本發(fā)明屬于病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

水貂阿留申病(aleutianminkdisease，amd)是由水貂阿留申病毒(aleutianminkdiseasevirus，amdv)引起的水貂慢性傳染性疾病，主要侵害水貂的免疫系統(tǒng)，以漿細(xì)胞彌漫性增生和持續(xù)性病毒血癥為特征。該病在歐洲、美洲、亞洲等國家均有發(fā)生，我國的東北地區(qū)以及山東、新疆、內(nèi)蒙古等地普遍流行，陽性率在20％～30％，個別可達(dá)71％。amd不僅能引起一定程度的死亡，還可導(dǎo)致水貂的繁殖力和毛皮質(zhì)量嚴(yán)重下降，造成不可彌補的經(jīng)濟損失，是危害水貂養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。

水貂阿留申病毒(aleutianminkdiseasevirus，amdv)屬于細(xì)小病毒科(parvoviridae)、細(xì)小病毒亞科(parvovirinae)、阿留申貂病毒屬(amdovirus)。該病毒粒子分為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白兩類，其中結(jié)構(gòu)蛋白vp2是amdv的主要免疫原性抗原，與致病性密切相關(guān)，vp2基因也已成為研究amdv毒力、致病性、抗原性和建立檢測方法的首選基因。由于amd特殊的致病機理，至今尚無有效預(yù)防該病的常規(guī)疫苗，也無有效治療該病的特異性藥物。目前防控該病的主要手段是通過檢疫淘汰策略凈化種群，因此建立一種快速有效的診斷方法對amd的控制和清除具有重要意義。

申請公布號為cn105242042a的發(fā)明專利公開了一種水貂阿留申病毒抗體快速檢測試劑盒，可以通過間接elisa法對水貂amdv病毒抗體進行檢測，其特異性較傳統(tǒng)的對流免疫電泳法(ciep)更高，但是間接elisa法和ciep法的檢測靶標(biāo)是抗體，需要對貂群進行頻繁采血，而對貂采血難度較大、對貂的應(yīng)激也較大，因此適用范圍有限。而雙抗體夾心elisa(das-elisa)的靈敏性和特異性均較高，更重要的是，該方法只需采集貂糞即可進行檢測，適用于獸醫(yī)臨床樣品的大規(guī)模檢測。因此，對于amdv檢測的das-elisa方法進行探索和優(yōu)化，以提供最佳的檢測條件和方法，成為本領(lǐng)域技術(shù)人員急需解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，包括包被有捕捉抗體的酶標(biāo)板、檢測抗體、酶標(biāo)抗體以及顯色液，其中：

所述捕捉抗體為鼠抗阿留申病毒vp2蛋白單克隆抗體，包被濃度為5～20μg/ml；所述單克隆抗體由adv-1g5雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生，所述adv-1g5雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號為cgmccno.13829；

所述檢測抗體為兔抗阿留申病毒vp2蛋白多克隆抗體，濃度為4～40μg/ml；

所述酶標(biāo)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔igg。

所述捕捉抗體由經(jīng)4次免疫的balb/c小鼠脾細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞融合形成的adv-1g5雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生，所述檢測抗體由經(jīng)3次免疫的兔脾細(xì)胞產(chǎn)生，均具有良好的特異性，適于應(yīng)用；經(jīng)與對照組比較，捕捉抗體和檢測抗體在上述范圍內(nèi)時具有較好的檢測效果。

進一步地，所述捕捉抗體的包被濃度為10μg/ml，所述檢測抗體的濃度為8μg/ml。

實驗例表明，上述濃度分別為捕捉抗體和檢測抗體的最佳工作濃度。

進一步地，所述酶標(biāo)板的包被方法如下：用0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液對所述捕捉抗體進行稀釋，包被溫度為4～37℃，包被時間為1～12h。

通過上述方法進行包被，可顯著提高包被的穩(wěn)定性、降低包被濃度，節(jié)約捕捉抗體的用量。

進一步地，所述酶標(biāo)板的包被溫度為4℃，包被時間為12h。

實施例表明，上述條件為酶標(biāo)板的最佳包被條件。

進一步地，所述酶標(biāo)抗體的使用方法如下：將酶標(biāo)抗體用1％的脫脂奶粉稀釋2000～8000倍，在37℃下作用30～90min。

在上述條件下，酶標(biāo)抗體具有較好的靈敏性，與檢測抗體的結(jié)合率較高、牢固程度較好。

進一步地，所述試劑盒還包括封閉液、洗滌緩沖液、顯色液以及終止液中的至少一種。

進一步地，所述封閉液為5％脫脂奶粉、5％胎牛血清、5％馬血清、3％bsa或5％bsa中的一種。

進一步地，所述封閉液為5％的脫脂奶粉。

封閉液的作用是將酶標(biāo)板中未被吸附的位點進行封閉，以降低非特異性吸附，避免吸附雜質(zhì)對實驗結(jié)果造成干擾，降低假陽性結(jié)果發(fā)生的概率。

進一步地，封閉條件為37℃下1～3h。

該條件下封閉液可以起到較好的封閉效果，降低本底干擾。

進一步地，所述顯色液為tmb顯色液，顯色時間為5～20min。

顯色時間在該范圍內(nèi)時，可以使顯色充分、提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和顯色效率。

本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明提供了一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，利用amdv-vp2蛋白分別免疫小鼠和家兔，制成鼠抗amdv單克隆抗體和兔抗amdv多克隆抗體，分別作為捕捉抗體和檢測抗體，對病毒抗原進行雙向夾持，通過對酶標(biāo)二抗與檢測抗體結(jié)合的檢測，實現(xiàn)了對amdv抗原的檢測；通過對實驗方法進行優(yōu)化，確定了最佳反應(yīng)條件。本研究建立的das-elisa檢測方法具有敏感、特異、穩(wěn)定、簡便等優(yōu)點，適用于一線檢疫人員進行大規(guī)模病原檢測。

附圖說明

圖1為實驗例1中vp2重組表達(dá)蛋白sds-page電泳圖；

圖2為實驗例1中vp2重組表達(dá)蛋白westernblotting分析結(jié)果；

圖3為實驗例2中pab和mab的ifa檢測結(jié)果；

其中：a:pab感染crfk細(xì)胞的ifa檢測結(jié)果；b:pab產(chǎn)生細(xì)胞的ifa檢測結(jié)果；c：mab感染crfk細(xì)胞的ifa檢測結(jié)果；d：mab產(chǎn)生細(xì)胞的ifa檢測結(jié)果；

圖4為實驗例3中陽性樣品組的棋盤法實驗結(jié)果；

圖5為實驗例3中陰性樣品組的棋盤法實驗結(jié)果；

圖6為實驗例6中特異性實驗的結(jié)果；

圖7為實驗例7中敏感性實驗的結(jié)果；

圖8為實驗例8中das-elisa和pcr實驗結(jié)果比較。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和以下實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明。

實施例1

一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，包括包被有捕捉抗體的酶標(biāo)板、檢測抗體以及酶標(biāo)抗體，其中：

所述捕捉抗體為鼠抗阿留申病毒vp2蛋白單克隆抗體，包被濃度為5μg/ml；

所述檢測抗體為兔抗阿留申病毒vp2蛋白多克隆抗體，濃度為4μg/ml；

所述酶標(biāo)抗體為山羊抗兔igg-hrp。

實施例2

一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，包括包被有捕捉抗體的酶標(biāo)板、檢測抗體以及酶標(biāo)抗體，其中：

所述捕捉抗體為鼠抗阿留申病毒vp2蛋白單克隆抗體，包被濃度為20μg/ml；

所述檢測抗體為兔抗阿留申病毒vp2蛋白多克隆抗體，濃度為40μg/ml；

所述酶標(biāo)抗體為山羊抗兔igg-hrp。

實施例3

一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，包括包被有捕捉抗體的酶標(biāo)板、檢測抗體以及酶標(biāo)抗體，其中：

所述捕捉抗體為鼠抗阿留申病毒vp2蛋白單克隆抗體，用0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液將捕捉抗體稀釋為10μg/ml，包被條件為37℃、1h；

所述檢測抗體為兔抗阿留申病毒vp2蛋白多克隆抗體，濃度為8μg/ml；

所述酶標(biāo)抗體為山羊抗兔igg-hrp，用1％的脫脂奶粉稀釋2000倍。

實施例4

一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，包括包被有捕捉抗體的酶標(biāo)板、檢測抗體以及酶標(biāo)抗體，其中：

所述捕捉抗體為鼠抗阿留申病毒vp2蛋白單克隆抗體，用0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液將捕捉抗體稀釋為10μg/ml，包被條件為37℃、2h；

所述檢測抗體為兔抗阿留申病毒vp2蛋白多克隆抗體，濃度為8μg/ml；

所述酶標(biāo)抗體為山羊抗兔igg-hrp，用1％的脫脂奶粉稀釋8000倍。

實施例5

一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，包括包被有捕捉抗體的酶標(biāo)板、檢測抗體以及酶標(biāo)抗體，其中：

所述捕捉抗體為鼠抗阿留申病毒vp2蛋白單克隆抗體，用0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液將捕捉抗體稀釋為10μg/ml，包被條件為4℃、12h；

所述檢測抗體為兔抗阿留申病毒vp2蛋白多克隆抗體，濃度為8μg/ml；

所述酶標(biāo)抗體為山羊抗兔igg-hrp，用1％的脫脂奶粉稀釋5000倍。

實施例6

如實施例5所述的一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，還包括封閉液，所述封閉液為5％脫脂奶粉。

實施例7

如實施例5所述的一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，還包括封閉液，所述封閉液為5％胎牛血清。

實施例8

如實施例5所述的一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，還包括封閉液，所述封閉液為5％馬血清。

實施例9

如實施例5所述的一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，還包括封閉液，所述封閉液為3％bsa。

實施例10

如實施例5所述的一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，還包括封閉液，所述封閉液為5％bsa。

實施例11

如實施例6所述的一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，還包括tmb顯色液。

對照例1

如實施例3所述的一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，其中所述捕捉抗體的包被條件為37℃、0.5h。

對照例2

如實施例3所述的一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，其中所述捕捉抗體的包被條件為4℃、14h。

對照例3

如實施例5所述的一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，還包括封閉液，所述封閉液為1％bsa。

對照例4

如實施例5所述的一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，還包括封閉液，所述封閉液為8％bsa。

對照例5

如實施例5所述的一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，還包括封閉液，所述封閉液為3％胎牛血清。

對照例6

如實施例5所述的一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，其中所述酶標(biāo)抗體用1％的脫脂奶粉稀釋1000倍。

對照例7

如實施例5所述的一種水貂阿留申病毒雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒，其中所述酶標(biāo)抗體用1％的脫脂奶粉稀釋10000倍。

實驗例1

阿留申病毒vp2抗原的制備與鑒定

(1)選取vp2基因600～1755nt區(qū)域進行合成并連接pet-30a(+)載體，陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化bl21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，進行搖瓶培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進行測序；

(2)選取測序結(jié)果為陽性的菌于37℃搖床培養(yǎng)過夜，搖起的菌液以1﹕100接種量轉(zhuǎn)入kanamycinlb液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至od600nm值為0.4～0.6時，加入iptg至終濃度為1mmol/l，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h；

(3)收集誘導(dǎo)的菌體，1×pbs洗滌1次后重懸，利用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌體后離心，分別取上清和沉淀進行sds-page分析，確定目的蛋白表達(dá)情況；

(4)將表達(dá)的帶組氨酸標(biāo)簽的vp2蛋白利用ni-ntaagarose進行純化后，對包涵體蛋白進行復(fù)性，以amdv陽性血清作為一抗進行westernblotting分析，超濾濃縮后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

sds-page結(jié)果如圖1所示，重組菌經(jīng)iptg誘導(dǎo)獲得高效表達(dá)，包涵體中出現(xiàn)55kda左右的目的蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果相符；westernblotting結(jié)果如圖2所示，顯示目的蛋白與amdv陽性血清呈特異性反應(yīng)，說明重組表達(dá)的vp2蛋白具有良好的免疫原性。

實驗例2

抗體的制備與鑒定

1.捕捉抗體的制備與鑒定

(1)將阿留申病毒vp2抗原與fca等體積混合，按照60ug/只的劑量，對10只6周齡spf級雌性balb/c小鼠進行皮下注射免疫；

(2)此后每隔14d免疫一次，劑量為30ug/只，以ifca為佐劑；

(3)于第4次免疫后的第7d進行眼眶取血，用間接elisa法檢測血清抗體效價，并用50ug抗原對免疫血清效價最高的小鼠進行腹腔沖擊；

(4)腹腔沖擊3d后，取免疫后小鼠脾細(xì)胞，采用peg法將其與sp2/0細(xì)胞進行融合，融合細(xì)胞采用hat半固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，得到adv-1g5雜交瘤細(xì)胞；

(5)以阿留申病毒為包被抗原建立間接elisa方法，對雜交瘤細(xì)胞上清進行檢測；陽性雜交瘤細(xì)胞株鑒定亞類后擴大培養(yǎng)，以此制備腹水；

腹水采用辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉淀法純化，通過間接elisa測定mab效價，并用ifa法鑒定mab的特異性。

2.鑒定抗體的制備與鑒定

(1)將阿留申病毒vp2抗原與fca等體積混合，按照1mg/只的劑量，對若干只新西蘭大白兔進行皮下多點注射免疫；

(2)14d后進行第二次免疫，劑量為1mg/只，以ifca為佐劑；

(3)再次間隔14d后進行第三次免疫，劑量為1mg/只，無佐劑；

(4)于第三次免疫后的第7d進行耳緣靜脈采血，收獲兔血清，通過間接elisa檢測pab的效價，并用間接免疫熒光(ifa)檢測pab反應(yīng)活性。

實驗結(jié)果顯示，以純化的vp2蛋白作為包被抗原，間接elisa方法檢測pab和mab的效價分別為1﹕12800和1﹕204800。經(jīng)southernbiotech亞類鑒定試劑盒鑒定，mab為igg2aκ亞型。ifa檢測結(jié)果如圖3所示，pab和mab均能與感染amdv的crfk細(xì)胞反應(yīng)，出現(xiàn)綠色熒光，與未感染的crfk細(xì)胞則無反應(yīng)，表明得到的pab和mab均具有較好的特異性。

實驗例3

das-elisa實驗方法的建立

1.捕捉抗體和檢測抗體最佳工作濃度的確定

通過棋盤滴定法確定兩者的最佳工作濃度。將mab按倍比稀釋為40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml包被酶標(biāo)板，將pab倍比稀釋為4000μg/ml、800μg/ml、400μg/ml、80μg/ml、40μg/ml、8μg/ml、4μg/ml和0μg/ml，加入1:5000稀釋的山羊抗兔igg-hrp，進行das-elisa試驗檢測純化amdv抗原，同步設(shè)立crfk細(xì)胞抗原為陰性對照。選擇od450nm值接近1，p/n值最大孔所對應(yīng)的mab和pab濃度作為最佳工作濃度。

實驗結(jié)果如圖4和圖5所示，最佳工作濃度為：mab的包被濃度為10μg/ml，pab的濃度為8μg/ml

2.包被條件的確定

用ph9.6、0.05mol/l碳酸鹽緩沖液稀釋mab，分別按照實施例3～5和對照例1～2提供的包被條件對酶標(biāo)板進行包被。在捕捉抗體和檢測抗體的最佳工作濃度條件下，確定mab的最佳包被條件。

結(jié)果顯示，實施例1～3提供的條件較對照例1～2提供的條件更佳，其中最佳包被條件為實施例5提供的4℃、12h。

3.封閉液和封閉時間的確定

捕捉抗體和檢測抗體為最佳工作濃度，包被條件最佳，分別采用實施例6～10和對照例3～5中提供的封閉液，于37℃下分別作用0.5h、1h、2h、3h、4h、5h，測定od450nm的值，確定最佳封閉液和封閉時間。

結(jié)果顯示，最佳封閉液為實施例6提供的5％脫脂奶粉，最佳封閉時間為1h。

4.抗原最佳作用時間的確定

在已確定的最佳反應(yīng)條件下，包被、封閉后，采用實施例6所述的試劑盒，加入純化的amdv，37℃分別反應(yīng)15min、30min、60min、90min、120min、150min，進行das-elisa試驗，確定待檢抗原的最佳作用時間。

結(jié)果顯示，抗原的最佳作用時間為60min。

5.酶標(biāo)抗體稀釋度和作用時間的確定

在上述確定的最佳試驗條件下，將山羊抗兔igg-hrp分別按照實施例3～5和對照例6～7中提供的方法進行稀釋，于37℃下分別作用15min、30min、60min、90min、120min，測定od450nm的值，確定酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度和作用時間。

結(jié)果顯示，酶標(biāo)抗體的最佳稀釋倍數(shù)為實施例5提供的1:5000，最佳作用時間為30min。

6.顯色時間的確定

在上述優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件下，每孔加入100μl的實施例11提供的tmb顯色液，室溫條件下分別避光顯色1min、3min、5min、10min、15min、20min、30min后，每孔加入100μl濃度為2mol/l的h2so4終止反應(yīng)，分別檢測od450nm，確定最佳顯色時間。

結(jié)果顯示，最佳顯色時間為5min。

實驗例5

判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

采用上述經(jīng)優(yōu)化的das-elisa方法檢測30份經(jīng)pcr確定為陰性的樣品，計算od450nm的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(sd)，根據(jù)公式cut-off即可確定陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)實驗結(jié)果，cut-offvalue＝0.134+3*0.025＝0.21，即當(dāng)od450nm＞0.21時，則判定樣品為amdv陽性。

實驗例6

特異性試驗

以優(yōu)化的最佳檢測條件同步檢測cpv、cdv、mev3種病毒，同時設(shè)立amdv陰、陽性對照和crfk細(xì)胞培養(yǎng)物的空白對照，檢驗該方法的特異性。

實驗結(jié)果如圖6所示，只有amdv的檢測結(jié)果為陽性，其他3種病毒及crfk細(xì)胞培養(yǎng)物的檢測結(jié)果均為陰性，說明該方法特異性良好，不易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

實驗例7

敏感性試驗

將純化的amdv用pbs稀釋至64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml，采用建立的das-elisa方法對其進行檢測，以amdv的稀釋度為橫坐標(biāo)，讀取的od450nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析該方法的敏感性。

實驗結(jié)果如圖7所示，當(dāng)amdv濃度為2μg/ml時結(jié)果仍為陽性，而當(dāng)濃度為1μg/ml時結(jié)果則為陰性，說明該方法的最低檢出量可以達(dá)到2μg/ml，敏感性較好。

實驗例8

符合率試驗

取102份臨床肛拭子樣品，利用建立的das-elisa與pcr方法同時對其進行檢測，比較兩者的檢測結(jié)果，確定符合率。

實驗結(jié)果如圖8所示，其中陰性樣品的符合率100％，陽性樣品的符合率93.75％，總符合率96.875％，批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于10％。表明該方法重復(fù)性較好，適宜用于對大批量樣品進行分析。

以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。