本發(fā)明涉及生物分析領(lǐng)域的糖蛋白糖型檢測樣品前處理方法，特別涉及血漿(或血清)igg2-ab標記的糖型檢測批量前處理方法。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)糖基化是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式。真核細胞中約有一半的蛋白質(zhì)發(fā)生過糖基化。蛋白質(zhì)糖基化不僅賦予蛋白質(zhì)特定的理化性質(zhì)(如溶解性和穩(wěn)定性)，更重要的是參與凝血、免疫、細胞生長、分泌和信號傳導等生理活動。蛋白質(zhì)糖基化異常與許多疾病密切相關(guān)，比如惡性腫瘤、風濕性關(guān)節(jié)炎和阿爾茨海默病等。蛋白質(zhì)糖基化也為腫瘤早期診斷和治療提供依據(jù)，絕大多數(shù)臨床用腫瘤標記物和蛋白質(zhì)類藥物是糖蛋白。因此，研究蛋白質(zhì)糖基化不僅可以加深對糖蛋白的生物功能的認識，而且對探討疾病發(fā)生、發(fā)現(xiàn)疾病標記物和開發(fā)新藥具有重要意義。免疫球蛋白(英文全稱，igg)，又稱抗體是一種很重要的糖蛋白，主要分布在血清中。它由兩條相同的分子量較小的輕鏈和兩條分子量較大的重鏈通過二硫鍵連接而成，抗體的糖鏈位于重鏈fc片段上，為n-連接糖。igg的糖基化對于調(diào)節(jié)igg的細胞毒性和抗炎、促炎等炎性潛力非常關(guān)鍵。自身免疫狀態(tài)和igg抗體的特定糖基化模式之間的聯(lián)系已在患類風濕性關(guān)節(jié)炎和幾自身免疫血管炎的患者中被觀察到，其中已報道與igg抗體的降低的半乳糖基化和唾液酸化相關(guān)。對igg糖鏈結(jié)構(gòu)分析已成為當前研究的熱點。陶磊等人(《藥物分析雜志》，2011年第11期)分析igg1型單抗中糖鏈切除對其結(jié)構(gòu)與功能的影響，結(jié)果表明糖鏈切除后抗體的圓二色譜發(fā)生改變，抗原結(jié)合能力下降，體外cdc活性基本消失。然而糖鏈結(jié)構(gòu)中富含多羥基且基本不含發(fā)色團，呈電中性等性質(zhì)，使得糖類分析非常困難、復雜結(jié)構(gòu)的檢測更是異常艱難。因此，需要快速、簡單且精確的方式分析糖鏈結(jié)構(gòu)的技術(shù)，并且通過各種方法進行糖鏈分析。為了進行糖鏈分析，必須首先從包含在生物樣品中分離純化糖鏈。一般是將糖蛋白上的糖鏈切掉并分離純化后進行分析。因為糖鏈本身沒有發(fā)色基團，而且其在質(zhì)譜儀上不易離子化，為了在分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定過程中能夠更有效地檢測到糖鏈，一般進行柱前衍生的方法。該方法主要是對糖鏈進行標記，使糖鏈帶上紫外或熒光基團，提高檢測的靈敏度，同時又可以使糖鏈帶上疏水基團，降低糖鏈的極性，使糖鏈在反相色譜柱上得到保留，利于糖鏈的分離。目前對糖鏈進行衍生化標記的試劑主要包括2-ab標記衍生糖鏈的方法。中國專利申請201410844142.6、發(fā)明名稱“快速全面檢測單克隆抗體n糖基化位點上寡糖的方法”公開了通過酶解反應(yīng)切除寡糖，然后使用2-ab溶液標記寡糖，純化寡糖后通過lc-熒光-esi-ms分析。然而，該方法需要通過氨丙基固相萃取柱進行純化，過柱純化步驟復雜并且成本較高，因此不適于批處理切除糖鏈和2-ab標記及純化。此外，陶磊等人同時公開了從抗體或蛋白上切除或測定糖鏈的方法。然而，該方法也需要色譜柱或過柱純化，導致不能高通量或批處理，因此限制了批處理切除糖鏈和2-ab標記及純化。中國專利申請200610084289.5、發(fā)明名稱“糖鏈切除裝置”公開了用于從堿溶液中切除糖鏈的裝置，包括反應(yīng)槽和分離純化的離子交換柱。然而，該裝置只適于從復合碳水化合物中切除糖鏈，且整個裝置包括復雜的構(gòu)成部件，因此也不適于批處理切除糖鏈和2-ab標記及純化。另外，使用2-ab試劑標記糖鏈的一般步驟為:(1)通過糖苷酶從糖蛋白切除糖鏈；(2)對獲得的糖鏈進行純化；(3)2-ab標記糖鏈；(4)標記后糖鏈的純化，也就是傳統(tǒng)的二步純化法。其中，對于血清或血漿igg的糖鏈分析，還需igg的分離純化步驟。因此對于血清(或血漿)igg的糖鏈分析，相當于需要進行三次糖鏈純化，其中在標記之前必須純化糖鏈，否則可能出現(xiàn)雜質(zhì)干擾，導致標記不完全，因此二步法存在步驟繁瑣并且可能造成糖鏈產(chǎn)物的損失。同時，在一些現(xiàn)有技術(shù)中，在酶切前需要更換緩沖液，否則導致切糖酶活性變?nèi)?，切糖不充分，從而不能保證檢測結(jié)果的靈敏度和準確度。因此，目前需要一種能夠降低成本、簡化步驟，且適用批處理切除糖鏈和2-ab標記及純化的方法，該方法應(yīng)當適用于質(zhì)譜或色譜檢測用的檢測平板或微孔板。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明原理之一在于：本發(fā)明不再遵循先純化糖鏈后進行標記的傳統(tǒng)方法，而是直接進行標記后再進行純化。由于相對于昂貴的抗體及其糖鏈樣品而言，2-ab試劑更為廉價，因此在確保切除的糖鏈充分被2-ab試劑標記后再進行純化，能夠有效提高標記效率和產(chǎn)率。本發(fā)明原理之二在于：在進行標記時，為了糖鏈混合物中的雜質(zhì)影響標記，通過優(yōu)化標記反應(yīng)參數(shù)，盡可能使得標記效率達到或基本達到常規(guī)的純化環(huán)境中的標記效率，從而通過因取消純化糖鏈步驟而客觀上提高或基本提高糖鏈的標記效率。本發(fā)明原理之三在于：通過摸索2-ab與氰基硼氫化鈉的配比，選擇最適的配比，從而在保證足夠的標記效率的情況下，減少熒光劑的使用，有效減少了成本。本發(fā)明原理之四在于：還可聯(lián)合使用已有的proteing提取板，對血漿(或血清)igg進行快速純化和高效分離，從而能夠?qū)崿F(xiàn)快速、高通量的批處理過程。因此，本發(fā)明目的是提供一種從血漿或血清的igg上批處理切除糖鏈和純化的方法，步驟包括：(1)igg提?。和ㄟ^96孔proteing提取板將血漿或血清igg提取至2ml96孔收集板中，測定蛋白濃度后，取出250-350μligg溶液或120-180μgigg于1.1ml96孔深孔板中整板揮干；(2)igg切糖：在深孔板中加入變性劑變性蛋白后調(diào)節(jié)溶液ph至8.0，加入糖苷酶或切糖酶進行切除糖鏈；(3)糖鏈標記：在揮干的深孔板中加入2-ab標記溶液，65℃反應(yīng)3小時，進行2-ab標記；(4)標記后純化：深孔板加入乙腈溶液，上清液轉(zhuǎn)移至96孔糖鏈純化板，除去多余的標記試劑，在深孔板中收集洗脫出的被標記糖鏈，整板揮干；其中，步驟2)中變性劑為sds溶液，并在60℃變性反應(yīng)10min，或變性劑為igepal溶液，并在室溫變性反應(yīng)10分鐘；以及加入的糖苷酶或切糖酶的質(zhì)量g與蛋白質(zhì)的質(zhì)量g比約1:50～1:30；步驟3)中，每孔加入的標記溶液為0.5mg的2-ab和1.2mg的氰基硼氫化鈉，并且所述2-ab和氰基硼氫化鈉預先配制在含30％乙酸的dmso溶液中；步驟4)中，去除多余標記試劑所用清洗液為96％的乙腈溶液，洗脫標記的糖鏈為超純水。在一個實施方案中，步驟1)中還包括igg提取板前處理、igg結(jié)合和清洗、igg洗脫、igg提取板再生和保護。在一個具體實施方案中，所述igg提取板前處理方法為：①用2毫升超純水清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；②用2毫升1×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；③用1毫升0.1m甲酸溶液清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；④用2毫升10×pbs進行板子的中和-真空泵抽濾，去除廢液；⑤用4毫升1×pbs平衡板子-真空泵抽濾，去除廢液。在另一具體實施方案中，所述igg結(jié)合和清洗方法為：用2毫升1×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液。再重復2次。在其他具體實施方案中，所述igg洗脫的方法為：①用1毫升0.1m甲酸溶液洗脫igg-真空泵抽濾，收集洗脫液；②向收集板中加入170μl中和緩沖液，并用槍頭混勻；③用錫箔紙將收集板蓋好，放在震蕩器輕微搖晃，避免交叉污染，直至檢測樣品濃度。④在其他具體實施方案中，所述igg提取板再生和保護的方法為：⑤用2毫升0.1m甲酸溶液清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；⑥用2毫升10×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；⑦用4毫升1×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；⑧加入1毫升-真空泵抽濾，去除廢液，其中存儲緩沖液為20％乙醇溶于20mmtris+0.1mnacl；⑨加入1毫升存儲緩沖液，4℃保存。上述20％乙醇配制為20ml無水乙醇與80ml水混合而成。在另一實施方案中，步驟1)中血漿或血清樣本量為50μl，使用前用1×pbs(ph7.4)稀釋7倍，proteing提取板為96孔proteing提取板，igg收集為96孔收集板；蛋白濃度測定所用儀器為nano-drop蛋白濃度測定儀，測定波長為280nm，igg的摩爾吸光系數(shù)值為2.534×105。在另外實施方案中，步驟(2)中，sds溶液濃度為1.33％，igepal溶液濃度為為10％，ph調(diào)節(jié)劑為0.1mnaoh和5×pbs的混合液，加入的切糖酶為pngasef酶，所述igepal為(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇-辛基苯基-聚乙烯二醇。還在其他的實施方案中，步驟(4)中，純化標記后的糖鏈的純化板為0.22μm的親水性96孔板，純化過程包括清洗、洗脫過程，其中，清洗過程包括：①每個樣品中加入700μl100％乙腈，用槍頭混勻并全部(含75μl樣品和700μl乙腈)轉(zhuǎn)移到純化板中，孵育兩分鐘。真空泵抽濾，去除廢液；②在純化板的每個孔中加入200μl96％乙腈-真空泵抽濾，去除廢液，重復四次；③將純化板放在1毫升或2毫升收集板上，每個孔中加入200μl96％乙腈；④1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。其中，洗脫過程包括：①每個孔中加入100μl超純水，震蕩15分鐘；②用真空抽濾法，將第一次洗脫液收集到pcr板中，重復一次；③每個孔中加入100μl超純水，震蕩15分鐘；④純化板離心5分鐘，1000轉(zhuǎn)/分鐘，將第三次洗脫液收集到pcr板中；⑤合并三次洗脫液，揮干后于-20℃保存。在上述任一實施方案中，其中步驟4中還包括純化板預處理過程，包括：①在純化板的每個孔中加入200μl70％乙醇-真空泵抽濾，去除廢液；②在純化板的每個孔中加入200μl超純水-真空泵抽濾，去除廢液；③在純化板的每個孔中加入200μl96％乙腈-真空泵抽濾，去除廢液。在上述任一實施方案中，所述任一的加樣、洗脫、清洗等過程，均可使用thermoscientific儀器公司聯(lián)排、多孔加樣槍(型號：e1-cliptipeq8-ch15-125050，序列號：mh69055)及其配套槍頭(型號：clintip1250，序列號：94410817)。有益效果1、與傳統(tǒng)的單個糖蛋白(igg)樣品進行igg切糖-糖鏈純化-2-ab標記糖鏈-標記后糖鏈純化步驟相比，本發(fā)明在2-ab前省去了糖鏈的純化步驟，大大縮減了樣品前處理時間，還節(jié)約了成本，并且本方法能同時快速高效地處理96份血漿(或血清)樣品，具有高通量特性。2、本發(fā)明通過比對分析，確定了280nm下抗體的測定濃度的摩爾吸光系數(shù)為2.534×105。該系數(shù)能夠?qū)?yīng)于最適的抗體濃度，從而保障后續(xù)的糖鏈純化過程。3、本發(fā)明通過比對分析，確定了糖鏈標記2-ab和氰基硼氫化鈉的加入配比為2-ab:氰基硼氫化鈉＝0.5mg:1.2mg。術(shù)語和解釋術(shù)語“摩爾吸光系數(shù)”，表示液層厚度為1cm的單位濃度溶液，對一定波長的光的吸光度.表示某物質(zhì)對特定波長光的吸收能力。單位是：l/(mol*cm)，其中，朗伯-比爾吸收定律：a＝kbca是物質(zhì)對光的吸收程度——吸光度；k是摩爾吸光系數(shù)；b是比色皿的厚度；c是待測溶液的濃度；當知道以上的兩個條件(摩爾吸光系數(shù)已知的情況下)的時候，就可求出另一個數(shù)。在測定蛋白濃度時，nano-drop的比色皿厚度已知，吸光度a(280nm)由儀器自動讀出，確定抗體的摩爾吸光系數(shù)后就能對抗體濃度進行測定。因此，抗體的摩爾吸光系數(shù)準確性直接關(guān)系抗體濃度的準確性。已知的280nm下蛋白的摩爾吸光系數(shù)由蛋白中個別存在吸光度的氨基酸貢獻而得。其公式為：k280＝5500*[trpresidues]+1490*[tyrresidues]+125*[cystine(disulfidebond)]。本發(fā)明采用輕鏈(序列長度236，來源prt數(shù)據(jù)庫)和重鏈(序列長度469，來源prt數(shù)據(jù)庫)的序列計算出trp、tyr和cys的個數(shù)分別為15、29和16，因抗體為雙鏈結(jié)構(gòu)，trp、tyr和二硫鍵的個數(shù)分別為30、58和16。帶入上述公式得出k280的摩爾吸光系數(shù)為2.534×105。術(shù)語“igg提取板再生和保護”，指是為了重復利用igg提取板，對提取板進行再生和保護。已知實驗室已重復利用約10次左右仍然有效，這樣可以降低實驗成本。附圖說明圖1.血漿(或血清)igg2-ab標記的糖型檢測批量前處理方法的操作流程示意圖圖2.uplc檢測2-ab標記糖鏈的檢測結(jié)果圖3.lc-ms/ms測定人血igg糖型圖譜具體實施方法下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。實施例一、實驗材料與方法實驗所用儀器：(1)本發(fā)明的方法需使用與96孔igg提取板和96孔糖鏈純化板相匹配的負壓泵或正壓泵(推薦使用waters負壓泵)、真空濃縮儀(可96孔板整板揮干)，對于本發(fā)明處理的糖鏈的檢測可使用(1)配備熒光檢測器的高效液相色譜儀，其中，96孔proteing提取板為biaseparations公司，貨號no:2375，96孔收集板為axygen公司，貨號：p-dw-20-c)板，96孔深孔板為axygen公司，貨號：p-dw-11-c。(2)與配備熒光檢測器的高效液相色譜儀相連的、具有esi離子源的高分辨質(zhì)譜儀。(3)maldi-tof質(zhì)譜進行檢測。實驗步驟：(一)血漿(或血清)igg的提取純化步驟如下：1、igg提取板前處理①用2毫升超純水清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；②用2毫升1×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；③用1毫升0.1m甲酸溶液清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；④用2毫升10×pbs進行板子的中和-真空泵抽濾，去除廢液；⑤用4毫升1×pbs平衡板子-真空泵抽濾，去除廢液。(二)igg結(jié)合和清洗①血漿(或血清)樣本量為50μl，用1×pbs(ph7.4)稀釋7倍后加入igg提取板；②用2毫升1×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液，③再重復2次。(三)igg洗脫①用1毫升0.1m甲酸溶液洗脫igg-真空泵抽濾，收集洗脫液；②向收集板中加入170μl中和緩沖液，并用槍頭混勻；③放在震蕩器輕微搖晃，避免交叉污染，直至檢測樣品濃度；④震蕩結(jié)束后用nanodrop蛋白濃度測定儀進行蛋白定量，其中測定波長為280nm，igg的摩爾吸光系數(shù)值設(shè)為2.534×105，之后用錫箔紙蓋好。(四)igg提取板再生和保護①用2毫升0.1m甲酸溶液清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；②用2毫升10×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；③用4毫升1×pbs清洗板子-真空泵抽濾，去除廢液；④加入1毫升存儲緩沖液(20％乙醇溶于20mmtris+0.1mnacl)-真空泵抽濾，去除廢液；⑤加入1毫升存儲緩沖液(20％乙醇溶于20mmtris+0.1mnacl)，4℃保存。(五)igg切除糖鏈①每孔取1.3.4的igg溶液300μl(約150μg)整板揮干，每孔加入1.33％sds30μl，60℃反應(yīng)10min。冷卻至室溫后，每孔加入10％igepal10μl，室溫反應(yīng)10min；②每孔加入20μl0.1mnaoh溶液和5×pbs溶液15μl調(diào)劑2.1溶液的ph約為7.8左右，震蕩混勻，加入pngasef酶(酶與蛋白質(zhì)量比約1:50～1:30)，37℃反應(yīng)18小時；③切糖結(jié)束后，將整板溶液進行揮干，-20℃保存。(六)2-ab標記糖鏈①標記前配置標記溶液，將醋酸加入dmso配制成30％醋酸溶液，然后將醋酸/dmso混合液加入2-ab中，混勻至完全溶解，再將上述溶液加入pb，混勻至完全溶解。每個樣本糖鏈標記過程中2-ab和氰基硼氫化鈉的加入配比為2-ab:氰基硼氫化鈉＝0.5mg:1.2mg。②每個樣品中加入25μl標記試劑，用槍頭混勻。將板子用密封膜封好，放在震蕩器上震蕩10分鐘。將板子放入烤箱，65℃，反應(yīng)3小時。(七)標記后糖鏈的純化①純化板預處理；②純化板的每個孔中加入200μl70％乙醇-真空泵抽濾，去除廢液；③純化板的每個孔中加入200μl70％乙醇-真空泵抽濾，去除廢液；④純化板的每個孔中加入200μl超純水-真空泵抽濾，去除廢液；⑤純化板的每個孔中加入200μl96％乙腈-真空泵抽濾，去除廢液。(八)清洗糖鏈(去除雜質(zhì))①每個樣品中加入700μl100％乙腈，用槍頭混勻并全部(含75μl樣品和700μl乙腈)轉(zhuǎn)移到純化板中，孵育兩分鐘，真空泵抽濾，去除廢液；②在純化板的每個孔中加入200μl96％乙腈-真空泵抽濾，去除廢液；③重復四次；④將純化板放在1毫升或2毫升收集板上，每個孔中加入200μl96％乙腈，真空泵抽濾，去除廢液。1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。(九)糖鏈洗脫①每個孔中加入100μl超純水，震蕩15分鐘；②真空抽濾將第一次洗脫液收集到pcr板1中；每個孔中加入100μl超純水，震蕩15分鐘；③真空抽濾將第二次洗脫液收集到pcr板2中；每個孔中加入100μl超純水，震蕩15分鐘；④純化板離心5分鐘，1000轉(zhuǎn)/分鐘，將第三次洗脫液收集到pcr板中；⑤合并三次洗脫液，揮干后于-20℃保存。實施例二、lc法確定2-ab標記糖鏈法的試劑的最適配比選用標準抗體樣品mab(waters公司，貨號：186006552，批號：w26081603)，對該抗體用水溶解，配成濃度為5mg/ml，每管取抗體溶液40μl(igg200μg)，共兩管，揮干樣本，進行相同的變性和切糖實驗(實驗方法見實施例一)。切糖后溶液揮干，考察2-ab標記糖鏈的標記效果。配方1按照2-ab和氰基硼氫化鈉的加入配比(質(zhì)量比)5mg:12mg配置總體積為250為氫的配比關(guān)系進行配置2-ab溶液。配方2按照2-ab和氰基硼氫化鈉的加入配比(質(zhì)量比)5mg:6mg配置總體積為1000為的配比關(guān)系進行配置2-ab溶液。實際配置中根據(jù)樣本個數(shù)(每個樣本需加入25μl標記試劑)優(yōu)先計算好所需的2-ab和氰基硼氫化鈉質(zhì)量，然后按比例進行配置。配置標記溶液，先將醋酸加入dmso配制成30％醋酸溶液，然后將醋酸/dmso混合液加入2-ab中，混勻至完全溶解，再將上述溶液加入pb，混勻至完全溶解。每個樣本需加入25μl2-ab標記溶液，相當于配方1中每個樣本2-ab和氰基硼氫化鈉的加入配比(質(zhì)量比)0.5mg:1.2mg，而配方2中每個樣本2-ab和氰基硼氫化鈉的加入配比(質(zhì)量比)為1.25mg:1.5mg。其中，含有2-ab的標記溶液的組分如表1所示。配方12-ab(mg)nabh3cn(mg)乙酸(μl)dmso(μl)總體積(μl)加入比例51275175250每個樣本0.51.225配方22-ab(mg)nabh3cn(mg)乙酸(μl)dmso(μl)總體積(μl)加入比例563070100每個樣本1.251.525兩管樣本被標記后純化實驗參見實施例1。樣品uplc檢測：經(jīng)標記純化的標準mab的糖鏈樣品用20μl50％acn水溶液進行重溶，上樣10μl。uplc儀器型號：acquityuplch-class(waters公司)流動相：a相：50mm甲酰銨(hcoonh4)；b相：100％乙腈(acn)；流速：0.4ml/min，梯度：25％～38％～90％～90％～25％～25％a；0min～20.0min～22min～25min～26min～30min。色譜柱：acquityuplcbehamidecolumn(1.7μm，2.1mmx150mm)；柱溫：60℃。熒光檢測器檢測條件：激發(fā)波長:330nm；發(fā)射波長:420nm檢測結(jié)果如圖2，藍色(圖2上圖)所示為按配方1配置2-ab試劑的檢測結(jié)果，紅色(圖2下圖)所示為按配方2配置2-ab試劑的檢測結(jié)果。比較這兩組結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1、圖中糖鏈色譜峰出峰個數(shù)與出峰時間一致，表明兩種方法配置的2-ab溶液標記糖鏈時不存在漏標現(xiàn)象；2、這兩組結(jié)果各糖鏈色譜峰的相對峰強一致，而絕對強度配方2僅僅略高不到10個單位(即上圖下圖強度低不足10左右)，并沒有使色譜峰強度提高很多，表明按配方1標記糖鏈糖鏈已基本標記完全。3、由于配方2加強了熒光劑2-ab的使用量，其標記的效果通常預料到其應(yīng)當顯著高于配方1。但實驗結(jié)果表明在大幅度減少熒光劑的比例的情況下，配方1也能實現(xiàn)完全標記，并且色譜峰強度與配方2沒有明顯區(qū)別。因此綜合考慮標記效果和實驗成本問題，優(yōu)先考慮配方1配置2-ab標記試劑，即按每個樣本2-ab和氰基硼氫化鈉的加入配比(質(zhì)量比)0.5mg:1.2mg進行2-ab標記實驗。實施例三、lc-ms/ms鑒定血漿(血清)igg糖鏈將實施例1所制備的人血漿igg2-ab標記糖鏈進行l(wèi)c-ms/ms檢測，其中可按實施例1進行人血漿(血清)樣品糖基前處理后。采用的實驗條件如下：lc系統(tǒng)：acquityuplch-class(waters公司)。流動相：a相：50mmhcoonh4；b相：100％acn。流速：0.4ml/min，梯度：25％～46％～100％～100％～25％～25％～25％a；0min～35.0min～36.5min～39.5min～43.1min～47.6min～55min。色譜柱：acquityuplcbehamidecolumn(1.7μm，2.1mmx150mm)；柱溫：60℃。熒光檢測器檢測條件：激發(fā)波長:330nm；發(fā)射波長:420nm。質(zhì)譜系統(tǒng)：高分辨質(zhì)譜synaptg2-s(waters公司)。源溫：120℃，毛細管電壓：3.0kv，錐孔電壓：80v，掃描范圍m/z：300～2000。數(shù)據(jù)處理軟件：unifi1.8，標記：2-ab，數(shù)據(jù)庫：humanigg。經(jīng)標記純化的糖鏈樣品用20μl50％acn水溶液進行重溶，上樣10μl。經(jīng)lc分離得到的色譜峰在高分辨質(zhì)譜中進行ms及ms/ms分析，所得的液相及質(zhì)譜數(shù)據(jù)用waters儀器自帶的unifi軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行搜庫檢索，設(shè)置糖鏈的標記方式為2-ab標記，數(shù)據(jù)庫來源類型選hunanigg，m/z值匹配誤差設(shè)置為10ppm，gu值匹配誤差設(shè)置為0.2。經(jīng)unifi軟件處理得出人血漿igg糖鏈的分析鑒定結(jié)果如圖3所示。由圖3可知幾乎每個糖鏈色譜峰都得到了糖型歸屬。具體的糖鏈歸屬結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，共鑒定出51種糖型，其中保留時間為12.14min的f(6)a2這種糖型百分含量最高，百分占比為22.63；保留時間為14.81min的f(6)a2[6]g(4)1和17.79min的f(6)a2g這兩種含半乳糖的糖型的百分含量分別為第二高和第三高，百分占比分別為20.05和15.35。而唾液酸化(s表示唾液酸)的糖型占比超過25％，其他糖型的百分含量不再贅述(詳見表2)。表2lc-ms/ms鑒定人血漿igg糖型結(jié)果igg抗體糖鏈的半乳糖糖基化和唾液酸化通常是學者關(guān)注的重點，本實例結(jié)果表明，經(jīng)具體實施例1制備的igg糖鏈半乳糖糖基化和唾液酸化損失較少，樣本前處理方法可靠。經(jīng)上述檢測后，每個樣品均會得出血漿(或血清)igg經(jīng)2-ab標記的糖鏈的質(zhì)譜定性和色譜定量結(jié)果。根據(jù)不同的樣本分組，對上述結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，進而得出血漿(或血清)igg某個(或某些)糖型跟疾病或或某種狀態(tài)之間統(tǒng)計學差異，協(xié)助闡明血漿(或血清)igg某個(或某些)糖型差異跟疾病或或某種狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)。當前第1頁12