本發(fā)明屬于紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯分析的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及北極海洋紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯的結(jié)構(gòu)鑒定方法。

背景技術(shù)：

紅球菌屬是一類廣泛分布于自然界的革蘭氏陽性菌，在土壤、海底沉積物和食草動物糞便中含量豐富，且多數(shù)為營腐生生活。紅球菌屬(rhodococcussp.)是在1891年由zoof建立的，從建立至今，分類地位一直不確定。目前，紅球菌歸屬于放線菌門(actinobacteria)，放線菌綱(actinobacteria)，放線菌亞綱(actinobacteridae)，放線菌目(actinomycetales)，棒桿菌亞目(croynebacterineae)，諾卡氏菌科(nocardiaceae)，紅球菌屬(rhodococcus)。

目前，國內(nèi)外對紅平紅球菌的研究較多，主要集中在其生物降解能力研究和分子學(xué)研究，而對紅球菌產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)研究較少，尤其對極地海洋來源的紅球菌所產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)的鑒定與研究尚十分匱乏，紅球菌b7740是我國北極科考隊于第三次北極科考時從b77站點20米的表層海水中發(fā)現(xiàn)，對于該菌所產(chǎn)物質(zhì)的研究與傳統(tǒng)類異戊二烯物質(zhì)的鑒定有所不同。常見高等植物來源的類胡蘿卜素按照含氧和不含氧分為兩類，作為動植物生長必需的色素，目前已鑒定出來的約有750種，其中來自于海洋的約有250種，40種出現(xiàn)在人類膳食之中。紅球菌b7740所產(chǎn)類胡蘿卜素因該微生物獨特的代謝通路，與常見高等植物來源類胡蘿卜素相比，結(jié)構(gòu)相差較大，結(jié)構(gòu)種類不單一，其獨特的結(jié)構(gòu)不僅賦予了它獨特的活性，也增大了鑒定其分子結(jié)構(gòu)的難度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了北極海洋紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯的結(jié)構(gòu)鑒定方法，該鑒定方法操作方便快捷，結(jié)果可靠、穩(wěn)定。

實現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：

北極海洋紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯的結(jié)構(gòu)鑒定方法，采用液質(zhì)聯(lián)用法對北極海洋紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯進行初步鑒定。

北極海洋紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯的結(jié)構(gòu)鑒定方法，包括如下步驟：

1、類異戊二烯待測樣品的配制：

將類異戊二烯提取液加入8-10wt％的氯化鈉溶液中，類異戊二烯提取液與氯化鈉溶液的體積比為1:1，混合均勻，得混合液，將混合液在3-8℃離心分層，取下層有色層，將有色層干燥，再用甲醇與甲基叔丁基醚體積比為1:1的混合溶劑復(fù)溶，并用微孔濾膜過濾，得到類異戊二烯待測樣品；

2、類異戊二烯待測樣品的檢測：

采用液質(zhì)聯(lián)用儀對類異戊二烯待測樣品進行檢測：

2.1、液相色譜條件：

色譜柱ymcc30，柱溫25℃，紫外吸收檢測器，檢測波長450nm和242nm；

流動相：流動相a為甲醇，流動相b為甲基叔丁基醚，流速：1ml/min；

洗脫程序：

第一階段：采用流動相a和流動相b的混合液洗脫30分鐘，其中流動相a的體積百分含量由95％變?yōu)?0％，流動相b的體積百分含量由5％變?yōu)?0％；

第二階段：采用流動相a和流動相b的混合液洗脫20分鐘，其中流動相a的體積百分含量由70％變?yōu)?0％，流動相b的體積百分含量由30％變?yōu)?0％；

第三階段：采用流動相a和流動相b的混合液洗脫10分鐘，其中流動相a的體積百分含量由50％變?yōu)?5％，流動相b的體積百分含量由50％變?yōu)?％；

2.2、質(zhì)譜條件：

apci離子源，正離子模式，離子源溫度300℃，毛細管電壓350v，電暈電壓1v，干燥氣流7l/min，霧化室溫度350℃，霧化器壓力10psi，質(zhì)荷比掃描范圍50-1200。

進一步，步驟2.1中，離心的轉(zhuǎn)速為7000rpm，時間為10min。

進一步，步驟2.1中，微孔濾膜的孔徑為0.22μm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果在于：

1、類異戊二烯包括類異戊二烯醌與類胡蘿卜素，是自然界中廣泛存在的一類天然活性物質(zhì)。目前，對于植物和部分海洋動物來源的類異戊二烯的研究逐漸完善，已達到廣泛應(yīng)用階段，但微生物(特別是海洋微生物)作為類異戊二烯物質(zhì)的巨大來源，尚未有廣泛的報道與研究。紅球菌b7740作為我國第三次北極科考首次發(fā)現(xiàn)的菌種，其所產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)含量較高，種類豐富，需要我們用化學(xué)分析的方法對其進行結(jié)構(gòu)的鑒定與主要產(chǎn)物的純化。本發(fā)明所用agilent1100serieslc-msd-trap-xct初步鑒定方法，分析快速，結(jié)果可靠、穩(wěn)定，適合作為分析紅球菌b7740所產(chǎn)類胡蘿卜素的初步鑒定方法。

2、本發(fā)明可初步鑒定出紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)中包含9種類胡蘿卜素和14種類異戊二烯醌。

說明書附圖

圖1為北極海洋紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)在242nm處的液相圖譜。

圖2為北極海洋紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)在450nm處的液相圖譜。

圖3a為1號峰的紫外吸收圖譜。

圖3b為1號峰的二級質(zhì)譜圖譜。

圖4a為11號峰的紫外吸收圖譜。

圖4b為11號峰的二級質(zhì)譜圖譜。

圖5a為17號峰的紫外吸收圖譜。

圖5b為17號峰的二級質(zhì)譜圖譜。

圖6a為20號峰的紫外吸收圖譜。

圖6b為20號峰的二級質(zhì)譜圖譜。

圖7a為21號峰的紫外吸收圖譜。

圖7b為21號峰的二級質(zhì)譜圖譜。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。

北極海洋紅球菌b7740，是發(fā)明人于2008年7-9月中國第三次北極科學(xué)考察期間，用seabird911plusctd系統(tǒng)從北冰洋b77站點(146°49.28′w，76°58.08′n)25m深的表層海水樣品中分離得到，寧波市微生物與環(huán)境工程重點實驗室通過16srdna序列blast在線比對，判定該菌為紅球菌屬。

實施例1

北極海洋紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯的結(jié)構(gòu)鑒定實驗

1、實驗材料

1.1、實驗試劑

溶菌酶(20000u/mg)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，醋酸鋅、氯化鈉、甲醇和二氯甲烷購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，色譜級甲醇購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，色譜級甲基叔丁基醚購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，β-胡蘿卜素標(biāo)準品(97％)購于美國sigma公司。

1.2、實驗儀器

agilent1100serieslc-msd-trap-xct液質(zhì)聯(lián)用儀購自安捷倫公司；centrifuge5810r臺式低溫離心機購自德國eppendorf公司。

1.3、實驗原料

按照中國專利(一種紅球菌b7740類胡蘿卜素的微膠囊制備方法、201510016005.8)公開的方法制備類異戊二烯提取液：

稱取0.8g北極海洋紅球菌b7740凍干菌粉(浙江萬里學(xué)院提供)置于離心管中，加入16ml溶菌酶溶液(1mg/ml)，將離心管置于37℃水浴中，避光放置1h，然后加入24ml飽和醋酸鋅溶液使已破壁的紅球菌沉降，將該離心管于7000rpm、4℃下離心10min，丟棄上清液，再將64ml混合有機溶劑(甲醇：二氯甲烷＝4:1，體積比)加入到紅球菌沉淀中，用玻璃棒攪拌均勻，離心，分離出上清液，繼續(xù)向離心管中加入混合有機溶劑(甲醇：二氯甲烷＝4:1，體積比)，如此反復(fù)提取2-3次，合并上清液，得到類異戊二烯提取液。

2、實驗方法

2.1、類異戊二烯待測樣品的配制：

將60ml類異戊二烯提取液加入60ml10wt％氯化鈉溶液中，混合均勻，得混合液，將混合液在7000rpm、4℃離心分層，取下層有色層，將有色層用氮氣吹干，再用2ml甲醇與甲基叔丁基醚的混合溶劑(甲醇與甲基叔丁基醚的體積比為1:1)復(fù)溶，并用0.22μm微孔濾膜過濾，得到約1.5ml待測樣品。

2.2、類異戊二烯待測樣品的檢測：

采用液質(zhì)聯(lián)用儀對類異戊二烯待測樣品進行檢測：

2.2.1、液相色譜條件：

色譜柱ymcc30(5um×4.6mm×150mm)，柱溫25℃，紫外吸收檢測器，檢測波長450nm，進樣量10ul；

流動相：流動相a為甲醇，b為甲基叔丁基醚；

洗脫程序：

第一階段：采用流動相a和流動相b的混合液洗脫30分鐘，其中流動相a的體積百分含量由95％變?yōu)?0％，流動相b的體積百分含量由5％變?yōu)?0％；

第二階段：采用流動相a和流動相b的混合液洗脫20分鐘，其中流動相a的體積百分含量由70％變?yōu)?0％，流動相b的體積百分含量由30％變?yōu)?0％；

第三階段：采用流動相a和流動相b的混合液洗脫10分鐘，其中流動相a的體積百分含量由50％變?yōu)?5％，流動相b的體積百分含量由50％變?yōu)?％；

2.2.2、質(zhì)譜條件：

apci離子源，正離子模式，離子源溫度300℃，毛細管電壓350v，電暈電壓1v，干燥氣流7l/min，霧化室溫度350℃，霧化器壓力10psi，質(zhì)荷比掃描范圍50-1200。

3、實驗結(jié)果：

在檢測波長242和450nm下，分別出現(xiàn)了兩張液相色譜圖，圖1為242nm下紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)的液相色譜圖譜，圖2為450nm下紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)的液相色譜圖譜，按照出峰順序分別編號，圖1中出現(xiàn)了10個峰，分別為1、2、3、4、5、6、9、11、13和15號峰，圖2中出現(xiàn)了14個峰，分別為7、8、10、11、12、13、16、17、18、19、20、21、22和23號峰。

3.1、類異戊二烯醌的分析鑒定：

1號峰經(jīng)分析，從圖3a、圖3b和表1中可以看出，其二級質(zhì)譜圖中有m/z＝197的特征碎片離子，其紫外特征吸收峰258nm處，且加氫分子離子峰m/z＝455，因此，判斷1號峰為泛醌類物質(zhì)uq4。

2、3號峰經(jīng)分析，從表1中可以看出，其二級質(zhì)譜圖中都有m/z＝187(甲基萘醌)的特征碎片離子峰，它們的加氫分子離子峰m/z分別為717、649，同時紫外特征吸收峰都集中在242nm處，因此，判定2、3號峰分別為甲基萘醌mk8、mk7。

4、6、7和13號峰經(jīng)分析，從表1中可以看出，其二級質(zhì)譜圖中都有m/z＝187(甲基萘醌)的特征碎片離子峰，與2號峰相比，其紫外特征吸收峰有所紅移，分別為248nm、244nm、244nm、248nm，它們的氫分子離子峰m/z均為717，因此，判定4、6、7和13號峰均為2號峰的同分異構(gòu)體，均為甲基萘醌mk8。

8號峰經(jīng)分析，從表1中可以看出，其二級質(zhì)譜圖有m/z＝187(甲基萘醌)的特征碎片離子峰，與3號峰相比，其紫外特征吸收峰有所紅移，為246nm，其氫分子離子峰m/z為649，因此，判定8號峰為3號峰的同分異構(gòu)體，為甲基萘醌mk7。

5和11號峰經(jīng)分析，從表1、圖4a和圖4b中可以看出，其二級質(zhì)譜圖都有m/z＝187(甲基萘醌)的特征碎片離子峰，與3號峰相比，其紫外特征吸收峰有所紅移，分別為248nm、244nm，其加氫分子離子峰m/z分別增加了4、2da，分別為653、651，因此，我們推斷其為mk7異戊二烯鏈上的加氫產(chǎn)物，分別為mk7(h4)、mk7(h2)。

9和15號峰經(jīng)分析，從表1可以看出，其二級質(zhì)譜圖有m/z＝187(甲基萘醌)的特征碎片離子峰，與2號峰相比，其紫外特征吸收峰有所紅移，分別為254nm、248nm，其加氫分子離子峰m/z分別增加了4、2da，推斷其為mk8異戊二烯鏈上的加氫產(chǎn)物，mk8異戊二烯鏈上的加氫產(chǎn)物，分別為mk8(h4)、mk8(h2)。

14、18號峰從檢測數(shù)據(jù)初步判定其也為類異戊二烯醌。

上述峰的液質(zhì)聯(lián)用儀檢測數(shù)據(jù)如表1所示：

表1：紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯醌的出峰時間，紫外特征峰及質(zhì)譜數(shù)據(jù)

由上述可知，1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、13、14、15和18號峰所對應(yīng)的物質(zhì)均為類異戊二烯醌。

3.2、類胡蘿卜素的分析鑒定：

17號峰經(jīng)分析，從表2、圖5a、圖5a可以看出，其二級質(zhì)譜圖都有m/z＝163(c10h12o2+h)的特征碎片離子峰，其紫外特征吸收峰分別在274nm、452nm、468nm處，其加氫離子峰m/z＝589，因此，判定17號峰為all-trans-synechoxanthin(χ,χ-caroten-18,18'-dioicacid)。

10、12號峰經(jīng)分析，從表2可以看出，其二級質(zhì)譜碎片與17號峰一致，因其紫外吸收圖譜中含有在340左右的順式結(jié)構(gòu)特征吸收峰，判斷其為cis-synechoxanthin。

19號峰經(jīng)分析，具體數(shù)據(jù)見表2，將19號峰與β-胡蘿卜素標(biāo)準品的紫外吸收圖譜、液相圖譜和二級質(zhì)譜圖進行對比，發(fā)現(xiàn)兩者的圖譜基本保持一致，因此，判定19號峰為β-胡蘿卜素。

16號峰經(jīng)分析，從表2可以看出，其二級質(zhì)譜碎片與19號峰一致，因其紫外吸收圖譜中含有在340左右的順式結(jié)構(gòu)特征吸收峰，判斷其為cis-β-carotene。

20號峰經(jīng)分析，從表2、圖6a、圖6a可以看出，其二級質(zhì)譜圖有m/z＝413[m+h-c9h12]的特征碎片離子峰，紫外特征吸收峰在460nm處，加氫分子離子峰m/z＝533，因此，判定20號峰為chlorobactene(φ，ψ-carotene)。

21號峰經(jīng)分析，從表2、圖7a、圖7a可以看出，其二級質(zhì)譜圖有m/z＝409[m+h-c9h12]的特征碎片離子峰，紫外可見特征吸收峰在282nm、452nm、476nm處，加氫分子離子峰為m/z＝529，因此，判定21號峰為isorenieratene(φ，φ-carotene)。

22、23號峰從檢測數(shù)據(jù)初步判定其也為類胡蘿卜素。

上述峰的液質(zhì)聯(lián)用儀檢測數(shù)據(jù)如表2所示：

由上述可知，10、12、16、17、19、21、22、23號峰所對應(yīng)的物質(zhì)均為類胡蘿卜素。