽段的濃度；a為初始條件下的蛋白質(zhì)濃度；

(3)根據(jù)k＝(1+km/a)、m＝vmax/a，計算得到米氏常數(shù)km和最大反應(yīng)速率vmax，a為初始條件下的蛋白質(zhì)濃度。

本發(fā)明提供了用于擬合酶解反應(yīng)曲線的數(shù)學(xué)模型即方程基于該數(shù)學(xué)模型對酶解時間和目標(biāo)肽段濃度的基本關(guān)系進(jìn)行擬合，得到對應(yīng)的酶解曲線方程，進(jìn)而計算得到目標(biāo)肽段對應(yīng)的酶解反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。

另外，根據(jù)酶解曲線方程可以計算任一酶解時間點對應(yīng)的目標(biāo)肽段的濃度以及酶解比率。

上述數(shù)學(xué)模型由米氏方程推導(dǎo)得到，具體推導(dǎo)方法如下：

該模型成立的基本假設(shè)為：①酶解反應(yīng)過程中反應(yīng)速度始終符合米氏方程(1)，即本模型僅適用于符合米氏方程的酶解反應(yīng)；②酶解反應(yīng)過程中相較于底物濃度而言，酶過量，即酶解反應(yīng)速率未達(dá)到最大反應(yīng)速率；③針對同一酶和底物，米氏常數(shù)不變；④1mol底物反應(yīng)生成1mol產(chǎn)物。可知：

其中，v為對應(yīng)底物濃度為[s]時的酶反應(yīng)速率，vmax為對應(yīng)酶反應(yīng)條件下的最大反應(yīng)速率，km為米氏常數(shù)。

[s]＝s0-c(2)

其中，s0為當(dāng)前反應(yīng)條件下的最大底物濃度，即初始條件下的底物濃度a，[s]為對應(yīng)酶解時間t時的底物濃度，而c為對應(yīng)酶解時間t時的產(chǎn)物濃度。

米氏方程闡述了一定酶條件下底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系，而為了表示確定的反應(yīng)條件下產(chǎn)物濃度與反應(yīng)時間的關(guān)系，對米氏方程進(jìn)行了一定的轉(zhuǎn)化。

首先，反應(yīng)速率、產(chǎn)物濃度與反應(yīng)時間的關(guān)系見方程(3)。

其中，c為對應(yīng)酶解時間t時的產(chǎn)物濃度，v為產(chǎn)物的生成速率，即底物的反應(yīng)速率。

將方程(2)和方程(3)帶入方程(1)中，可得方程(4)，并進(jìn)而轉(zhuǎn)化為方程(5)。

進(jìn)而對方程(5)兩邊取積分，可得方程(6)，并進(jìn)而轉(zhuǎn)化為方程(7)和方程(8)。

-(a-c)-km·in(a-c)＝vmax·t+c0(8)

考慮邊界條件t＝0時，c＝0。代入方程(8)可得方程(9)。

c0＝-a-km·ina(9)

將方程(9)代入方程(8)可得方程(10)，并進(jìn)而化簡為方程(11)。

c-km·in(a-c)＝vmax·t-km·ina(10)

定義一個新函數(shù)f(t)，其中t為酶解反應(yīng)時間，見方程(12)。

將函數(shù)f(t)代入方程(11)可得方程(13)。

a·f(t)-km·in[1-f(t)]＝vmax·t(13)

定義一個新函數(shù)g(t)，其中t為酶解反應(yīng)時間，見方程(14)，并進(jìn)而轉(zhuǎn)化為方程(15)。

f(t)＝1-e^g(t)(15)

將方程(15)代入方程(13)可得方程(16)，并進(jìn)而轉(zhuǎn)化為方程(17)。

a-a·e^g(t)＝vmax·t+km·g(t)(16)

根據(jù)泰勒級數(shù)展開公式，并得到近似方程(18)和方程(19)。

將方程(19)代入方程(17)可得到方程(20)，并進(jìn)而轉(zhuǎn)化為方程(21)，方程(22)和方程(23)。

考慮邊界條件t＝0時，c＝0。代入方程(14)可得方程(24)。

因此方程(23)取正號，即得方程(25)。

同時，由方程(25)可知函數(shù)g(t)為奇函數(shù)，則方程(25)可轉(zhuǎn)化為方程(26)。

將方程(14)代入方程(26)可得方程(27)，并進(jìn)而轉(zhuǎn)化為方程(28)和方程(29)。

為簡化方程(29)，定義三個未知參數(shù)a，k，m，方且程(29)可簡化為方程(30)。

其中a＝a，k＝(1+km/a)以及m＝vmax/a。

方程(30)可用于已知反應(yīng)時間和產(chǎn)物濃度的酶解曲線的擬合。

曲線擬合時，輸入的數(shù)據(jù)點越多，擬合出的曲線方程越準(zhǔn)確，步驟(1)中，測量≥5個酶解時間對應(yīng)的目標(biāo)肽段濃度。

作為優(yōu)選，相鄰酶解時間間隔3～15min。根據(jù)簡化方程(30)可知，酶解曲線方程為指數(shù)方程的變形，其各點斜率隨著酶解時間的增加而減小，即酶解速率隨著酶解時間測增加而減小。為了更加準(zhǔn)確地擬合酶解曲線，采集酶解數(shù)據(jù)點對應(yīng)的酶解時間應(yīng)為先密后疏。為方便實驗操作與數(shù)據(jù)處理，采用前期每間隔3min采集數(shù)據(jù)點共5次，后期每間隔15min采集數(shù)據(jù)點共7次。

步驟(1)中，采用胰蛋白酶trypsin進(jìn)行酶解。本發(fā)明采用的胰蛋白酶為基因工程技術(shù)制備的堿性胰蛋白酶，只作用于精氨酸和賴氨酸的c端，具有高度專一性，能穩(wěn)定、特異地將目標(biāo)蛋白質(zhì)酶切成分子量為幾十至上千道爾頓的肽段分子。

步驟(1)中，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法測量目標(biāo)肽段的濃度。

作為優(yōu)選，采用二甲基化同位素標(biāo)記法進(jìn)行測量。二甲基化同位素標(biāo)記法是在甲醛分子的作用下將溶液中的游離氨基反應(yīng)生成席夫堿，進(jìn)而在氰基硼氫化鈉的還原下，穩(wěn)定、高效地實現(xiàn)游離氨基的二甲基化。對于經(jīng)堿性胰蛋白酶酶解生成的肽段來說，游離氨基的來源為肽段n端和賴氨酸(k)殘基兩部分，而一般地，以精氨酸(r)結(jié)尾的肽段只有n端一個可標(biāo)記位點。在普通甲醛(ch2o)的作用下，一個游離氨基位點可增加兩個甲基，實現(xiàn)分子量增加28da的標(biāo)記；而在同位素甲醛(¹³cd2o)的作用下，一個游離氨基位點可實現(xiàn)分子量增加34da的標(biāo)記。因此，經(jīng)堿性胰蛋白酶酶解的肽段，經(jīng)二甲基化標(biāo)記后，可實現(xiàn)輕鏈與重鏈至少6da的質(zhì)量數(shù)差異，使得目標(biāo)肽段擁有其對應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)，保證定量檢測的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明在測量不同酶解時間的目標(biāo)肽段濃度時，均采用相同的內(nèi)標(biāo)物，對測量誤差進(jìn)行校正，保證測量的準(zhǔn)確性。作為優(yōu)選，以蛋白質(zhì)酶解120min得到的酶解產(chǎn)物經(jīng)同位素標(biāo)記后作為內(nèi)標(biāo)物。trypsin酶自身也是蛋白質(zhì)，其存在酶自切的現(xiàn)象。隨著酶解時間的延長，底物蛋白質(zhì)的濃度下降，酶自切的發(fā)生概率不斷增加。同時，前期實驗數(shù)據(jù)表明2小時內(nèi)蛋白質(zhì)中未完全酶切的位點將始終難以達(dá)到完全酶切狀態(tài)，說明2小時后酶自切的現(xiàn)象已影響到底物蛋白質(zhì)的正常酶切，其酶解過程不完全符合酶解曲線模型的基本假設(shè)，因此選用2小時的酶解產(chǎn)物作為內(nèi)標(biāo)，同時選擇2小時作為采集酶解數(shù)據(jù)點對應(yīng)的最大酶解時間。

測量各酶解時間對應(yīng)的目標(biāo)肽段濃度后，應(yīng)用sas軟件編程，將各酶解時間及對應(yīng)的目標(biāo)肽段的濃度代入上述數(shù)學(xué)模型，使用高斯迭代法進(jìn)行擬合，生成對應(yīng)的酶解曲線方程，確定其中未知參數(shù)a、k、m，進(jìn)而計算得到該目標(biāo)肽段對應(yīng)的酶解米氏常數(shù)與最大反應(yīng)速率。

米氏常數(shù)與最大反應(yīng)速率由酶與底物的親和力及濃度比例關(guān)系決定，不同肽段的酶切位點不同，且其周圍的氨基酸序列不同，均能影響酶與酶切位點的親和力。親和力強的位點易酶切，親和力弱的位點難酶切。

本發(fā)明具備的有益效果：

(1)本發(fā)明通過測定不同酶解時間對應(yīng)的目標(biāo)肽段濃度，將其代入本發(fā)明提供的數(shù)學(xué)模型中，擬合生成酶解曲線方程，進(jìn)而計算出酶解動力學(xué)參數(shù)，為酶解動力學(xué)研究提供一種新的方法。

(2)利用上述酶解曲線可以預(yù)測未知時間點對應(yīng)的目標(biāo)肽段的濃度以及該時間點下的酶解比率。

(3)本發(fā)明提供的數(shù)學(xué)模型對各肽段的酶解生成曲線具有良好的擬合，其殘差值均小于20％。

附圖說明

圖1為sas軟件中擬合曲線的運算代碼。

圖2為牛血清白蛋白經(jīng)trypsin酶解所得肽段的其中4條肽段的酶解曲線及殘差圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施對發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。

通用方法：

1、對米氏方程進(jìn)行推導(dǎo)得到數(shù)學(xué)模型

2、利用sas軟件編程，對已知酶解反應(yīng)時間和產(chǎn)物濃度進(jìn)行數(shù)學(xué)模型擬合，確定其中未知參數(shù)a，k，m。擬合方程為方程(30)，sas軟件運算代碼見圖1，采用的非線性擬合方法為高斯擬合。

實施例1：牛血清白蛋白經(jīng)trypsin酶解所得肽段的酶解曲線擬合

1、酶解時間點及其對應(yīng)產(chǎn)物濃度的采集

準(zhǔn)確吸取50μl蛋白質(zhì)提取溶液(蛋白質(zhì)含量低于5g/ml)，加入900μl濃度為100mmol/l的nahco3溶液和10μl濃度為500mmol/l的dtt溶液，70℃恒溫振蕩反應(yīng)30min后取出冷卻至室溫，加入30μl濃度為500mmol/l的iaa溶液，暗室室溫靜置30min，加入10μl濃度為1mg/ml的胰蛋白酶溶液，37℃恒溫振蕩反應(yīng)酶解，分別經(jīng)過3min、6min、9min、12min、15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min和120min酶解后，取酶解液過0.22μm濾膜，得到相應(yīng)的樣品酶解液。

準(zhǔn)確吸取500μl樣品酶解液，加入20μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的普通甲醛(ch2o)和20μl濃度為0.6m的氰基硼氫化鈉，25℃恒溫振蕩反應(yīng)1h，取出后加入80μl體積分?jǐn)?shù)為1％的氨水，終止反應(yīng)，并加入40μl純甲酸，進(jìn)一步終止反應(yīng)，作為樣品標(biāo)記液。另取500μl120min的酶解液作為同位素內(nèi)標(biāo)，加入20μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的同位素甲醛(¹³cd2o)和20μl濃度為0.6m的氰基硼氫化鈉，同時進(jìn)行25℃恒溫振蕩反應(yīng)1h，取出后加入80μl體積分?jǐn)?shù)為1％的氨水，終止反應(yīng)，并加入40μl純甲酸，進(jìn)一步終止反應(yīng)，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

取100μl樣品標(biāo)記液與100μl內(nèi)標(biāo)溶液混合，制得進(jìn)樣液。采用uplc-q-orbitrap液相質(zhì)譜聯(lián)用儀中的fullms模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集：①液相色譜參考條件：色譜柱：beh300c18色譜柱(2.1mm×100mm,1.7μm)；流動相：a相：0.1％甲酸-水溶液；b相：0.1％甲酸-乙腈溶液；進(jìn)樣體積：5μl；柱溫：30℃；流速：0.3ml/min。②高分辨質(zhì)譜參考條件：質(zhì)譜儀：qexactive靜電場軌道離子阱質(zhì)譜儀；離子源模式：hesi源正離子模式；鞘氣氣流：40l/min；輔助氣氣流：10l/min；毛細(xì)管電壓：3.5kv；毛細(xì)管溫度：320℃；輔助氣溫度：350℃；數(shù)據(jù)采集模式：fullms模式，質(zhì)譜掃描范圍為200-2000m/z，分辨率為70000，最大延遲時間為200ms，自動增益控制(agc)值為1×10⁶。

經(jīng)質(zhì)譜采集確定酶解時間點3min、6min、9min、12min、15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min和120min時對應(yīng)生成肽段的濃度值。

2、酶解曲線的擬合

應(yīng)用sas軟件，將酶解時間與肽段生成量的基本關(guān)系代入數(shù)學(xué)模型，確定未知參數(shù)a，k，m擬合生成各肽段的酶解曲線函數(shù)表達(dá)式，并可計算得到不同肽段對應(yīng)的酶解米氏常數(shù)與最大反應(yīng)速率，結(jié)果如表1所示。

表1

牛血清白蛋白經(jīng)trypsin酶解所得肽段的擬合曲線見圖2。根據(jù)各殘差圖可知，其殘差值均小于20％。

實施例2：α-乳白蛋白經(jīng)trypsin酶解所得肽段的酶解曲線擬合

1、酶解時間點及其對應(yīng)產(chǎn)物濃度的采集

準(zhǔn)確吸取50μl蛋白質(zhì)提取溶液(蛋白質(zhì)含量低于5g/ml)，加入900μl濃度為100mmol/l的nahco3溶液和10μl濃度為500mmol/l的dtt溶液，70℃恒溫振蕩反應(yīng)30min后取出冷卻至室溫，加入30μl濃度為500mmol/l的iaa溶液，暗室室溫靜置30min，加入10μl濃度為1mg/ml的胰蛋白酶溶液，37℃恒溫振蕩反應(yīng)酶解，分別經(jīng)過3min、6min、9min、12min、15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min和120min酶解后，取酶解液過0.22μm濾膜，得到相應(yīng)的樣品酶解液。

準(zhǔn)確吸取500μl樣品酶解液，加入20μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的普通甲醛(ch2o)和20μl濃度為0.6m的氰基硼氫化鈉，25℃恒溫振蕩反應(yīng)1h，取出后加入80μl體積分?jǐn)?shù)為1％的氨水，終止反應(yīng)，并加入40μl純甲酸，進(jìn)一步終止反應(yīng)，作為樣品標(biāo)記液。另取500μl120min的酶解液作為同位素內(nèi)標(biāo)，加入20μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的同位素甲醛(¹³cd2o)和20μl濃度為0.6m的氰基硼氫化鈉，同時進(jìn)行25℃恒溫振蕩反應(yīng)1h。取出后加入80μl體積分?jǐn)?shù)為1％的氨水，終止反應(yīng)，并加入40μl純甲酸，進(jìn)一步終止反應(yīng)，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

取100μl樣品標(biāo)記液與100μl內(nèi)標(biāo)溶液混合，制得進(jìn)樣液。采用uplc-q-orbitrap液相質(zhì)譜聯(lián)用儀中的fullms模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集：①液相色譜參考條件：色譜柱：beh300c18色譜柱(2.1mm×100mm,1.7μm)；流動相：a相：0.1％甲酸-水溶液；b相：0.1％甲酸-乙腈溶液；進(jìn)樣體積：5μl；柱溫：30℃；流速：0.3ml/min。②高分辨質(zhì)譜參考條件：質(zhì)譜儀：qexactive靜電場軌道離子阱質(zhì)譜儀；離子源模式：hesi源正離子模式；鞘氣氣流：40l/min；輔助氣氣流：10l/min；毛細(xì)管電壓：3.5kv；毛細(xì)管溫度：320℃；輔助氣溫度：350℃；數(shù)據(jù)采集模式：fullms模式，質(zhì)譜掃描范圍為200-2000m/z，分辨率為70000，最大延遲時間為200ms，自動增益控制(agc)值為1×10⁶。

經(jīng)質(zhì)譜采集確定酶解時間點3min、6min、9min、12min、15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min和120min時對應(yīng)生成肽段的濃度值。

2、酶解曲線的擬合

應(yīng)用sas軟件，將酶解時間與肽段生成量的基本關(guān)系代入酶解函數(shù)模型，擬合生成各肽段的酶解曲線函數(shù)表達(dá)式，并可計算得到不同肽段對應(yīng)的酶解米氏常數(shù)與最大反應(yīng)速率，結(jié)果如表2所示。

表2

根據(jù)α-乳白蛋白經(jīng)trypsin酶解所得肽段的擬合曲線及殘差圖可知，酶解生成曲線具有良好的擬合，其殘差值均小于20％。

實施例3：β-乳球蛋白經(jīng)trypsin酶解所得肽段的酶解曲線擬合

酶解時間點及其對應(yīng)產(chǎn)物濃度的采集的操作步驟同實施例1，采集確定酶解時間點3min、6min、9min、12min、15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min和120min時對應(yīng)生成肽段的濃度值。

應(yīng)用sas軟件，將酶解時間與肽段生成量的基本關(guān)系代入酶解函數(shù)模型，擬合生成各肽段的酶解曲線函數(shù)表達(dá)式，并可計算得到不同肽段對應(yīng)的酶解米氏常數(shù)與最大反應(yīng)速率，結(jié)果如表3所示。

表3

根據(jù)β-乳球蛋白經(jīng)trypsin酶解所得肽段的擬合曲線及殘差圖可知，酶解生成曲線具有良好的擬合，其殘差值均小于20％。