技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于化學(xué)分析檢測領(lǐng)域，其是一種操作相對簡便、毒性小、成本低、準確性高、靈敏度高的定量檢測污泥中含硫氨基酸的方法。
背景技術(shù)：
：：近年來，污水處理廠引發(fā)的惡臭問題越來越引起人們的重視。其中，含硫物質(zhì)在導(dǎo)致惡臭的產(chǎn)生中起到重要作用。在污水處理廠中，厭氧消化過程中所產(chǎn)生的揮發(fā)性有機硫（voscs），如甲硫醇（mm）、二甲基硫醚（dms）等，無機硫，如硫化氫（h2s）等已被確定為引起惡臭的最主要物質(zhì)。這類物質(zhì)臭閾值極低，且其產(chǎn)生的惡臭非常嚴重，即使微量的vocs和h2s也能對惡臭污染產(chǎn)生極大的貢獻。研究表明，在市政污泥的厭氧消化階段，形成voscs的前體物質(zhì)主要為半胱氨酸（cys）和甲硫氨酸（met）。在厭氧條件下，這些含硫的前體物質(zhì)經(jīng)過一系列機制，如，生物還原、水解、甲基化、金屬催化氧化等轉(zhuǎn)化為voscs和h2s。met會產(chǎn)生mm，mm經(jīng)過兩條途徑轉(zhuǎn)化為h2s：其一，不經(jīng)dms過程直接由mm轉(zhuǎn)化為h2s；其二，先由mm氧化為dms，dms再通過產(chǎn)甲烷菌作用產(chǎn)生h2s。而cys不參與中間voscs的形成，直接經(jīng)微生物作用產(chǎn)生h2s。因此，明確硫元素在厭氧消化過程中的物質(zhì)流，為后續(xù)控制惡臭過程提供理論依據(jù)，必需建立適當(dāng)?shù)姆椒ǘ繖z測污泥中的cys和met。含硫氨基酸的檢測主要有液相色譜法、離子色譜法、氣相色譜法、電化學(xué)法、毛細管電泳法等。其中，高效液相色譜法和離子色譜法較為常用。其中，由離子色譜原理制造的氨基酸分析儀是目前國家標準中規(guī)定使用的分析儀器。但由于氨基酸分析儀專屬性強、檢測成本高，故使用的普及率較低。目前針對含硫氨基酸的檢測主要集中于食品及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，針對復(fù)雜的環(huán)境樣品，如污水和污泥中含硫氨基酸的檢測尚未見報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：：本發(fā)明是為了彌補當(dāng)前污泥物料中含硫氨基酸檢測的空缺和技術(shù)問題，提供一種切實可行、檢測成本低、靈敏度高、準確性高、毒性小的定量檢測復(fù)雜環(huán)境樣品污泥中含硫氨基酸的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：定量測定污泥中含硫氨基酸的方法，按如下步驟進行：a.將污泥樣品于冷干機冷干，用球磨機對冷干樣品進行研磨，而后過篩，低溫保存；b.將含半胱氨酸、蛋氨酸的污泥樣品經(jīng)過甲酸氧化，制備性質(zhì)穩(wěn)定的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜；c.用濃鹽酸對污泥氧化液進行水解，水解液經(jīng)3kd濾膜超濾，去除污泥中大分子雜質(zhì)，純化氨基酸；d.將污泥中的氨基酸與衍生劑鄰苯二甲醛進行衍生反應(yīng)，生成有熒光吸收的衍生產(chǎn)物；e.將衍生產(chǎn)物用高效液相色譜進行分析，定量檢測污泥中的含硫氨基酸。所述步驟a是取污泥40ml于50ml離心管于-20℃冷凍；將冷凍污泥置于冷干機中，在-40℃條件下冷干3天；將污泥冷干樣用球磨機于4500rmp條件下粉碎10min;將粉碎后的污泥樣品過200目篩，于-50℃冰箱保存。所述步驟b是取a步驟的污泥樣品0.0500g于水解管中，加入過甲酸1.5ml，于50℃條件下，水浴氧化30min；向污泥氧化液中加0.4ml偏重亞硫酸鈉溶液，終止氧化反應(yīng)；所述過甲酸溶液是將30%的過氧化氫溶液與88%的甲酸溶液按照體積比為1：9混合，在常溫下放置1h制得，此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配；所述偏重亞硫酸鈉溶液是將33.6g偏重亞硫酸鈉加水定容至100ml制得。所述步驟c是向b步驟制得的污泥氧化液中加入5.1ml濃度為8.2mol/l的鹽酸溶液；向水解管中通氮氣30s，密封水解管，將水解管置于105℃烘箱中水解22h；取出水解管，置于室溫冷卻，開啟水解管，將水解管內(nèi)污泥水解液移入茄形旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，并用1ml濃度為0.1mol/l鹽酸洗出殘留水解液，反復(fù)三次，將污泥水解液于40℃、-10bar條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；用0.1mol/l鹽酸將茄形旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中的氨基酸樣品溶出，并定容至10ml；取定容后的水解液400μl于3kd超濾離心管中，于13805g離心力下離心40min制得污泥氨基酸超濾液；所述8.2mol/l鹽酸溶液是將純鹽酸683ml定容至1000ml制得；所述0.1mol/l鹽酸溶液是將純鹽酸8.3ml定容至1000ml制得。所述步驟d是將c步驟所得的污泥氨基酸超濾液200μl加入內(nèi)插管中，依據(jù)如下程序步驟進行在線衍生：進樣針吸取2.5μl且ph為10.2的硼酸緩沖鹽溶液，吸取0.5μl污泥氨基酸超濾液，吸取0.5μl鄰苯二甲醛衍生劑，吸取3μl空氣以最大速率混合6次；吸取32μl且ph為6.5的二水合磷酸二氫鈉稀釋液，吸取空氣18μl以最大速率混合2次，完成氨基酸衍生過程；所述ph為10.2的硼酸緩沖鹽溶液，稱取2.50g硼酸，加水溶解，于100ml容量瓶定容得0.4mol/l硼酸溶液，用10mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)ph至10.2；所述10mol/l氫氧化鈉溶液，稱取40g氫氧化鈉，加水溶解，于100ml容量瓶定容制得；所述鄰苯二甲醛溶液，稱取80.0mg鄰苯二甲醛，加7ml硼酸緩沖液溶解，再加1ml乙腈、125μl巰基丙酸混勻；所述ph為6.5的二水合磷酸二氫鈉稀釋液，稱取2.6408g磷酸二氫鉀，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氫氧化鈉調(diào)ph為6.5，再加4ml磷酸。所述步驟e的色譜流相及梯度是：動相a、流動相b、流速、洗脫梯度、激發(fā)波長ex=340nm、發(fā)射波長em=460nm；所述流動相a是將甲醇、乙腈、水按照體積比為45:45:10混合制得，使用前超聲脫氣30min；所述流動相b是稱取2.6408g磷酸二氫鉀，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氫氧化鈉調(diào)ph為6.5制得，使用前過0.22μm濾膜過濾，超聲脫氣30min；所述流動相梯度如下表所示：時間（min）流動相a流動相b流速（ml/min）0.000.0100.021.900.0100.0123.1040.060.0123.60100.00.0227.30100.00.0228.200.0100.0229.000.0100.02本發(fā)明是將復(fù)雜環(huán)境樣品污泥冷干、過篩保存，檢測時將污泥樣品中的半胱氨酸或胱氨酸、蛋氨酸經(jīng)過甲酸氧化，將其轉(zhuǎn)化為磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，再經(jīng)酸水解將氧化產(chǎn)物磺基丙氨酸和蛋氨酸砜從多肽和蛋白質(zhì)中釋放出來，污泥水解樣品經(jīng)超濾除雜提純，純化樣品與鄰苯二甲醛進行在線衍生反應(yīng)，衍生產(chǎn)物經(jīng)色譜柱進行高效液相色譜分析。無需使用價格昂貴的氨基酸分析儀，毒性小，切實可行、檢測成本低、靈敏度高、準確性高。附圖說明：圖1本發(fā)明標準樣品分析圖譜。圖2本發(fā)明污泥樣品分突圖譜。具體實施方式：下面結(jié)合附圖說明本發(fā)明的具體實施方式：1.儀器設(shè)備及試劑安捷倫1260g1321bfld熒光檢測器，安捷倫1260g1311c四元泵，安捷倫1260g1329b標準自動進樣器，安捷倫1260g1316a柱溫箱，安捷倫zorbaxeclipseaaa3.5μm×4.6mm×150mm，烘箱，水解管，電熱恒溫水浴鍋，3kmillipore超濾離心管，高速離心機，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，樣品瓶，內(nèi)插管。半胱氨酸標準品、蛋氨酸標準品、磺基丙氨酸標準品及蛋氨酸砜標準品（上海安譜實驗科技股份有限公司）、脫水污泥（上海嘉定污水處理廠）、30%過氧化氫、88%過甲酸、鹽酸（優(yōu)級純）、偏重亞硫酸鈉、硼酸、磷酸（hplc級）、鄰苯二甲醛（hplc級）、巰基丙酸（hplc級）、二水合磷酸二氫鈉（hplc級）等（除特殊說明外，其它均為分析純）。2.檢測方法2.1方法原理污泥中的胱氨酸和半胱氨酸、蛋氨酸經(jīng)過甲酸氧化后，分別生成性質(zhì)穩(wěn)定的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，氧化產(chǎn)物在高溫酸水解下從蛋白質(zhì)和多肽中釋放出來，與鄰苯二甲醛發(fā)生衍生反應(yīng)生成帶熒光特性的衍生產(chǎn)物，衍生產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜進行定量分析。氧化反應(yīng)及衍生反應(yīng)方程式如下：氧化反應(yīng)方程式：衍生方程式：上述反應(yīng)方程式表明過甲酸可將胱氨酸的二硫鍵、半胱氨酸的巰基、蛋氨酸的硫醚鍵中的硫氧化為硫酰基，而不破壞氨基，鄰苯二甲醛在巰基丙酸的參與下與氨基發(fā)生衍生反應(yīng)，生成具有熒光吸收的衍生產(chǎn)物。2.2方法步驟按如下步驟進行：a.取污泥40ml于50ml離心管于-20℃冷凍；將冷凍污泥置于冷干機中，在-40℃條件下冷干3天；將污泥冷干樣用球磨機于4500rmp條件下粉碎10min;將粉碎后的污泥樣品過200目篩，于-50℃冰箱保存；b.取上述a步驟的污泥樣品0.0500g于水解管中，加入過甲酸1.5ml，于50℃條件下，水浴氧化30min；向污泥氧化液中加0.4ml偏重亞硫酸鈉溶液，終止氧化反應(yīng)；所述過甲酸溶液是將30%的過氧化氫溶液與88%的甲酸溶液按照體積比為1：9混合，在常溫下放置1h制得，此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配；所述偏重亞硫酸鈉溶液是將33.6g偏重亞硫酸鈉加水定容至100ml制得；c.向上述b步驟制得的污泥氧化液中加入5.1ml濃度為8.2mol/l的鹽酸溶液；向水解管中通氮氣30s，密封水解管，將水解管置于105℃烘箱中水解22h；取出水解管，置于室溫冷卻，開啟水解管，將水解管內(nèi)污泥水解液移入茄形旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，并用1ml濃度為0.1mol/l鹽酸洗出殘留水解液，反復(fù)三次，將污泥水解液于40℃、-10bar條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；用0.1mol/l鹽酸將茄形旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中的氨基酸樣品溶出，并定容至10ml。取定容后的水解液400μl于3kd超濾離心管中，于13805g離心力下離心40min制得污泥氨基酸超濾液；所述8.2mol/l鹽酸溶液是將純鹽酸683ml定容至1000ml制得；所述0.1mol/l鹽酸溶液是將純鹽酸8.3ml定容至1000ml制得；d.將上述c步驟所得的污泥氨基酸超濾液200μl加入內(nèi)插管中，依據(jù)如下程序步驟進行在線衍生：進樣針吸取2.5μl且ph為10.2的硼酸緩沖鹽溶液，吸取0.5μl污泥氨基酸超濾液，吸取0.5μl鄰苯二甲醛衍生劑，吸取3μl空氣以最大速率混合6次；吸取32μl且ph為6.5的二水合磷酸二氫鈉稀釋液，吸取空氣18μl以最大速率混合2次，完成氨基酸衍生過程；所述ph為10.2的硼酸緩沖鹽溶液，稱取2.50g硼酸，加水溶解，于100ml容量瓶定容得0.4mol/l硼酸溶液，用10mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)ph至10.2；所述10mol/l氫氧化鈉溶液，稱取40g氫氧化鈉，加水溶解，于100ml容量瓶定容制得；所述鄰苯二甲醛溶液，稱取80.0mg鄰苯二甲醛，加7ml硼酸緩沖液溶解，再加1ml乙腈、125μl巰基丙酸混勻；所述ph為6.5的二水合磷酸二氫鈉稀釋液，稱取2.6408g磷酸二氫鉀，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氫氧化鈉調(diào)ph為6.5，再加4ml磷酸；e.將衍生后的樣品進行高效液相色譜分析，色譜流相及梯度是：動相a、流動相b、流速、洗脫梯度、激發(fā)波長ex=340nm、發(fā)射波長em=460nm；所述流動相a是將甲醇、乙腈、水按照體積比為45:45:10混合制得，使用前超聲脫氣30min；所述流動相b是稱取2.6408g磷酸二氫鉀，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氫氧化鈉調(diào)ph為6.5制得，使用前過0.22μm濾膜過濾，超聲脫氣30min；所述流動相梯度如表1所示：表13.檢測結(jié)果3.1磺基丙氨酸和蛋氨酸砜標準品分析檢測結(jié)果準確稱取磺基丙氨酸標準品42.3mg（濃度25nmol/μl）、蛋氨酸砜標準品45.3mg（濃度25nmol/μl），溶于水中，定容至10ml，制備25nmol/μl的標準儲備液。使用時，將儲備液稀釋成系列梯度50、100、200、300、400、500pmol/μl，按2.2方法中d步驟、e步驟進行處理，繪制標準曲線?；腔彼岷偷鞍彼犴繕藴势罚?00pmol/μl）分離譜圖如圖1,圖中1為磺基丙氨酸；2為蛋氨酸砜；標準品標準曲線回歸方程、線性范圍、檢出限(三倍信噪比)及定量限（十倍信噪比）見表2：表23.2污泥樣品分析結(jié)果污泥樣品分析圖譜見圖2，圖中1為磺基丙氨酸（胱氨酸及半胱氨酸氧化產(chǎn)物）；2為蛋氨酸砜（蛋氨酸氧化產(chǎn)物）。污泥樣品中，磺基丙氨酸、蛋氨酸砜與周圍氨基酸分離效果好，其與左右氨基的分離度分別為（-）/13.1、（2.19）/5.6，均符合藥典中分離度大于1.5的規(guī)定。同一污泥樣品，一分為六，采用2.2所述方法連續(xù)處理6次，污泥中胱氨酸和蛋氨酸含量結(jié)果見表3：表3在同一污泥樣品，加入半胱氨酸和蛋氨酸標準品，按2.2方法處理分析樣品，計算加標回收率（n=3）。加標回收率結(jié)果見表4：表4本發(fā)明是將復(fù)雜環(huán)境樣品污泥冷干、過篩保存，檢測時將污泥樣品中的半胱氨酸或胱氨酸、蛋氨酸經(jīng)過甲酸氧化，將其轉(zhuǎn)化為磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，再經(jīng)酸水解將氧化產(chǎn)物磺基丙氨酸和蛋氨酸砜從多肽和蛋白質(zhì)中釋放出來，污泥水解樣品經(jīng)超濾除雜提純，純化樣品與鄰苯二甲醛進行在線衍生反應(yīng)，衍生產(chǎn)物經(jīng)色譜柱進行高效液相色譜分析。無需使用價格昂貴的氨基酸分析儀，毒性小，切實可行、檢測成本低、靈敏度高、準確性高。上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12