本發(fā)明屬于電化學(xué)生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高，食品安全越來越受到大家的重視。現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展使食品檢測手段更加多樣化，也更加準確、快速和安全。目前食品安全檢測中常用的幾種現(xiàn)代檢測技術(shù)，主要有實時熒光定量pcr技術(shù)、核酸探針技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(elisa)和高效液相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)(hplc-ms)和近紅外光譜技術(shù)。
生物傳感器(bioscnsor)是一種檢測生物物質(zhì)，并將其濃度轉(zhuǎn)換為電、光等信號進行檢測的儀器，生物傳感器由于其檢測快速、結(jié)果準確、靈敏度高、適用范圍廣、成本低，在食品安全檢測領(lǐng)域發(fā)揮著重要的應(yīng)用。其中，電化學(xué)酶生物傳感器是一種將電化學(xué)分析方法與酶生物技術(shù)相結(jié)合的生物傳感器，既擁有酶的專一催化性，又具備生物傳感器靈敏、快速、操作簡便的優(yōu)點，在食品安全與營養(yǎng)成分檢測方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
現(xiàn)在越來越多的人患有動脈粥樣硬化、心腦血管等疾病，這主要是由于日常飲食中膽固醇攝入過多而引起的。因此，對食品中膽固醇進行測定，以指導(dǎo)人們合理搭配飲食，調(diào)節(jié)膽固醇平衡，對保持身體健康具有重要意義?，F(xiàn)有技術(shù)中用于膽固醇檢測的方法主要有熒光分析、電化學(xué)分析、分子印跡技術(shù)等，但是這些檢測方法中的選擇性大多依賴于對膽固醇特異性識別的酶或抗體，并具有損壞性和成本相當昂貴。因此，針對血清或者食物樣品，設(shè)計出簡單、高選擇性、低成本、快速和高靈敏的膽固醇方法仍然極具臨床意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器的制備方法。
本發(fā)明的目的還在于提供由上述方法制備的基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器。
本發(fā)明的目的還在于提供上述基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：
(1)石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料的制備：將50-60mg石墨烯(gs)和2.5-3ml0.5mol/l的十二烷基苯磺酸鈉(sds)溶液充分混合，稀釋至10-15ml并超聲分散15-30min；然后將20-25ml0.12mol/l的三氯化鈦(ticl3)加入到上述分散液中，在攪拌條件下加入2.5-3ml1wt％過氧化氫(h2o2)溶液，用蒸餾水定容至80ml；然后將上述溶液在90-95℃下攪拌反應(yīng)16-18h后離心，分別用乙醇、水洗滌后將產(chǎn)物置于70-80℃真空烘箱中烘干10-12h，再在400℃馬弗爐中煅燒2h，得石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料；
(2)石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液的配置：將1-5mg步驟(1)所述石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料超聲分散在1ml濃度為20wt％鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(pdda)水溶液中得石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料分散液；
(3)膽固醇修飾電極的制備：將玻碳電極(gce)進行拋光處理、清洗并干燥；取10-15ul步驟(2)中所述石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液滴加到上述處理后的玻碳電極表面，自然晾干得tghs/gce修飾電極；然后將上述tghs/gce修飾電極置于含有0.5mmol/l的氯鉑酸(h2ptcl6)和0.5mmol/lpdcl2的溶液中電沉積200s，沉積電位為-0.2v，得tgphs/gce修飾電極；然后將10-15ul步驟(2)中所述石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液滴加于上述tgphs/gce修飾電極表面，自然晾干后將其置于納米金(aunps)溶液中4-6h得aunps/tghs/tgphs/gce修飾電極；最后將6-8ul1mg/ml的膽固醇氧化酶(chox)溶液固定在上述aunps/tghs/tgphs/gce修飾電極得膽固醇修飾電極；
(4)膽固醇生物傳感器的制備：將步驟(3)中所述膽固醇修飾電極、參比電極和對電極組成三電極體系置于電解液中，得到基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器；
(5)膽固醇生物傳感器檢測膽固醇含量：采用步驟(4)中所述基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器對食品中膽固醇含量進行檢測。
基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器，由包含修飾電極、參比電極和對電極組成。
優(yōu)選的，所述修飾電極為膽固醇修飾電極。
優(yōu)選的，所述參比電極為飽和甘汞電極或ag/agcl參比電極。
優(yōu)選的，所述對電極為鉑電極。
步驟(4)中所述電解液為濃度為0.1mol/l的磷酸氫二鈉(na2hpo4)-磷酸二氫鉀(kh2po4)緩沖溶液，支持電解質(zhì)為0.1mol/l的kcl溶液。
步驟(5)中所述檢測膽固醇含量的線性范圍為5.0×10-8-6.0×10-4mol·l-1，檢測限為1.7×10-8mol·l-1(s/n＝3)。
基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器在膽固醇定量檢測中的應(yīng)用。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點：
(1)本發(fā)明中石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料具有良好的化學(xué)表面活性，鉑-鈀合金具有良好的催化活性、導(dǎo)電性，在大大縮短傳感器反應(yīng)時間的同時，拓寬了傳感器的檢測范圍。
(2)二氧化鈦-石墨烯-鉑鈀復(fù)合納米材料具有良好的生物相容性和高比表面積，可以增大傳感器的比表面積，加快電子傳遞；另外，納米金具有優(yōu)良的催化性能，將納米金(aunps)和膽固醇氧化酶(chox)自組裝固定到二氧化鈦-石墨烯-鉑鈀復(fù)合納米材料表面，仍能保持其良好的生物活性。
(3)本發(fā)明制備的基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器具有良好的響應(yīng)能力和高靈敏度，重現(xiàn)性好、性能穩(wěn)定，且對膽固醇的選擇性好，可以避免檢測樣品中抗壞血酸(aa)、尿酸(ua)和葡萄糖等物質(zhì)的干擾；對膽固醇的線性范圍為5.0×10-8-6.0×10-4mol·l-1，檢測限為1.7×10-8mol·l-1(s/n＝3)，用于食品中膽固醇的檢測準確、快速、安全，為食品中膽固醇的質(zhì)量控制提供了良好的應(yīng)用前景。
(4)本發(fā)明的基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器制備工藝簡單、安全，反應(yīng)可在室溫環(huán)境中進行，成本低。
附圖說明
圖1為本發(fā)明膽固醇修飾電極的構(gòu)造工藝流程圖。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1
基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：
(1)石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料的制備：將50mg石墨烯(gs)和2.5ml0.5mol/l的十二烷基苯磺酸鈉(sds)溶液充分混合，稀釋至10ml并超聲分散15min；然后將20ml0.12mol/l的三氯化鈦(ticl3)加入到上述分散液中，在攪拌條件下加入2.5ml1wt％過氧化氫(h2o2)溶液，用蒸餾水定容至80ml；然后將上述溶液在90℃下攪拌反應(yīng)16h后離心，分別用乙醇、水洗滌后將產(chǎn)物置于70℃真空烘箱中烘干10h，再在400℃馬弗爐中煅燒2h，得石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料。
(2)石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液的配置：將1mg步驟(1)中石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料超聲分散在1ml濃度為20wt％鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(pdda)水溶液中得石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料分散液。
(3)膽固醇修飾電極的制備：將玻碳電極(gce)進行拋光處理、清洗并干燥；取10ul步驟(2)中石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液滴加到上述處理后的玻碳電極表面，自然晾干得tghs/gce修飾電極；然后將上述tghs/gce修飾電極置于含有0.5mmol/l的氯鉑酸(h2ptcl6)和0.5mmol/lpdcl2的溶液中電沉積200s，沉積電位為-0.2v，得tgphs/gce修飾電極；然后將10ul步驟(2)中石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液滴加于上述tgphs/gce修飾電極表面，自然晾干后將其置于納米金(aunps)溶液中4h得aunps/tghs/tgphs/gce修飾電極；最后將6ul1mg/ml的膽固醇氧化酶(chox)溶液固定在上述aunps/tghs/tgphs/gce修飾電極得膽固醇修飾電極。
(4)膽固醇生物傳感器的制備：將步驟(3)中膽固醇修飾電極、參比電極和對電極組成三電極體系置于電解液中，得到基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器；其中，電解液為濃度為0.1mol/l的磷酸氫二鈉(na2hpo4)-磷酸二氫鉀(kh2po4)緩沖溶液，支持電解質(zhì)為0.1mol/l的kcl溶液。
(5)膽固醇生物傳感器檢測膽固醇含量：采用步驟(4)中基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器對食品中膽固醇含量進行檢測，檢測膽固醇含量的線性范圍為5.0×10-8-6.0×10-4mol·l-1，檢測限為1.7×10-8mol·l-1(s/n＝3)。
一種由上述方法制備的基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器，由包含修飾電極、參比電極和對電極組成；其中，修飾電極為膽固醇修飾電極，參比電極為飽和甘汞電極或ag/agcl參比電極，對電極為鉑電極。
一種由上述方法制備的基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器用于食品中膽固醇的定量檢測。
實施例2
基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：
(1)石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料的制備：將60mg石墨烯(gs)和3ml0.5mol/l的十二烷基苯磺酸鈉(sds)溶液充分混合，稀釋至15ml并超聲分散30min；然后將25ml0.12mol/l的三氯化鈦(ticl3)加入到上述分散液中，在攪拌條件下加入3ml1wt％過氧化氫(h2o2)溶液，用蒸餾水定容至80ml；然后將上述溶液在95℃下攪拌反應(yīng)18h后離心，分別用乙醇、水洗滌后將產(chǎn)物置于80℃真空烘箱中烘干12h，再在400℃馬弗爐中煅燒2h，得石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料。
(2)石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液的配置：將5mg步驟(1)中石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料超聲分散在1ml濃度為20wt％鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(pdda)水溶液中得石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料分散液。
(3)膽固醇修飾電極的制備：將玻碳電極(gce)進行拋光處理、清洗并干燥；取15ul步驟(2)中石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液滴加到上述處理后的玻碳電極表面，自然晾干得tghs/gce修飾電極；然后將上述tghs/gce修飾電極置于含有0.5mmol/l的氯鉑酸(h2ptcl6)和0.5mmol/lpdcl2的溶液中電沉積200s，沉積電位為-0.2v，得tgphs/gce修飾電極；然后將15ul步驟(2)中石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液滴加于上述tgphs/gce修飾電極表面，自然晾干后將其置于納米金(aunps)溶液中6h得aunps/tghs/tgphs/gce修飾電極；最后將8ul1mg/ml的膽固醇氧化酶(chox)溶液固定在上述aunps/tghs/tgphs/gce修飾電極得膽固醇修飾電極。
(4)膽固醇生物傳感器的制備：將步驟(3)中膽固醇修飾電極、參比電極和對電極組成三電極體系置于電解液中，得到基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器；其中，電解液為濃度為0.1mol/l的磷酸氫二鈉(na2hpo4)-磷酸二氫鉀(kh2po4)緩沖溶液，支持電解質(zhì)為0.1mol/l的kcl溶液。
(5)膽固醇生物傳感器檢測膽固醇含量：采用步驟(4)中基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器對食品中膽固醇含量進行檢測，檢測膽固醇含量的線性范圍為5.0×10-8-6.0×10-4mol·l-1，檢測限為1.7×10-8mol·l-1(s/n＝3)。
一種由上述方法制備的基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器，由包含修飾電極、參比電極和對電極組成；其中，修飾電極為膽固醇修飾電極，參比電極為飽和甘汞電極或ag/agcl參比電極，對電極為鉑電極。
一種由上述方法制備的基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器用于食品中膽固醇的定量檢測。
實施例3
基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：
(1)石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料的制備：將55mg石墨烯(gs)和2.7ml0.5mol/l的十二烷基苯磺酸鈉(sds)溶液充分混合，稀釋至12ml并超聲分散20min；然后將22ml0.12mol/l的三氯化鈦(ticl3)加入到上述分散液中，在攪拌條件下加入2.8ml1wt％過氧化氫(h2o2)溶液，用蒸餾水定容至80ml；然后將上述溶液在92℃下攪拌反應(yīng)17h后離心，分別用乙醇、水洗滌后將產(chǎn)物置于75℃真空烘箱中烘干11h，再在400℃馬弗爐中煅燒2h，得石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料。
(2)石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液的配置：將3mg步驟(1)中石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料超聲分散在1ml濃度為20wt％鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(pdda)水溶液中得石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料分散液。
(3)膽固醇修飾電極的制備：將玻碳電極(gce)進行拋光處理、清洗并干燥；取12ul步驟(2)中石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液滴加到上述處理后的玻碳電極表面，自然晾干得tghs/gce修飾電極；然后將上述tghs/gce修飾電極置于含有0.5mmol/l的氯鉑酸(h2ptcl6)和0.5mmol/lpdcl2的溶液中電沉積200s，沉積電位為-0.2v，得tgphs/gce修飾電極；然后將12ul步驟(2)中石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液滴加于上述tgphs/gce修飾電極表面，自然晾干后將其置于納米金(aunps)溶液中5h得aunps/tghs/tgphs/gce修飾電極；最后將7ul1mg/ml的膽固醇氧化酶(chox)溶液固定在上述aunps/tghs/tgphs/gce修飾電極得膽固醇修飾電極。
(4)膽固醇生物傳感器的制備：將步驟(3)中膽固醇修飾電極、參比電極和對電極組成三電極體系置于電解液中，得到基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器；其中，電解液為濃度為0.1mol/l的磷酸氫二鈉(na2hpo4)-磷酸二氫鉀(kh2po4)緩沖溶液，支持電解質(zhì)為0.1mol/l的kcl溶液。
(5)膽固醇生物傳感器檢測膽固醇含量：采用步驟(4)中基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器對食品中膽固醇含量進行檢測，檢測膽固醇含量的線性范圍為5.0×10-8-6.0×10-4mol·l-1，檢測限為1.7×10-8mol·l-1(s/n＝3)。
一種由上述方法制備的基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器，由包含修飾電極、參比電極和對電極組成；其中，修飾電極為膽固醇修飾電極，參比電極為飽和甘汞電極或ag/agcl參比電極，對電極為鉑電極。
一種由上述方法制備的基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器用于食品中膽固醇的定量檢測。
實施例4
基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：
(1)石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料的制備：將58mg石墨烯(gs)和2.9ml0.5mol/l的十二烷基苯磺酸鈉(sds)溶液充分混合，稀釋至14ml并超聲分散25min；然后將24ml0.12mol/l的三氯化鈦(ticl3)加入到上述分散液中，在攪拌條件下加入2.5ml1wt％過氧化氫(h2o2)溶液，用蒸餾水定容至80ml；然后將上述溶液在90℃下攪拌反應(yīng)16h后離心，分別用乙醇、水洗滌后將產(chǎn)物置于70℃真空烘箱中烘干10h，再在400℃馬弗爐中煅燒2h，得石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料。
(2)石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液的配置：將4mg步驟(1)中石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料超聲分散在1ml濃度為20wt％鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(pdda)水溶液中得石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米復(fù)合材料分散液。
(3)膽固醇修飾電極的制備：將玻碳電極(gce)進行拋光處理、清洗并干燥；取15ul步驟(2)中石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液滴加到上述處理后的玻碳電極表面，自然晾干得tghs/gce修飾電極；然后將上述tghs/gce修飾電極置于含有0.5mmol/l的氯鉑酸(h2ptcl6)和0.5mmol/lpdcl2的溶液中電沉積200s，沉積電位為-0.2v，得tgphs/gce修飾電極；然后將15ul步驟(2)中石墨烯/二氧化鈦(tghs)納米分散液滴加于上述tgphs/gce修飾電極表面，自然晾干后將其置于納米金(aunps)溶液中6h得aunps/tghs/tgphs/gce修飾電極；最后將8ul1mg/ml的膽固醇氧化酶(chox)溶液固定在上述aunps/tghs/tgphs/gce修飾電極得膽固醇修飾電極。
(4)膽固醇生物傳感器的制備：將步驟(3)中膽固醇修飾電極、參比電極和對電極組成三電極體系置于電解液中，得到基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器；其中，電解液為濃度為0.1mol/l的磷酸氫二鈉(na2hpo4)-磷酸二氫鉀(kh2po4)緩沖溶液，支持電解質(zhì)為0.1mol/l的kcl溶液。
(5)膽固醇生物傳感器檢測膽固醇含量：采用步驟(4)中基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器對食品中膽固醇含量進行檢測，檢測膽固醇含量的線性范圍為5.0×10-8-6.0×10-4mol·l-1，檢測限為1.7×10-8mol·l-1(s/n＝3)。
一種由上述方法制備的基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器，由包含修飾電極、參比電極和對電極組成；其中，修飾電極為膽固醇修飾電極，參比電極為飽和甘汞電極或ag/agcl參比電極，對電極為鉑電極。
一種由上述方法制備的基于石墨烯/二氧化鈦/鉑-鈀納米復(fù)合材料的膽固醇生物傳感器用于食品中膽固醇的定量檢測。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。