本發(fā)明屬于生物光子學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種密封重水方法及檢測多光子成像中多光子信號(hào)強(qiáng)度的方法。

背景技術(shù)：

多光子顯微成像是一種基于非線性光學(xué)效應(yīng)的成像技術(shù)，它在生物醫(yī)學(xué)方面有著十分廣泛的應(yīng)用。多光子成像有兩個(gè)主要的研究方向，一是保證不損傷生物組織的前提下提高成像深度，二是擴(kuò)展成像模態(tài)從而得到更多樣品信息。這兩個(gè)方向的研究都得益于激光的發(fā)展。近來，已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)展示了采用1700nm波段高能量孤子激光作為激發(fā)光源，通過多光子成像技術(shù)可以對活體小鼠的深層腦部組織進(jìn)行成像，1700nm波段激發(fā)的多光子成像是一種能夠顯著提高組織成像深度和擴(kuò)展多光子成像模態(tài)的顯微成像技術(shù)。此外，在1700nm波段，二次諧波成像，三光子熒光成像，三次諧波成像，四光子熒光成像[8]，四次諧波成像以及五光子熒光成像都在實(shí)驗(yàn)上已有演示。因此，1700nm波段多光子成像極具應(yīng)用前景。

多光子成像中，一個(gè)必不可少的光學(xué)元件是高數(shù)值孔徑的浸潤物鏡。實(shí)驗(yàn)中，浸潤介質(zhì)通常是用來匹配樣品組織的折射率以減少成像過程中產(chǎn)生的像差。在對小鼠腦部成像時(shí)，一般使用純水浸潤，而在對皮膚組織成像時(shí)一般使用油浸潤。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，盡管成像過程中，浸潤介質(zhì)的厚度很薄(毫米量級)，但它對1700nm波段的吸收是不可忽視的。鑒于產(chǎn)生信號(hào)對激發(fā)功率的非線性依賴關(guān)系，它會(huì)導(dǎo)致多光子信號(hào)的大幅衰減。所以我們提出了以重水代替純水浸潤的方法，并且在使用油浸潤時(shí)會(huì)謹(jǐn)慎選擇激光波長。

目前，在1700nm波段的小鼠腦組織深層成像只能通過重水浸潤得到。盡管重水的吸收系數(shù)與水相比小了1個(gè)數(shù)量級[5]，但由于重水的吸水性使得重水在實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)從周圍環(huán)境吸收水蒸汽，使得它的透過率會(huì)隨時(shí)間而降低，從而導(dǎo)致到達(dá)樣品上的激發(fā)光和多光子信號(hào)強(qiáng)度會(huì)隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間增加而衰減。這十分不利于基于熒光強(qiáng)度探測的時(shí)間動(dòng)力學(xué)測量，比如熒光分子的漂白特性研究和生物樣品中熒光分子的標(biāo)記和清除檢測。

為了避免重水的吸水性，最容易想到的方法就是在實(shí)驗(yàn)中不斷更換重水。然而，這個(gè)方法有幾個(gè)缺點(diǎn)：(1)在更換新的重水之前，必須將先前被水蒸汽污染過的重水小心、完全地移除，保證沒有殘留。(2)在持續(xù)時(shí)間較長的成像過程中，比如小鼠大腦的多光子成像(可能會(huì)持續(xù)5個(gè)小時(shí))需要在實(shí)驗(yàn)中更換將近9次重水，因?yàn)槿庾有盘?hào)經(jīng)過35分鐘后強(qiáng)度會(huì)衰減為原來的一半。盡管如此，基于熒光強(qiáng)度的時(shí)間動(dòng)力學(xué)測量也不能采用這種方法，因?yàn)橹厮账羝麑?dǎo)致信號(hào)的衰減會(huì)疊加到熒光染料的衰減曲線里，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生誤差。

那么，需要提供一種合適的重水密封方法，從而避免因重水的吸水性而導(dǎo)致多光子成像過程中產(chǎn)生的多光子信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間的增加而衰減。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種密封重水方法及檢測多光子成像中多光子信號(hào)強(qiáng)度的方法，旨在在多光子成像中利用石蠟油密封重水，并通過檢測多光子信號(hào)強(qiáng)度是否發(fā)生變化來判斷用石蠟油密封重水的效果。

本發(fā)明提供了一種密封重水方法，在重水表面滴石蠟油，使其覆蓋在所述重水表面。

進(jìn)一步地，所述石蠟油的用量和所述重水的用量相等。

本發(fā)明還提供了一種檢測多光子成像中多光子信號(hào)強(qiáng)度的方法，所述方法包括：

在裝有待測樣品的玻片上滴重水，所述裝有待測樣品的玻片置于多光子成像系統(tǒng)中；

滴石蠟油在所述重水上，使其覆蓋在所述重水表面；

所述多光子成像系統(tǒng)中產(chǎn)生的激發(fā)光照射到待測樣品上，產(chǎn)生多光子信號(hào)，利用所述多光子成像系統(tǒng)中的帶通濾光片濾除特定波長的光信號(hào)，使所述待測樣品產(chǎn)生的多光子信號(hào)透過，并利用所述多光子成像系統(tǒng)中的探測器收集所述多光子信號(hào)；

基于收集到的所述多光子信號(hào)檢測所述多光子信號(hào)強(qiáng)度，并判斷所述多光子信號(hào)強(qiáng)度的變化是否在閾值范圍內(nèi)。

進(jìn)一步地，所述裝有待測樣品的玻片上固定有橡膠環(huán)，所述重水滴在所述橡膠環(huán)的環(huán)內(nèi)，防止所述重水?dāng)U散；

所述橡膠環(huán)的外徑為22mm，內(nèi)徑為15.8mm，厚度為3.1mm。

進(jìn)一步地，所述待測樣品為熒光染料，所述多光子信號(hào)為三光子熒光信號(hào)；所述帶通濾光片為第一帶通濾光片，用于濾除特定波長的光信號(hào)，使所述熒光染料產(chǎn)生的三光子熒光信號(hào)透過；所述探測器為鎵砷磷探測器，用于收集所述三光子熒光信號(hào)。

進(jìn)一步地，所述待測樣品為小鼠腦部白質(zhì)，所述多光子信號(hào)為三次諧波信號(hào)；所述帶通濾光片為第二帶通濾光片，用于濾除特定波長的光信號(hào)，使所述小鼠腦部白質(zhì)產(chǎn)生的三次諧波信號(hào)透過；所述探測器為砷化鎵探測器，用于收集所述三次諧波信號(hào)。

進(jìn)一步地，所述多光子成像系統(tǒng)沿光路方向包括：飛秒激光器、光子晶體棒、長波通濾光片、多光子顯微鏡，所述待測樣品置于所述多光子顯微鏡下；

所述飛秒激光器用于產(chǎn)生1550nm飛秒激光脈沖，所述光子晶體棒用于根據(jù)耦合入的所述飛秒激光脈沖產(chǎn)生1665nm孤子脈沖，所述長波通濾光片用于濾出1665nm孤子脈沖，并以所述1665nm孤子脈沖作為激發(fā)光，所述多光子顯微鏡用于使所述激發(fā)光照射到所述待測樣品上，并對所述待測樣品進(jìn)行成像。

進(jìn)一步地，所述多光子顯微鏡沿光路方向包括：掃描振鏡、掃描透鏡、套筒透鏡以及水浸物鏡。

進(jìn)一步地，所述多光子成像系統(tǒng)還包括第一透鏡、第二透鏡和反射鏡，所述第一透鏡設(shè)置于所述飛秒激光器和所述光子晶體棒之間，用于聚焦所述飛秒激光器產(chǎn)生的1550nm飛秒激光脈沖，并耦合入所述光子晶體棒；所述第二透鏡和所述反射鏡設(shè)置于所述光子晶體棒和所述長波通濾光片之間，所述第二透鏡用于準(zhǔn)直所述光子晶體棒產(chǎn)生的1665nm孤子脈沖，所述反射鏡用于將準(zhǔn)直后的1665nm孤子脈沖反射入所述長波通濾光片。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果在于：本發(fā)明提供了一種密封重水方法及檢測多光子成像中多光子信號(hào)強(qiáng)度的方法，在裝有待測樣品的玻片上滴重水，并用石蠟油覆蓋在所述重水上，利用多光子成像系統(tǒng)中產(chǎn)生的激發(fā)光照射到待測樣品上，從而產(chǎn)生多光子信號(hào)，利用探測器收集所述多光子信號(hào)，并基于收集到的所述多光子信號(hào)檢測所述多光子信號(hào)強(qiáng)度；通過判斷所述多光子信號(hào)強(qiáng)度的變化是否在閾值范圍內(nèi)，來判斷石蠟油密封重水的效果；本發(fā)明提供的檢測多光子成像中多光子信號(hào)強(qiáng)度的方法，因?yàn)槭炗蛯χ厮泻芎玫拿芊庑Ч?，重水在檢測過程中沒有吸收水蒸汽，從而使產(chǎn)生的多光子信號(hào)強(qiáng)度沒有隨著時(shí)間的增加而發(fā)生衰減；另外，也有利于基于熒光強(qiáng)度探測的時(shí)間動(dòng)力學(xué)測量。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的固定有橡膠環(huán)的玻片的示意圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的一種檢測多光子成像中多光子信號(hào)強(qiáng)度的方法；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的多光子成像系統(tǒng)中的硬件結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的隨時(shí)間衰減的sr101三光子熒光信號(hào)(左列)和小鼠腦部白質(zhì)的三次諧波信號(hào)(右列)的示意圖；；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的沒有密封重水的三光子熒光信號(hào)(紅圈)和三次諧波信號(hào)(綠色方塊)隨時(shí)間衰減的變化曲線；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的隨時(shí)間衰減的熒光染料sr101三光子熒光信號(hào)(左列)和小鼠腦部白質(zhì)的三次諧波信號(hào)(右列)的示意圖；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的歸一化后的三光子熒光信號(hào)隨時(shí)間變化的關(guān)系。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明采用了一種簡單并且非常有效的方法將重水與水蒸汽隔絕，即用石蠟油將重水密封。石蠟油具有很好的疏水性，常被用來作為各種器件甚至包括食物在內(nèi)的密封介質(zhì)。我們通過三光子熒光成像和三次諧波成像檢驗(yàn)了該技術(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)過5個(gè)小時(shí)，三光子熒光信號(hào)和三次諧波信號(hào)強(qiáng)度都沒有產(chǎn)生衰減，從而可以證明用石蠟油對重水有很好的密封效果。

下面介紹本發(fā)明提供的一種密封重水方法，在重水表面滴石蠟油，使其覆蓋在所述重水表面。

具體地，在密封重水時(shí)，我們將石蠟油迅速加到重水上以隔絕周圍環(huán)境。石蠟油的濃度為0.85g/ml，比重水的濃度(1.11g/ml)小，這意味著石蠟油能夠覆蓋在重水的上面。石蠟油的疏水性和低密度使它成為將重水與周圍環(huán)境隔絕開的最好選擇。整個(gè)加入重水和石蠟油的過程最好在較短的時(shí)間內(nèi)完成。

具體地，本發(fā)明實(shí)施例所用的石蠟油的用量和重水的用量相等。

下面再介紹本發(fā)明提供的一種檢測多光子成像中多光子信號(hào)強(qiáng)度的方法，如圖2所示，所述方法包括：

步驟s1，在裝有待測樣品的玻片上滴重水，所述裝有待測樣品的玻片置于多光子成像系統(tǒng)中；

具體地，如圖1所示，所述待測樣品(圖1所用的待測樣品為熒光染料)裝在載玻片的左右兩側(cè)，并用蓋玻片蓋住，在左側(cè)蓋玻片上用牙科水泥固定一個(gè)橡膠環(huán)，所述重水滴在所述橡膠環(huán)的環(huán)內(nèi)，以便于把所述重水圈在所述橡膠環(huán)內(nèi)，防止所述重水?dāng)U散，從而更好的利用石蠟油密封重水；所述橡膠環(huán)的外徑為22mm，內(nèi)徑為15.8mm，厚度為3.1mm。

具體地，如圖3所示，所述多光子成像系統(tǒng)沿光路方向包括：飛秒激光器1、第一透鏡2、光子晶體棒3、第二透鏡4、反射鏡5、帶通濾光片6、多光子顯微鏡7，所述待測樣品8置于所述多光子顯微鏡下。

具體地，所述飛秒激光器1(flcpa-02cszu,calmar)用于產(chǎn)生1550nm波長的飛秒激光脈沖，所述第一透鏡2用于聚焦所述飛秒激光器1產(chǎn)生的1550nm飛秒激光脈沖，并耦合入所述光子晶體棒3(sc-1500/100-si-rod,nktphotonics)，通過孤子自頻移效應(yīng)在光子晶體棒3中產(chǎn)生1665nm孤子脈沖，作為孤子光源；所述第二透鏡4用于準(zhǔn)直所述光子晶體棒3產(chǎn)生的1665nm孤子脈沖，所述反射鏡5用于將準(zhǔn)直后的1665nm孤子脈沖反射入所述帶通濾光片6；所述帶通濾光片6用于去除殘留的1550nm脈沖，保證只有1665nm的孤子脈沖作為激發(fā)光進(jìn)入多光子顯微鏡7；所述多光子顯微鏡7用于使所述激發(fā)光照射到所述待測樣品8上，并對所述待測樣品8進(jìn)行成像。

具體地，所述多光子顯微鏡7沿光路方向包括：掃描振鏡71、掃描透鏡72、套筒透鏡73以及水浸物鏡74；所述水浸物鏡74為一個(gè)工作距離為2mm的水浸物鏡(xlpln25xwmp2,olympus)。

步驟s2，滴石蠟油在所述重水上，使其覆蓋在所述重水表面；

步驟s3，所述多光子成像系統(tǒng)中產(chǎn)生的激發(fā)光照射到待測樣品上，產(chǎn)生多光子信號(hào)，利用所述多光子成像系統(tǒng)中的帶通濾光片濾除特定波長的光信號(hào)，使所述待測樣品產(chǎn)生的多光子信號(hào)透過，并利用所述多光子成像系統(tǒng)中的探測器收集所述多光子信號(hào)；

具體地，所述待測樣品8為熒光染料(sulforhodamine101，sr101)，所述多光子信號(hào)為三光子熒光信號(hào)；所述帶通濾光片6為第一帶通濾光片(630/92)，用于濾除特定波長的光信號(hào)，使所述熒光染料產(chǎn)生的三光子熒光信號(hào)透過；所述探測器為鎵砷磷探測器(h7422p-40,hamamatsu)，用于收集所述三光子熒光信號(hào)。

具體地，所述待測樣品8為小鼠腦部白質(zhì)，所述多光子信號(hào)為三次諧波信號(hào)；所述帶通濾光片6為第二帶通濾光片(558/20)，用于濾除特定波長的光信號(hào)，使所述小鼠腦部白質(zhì)產(chǎn)生的三次諧波信號(hào)透過；所述探測器為砷化鎵探測器，用于收集所述三次諧波信號(hào)。

步驟s4，基于收集到的所述多光子信號(hào)檢測所述多光子信號(hào)強(qiáng)度，并判斷所述多光子信號(hào)強(qiáng)度的變化是否在閾值范圍內(nèi)。

具體地，所述三光子熒光信號(hào)和所述三次諧波信號(hào)的采集和處理分別使用了軟件scanimage(vidriotechnologies)和imagej(nih)。

具體地，所述閾值范圍為一個(gè)較小的數(shù)值范圍，若所述多光子信號(hào)強(qiáng)度的變化在該閾值范圍內(nèi)，則可認(rèn)為檢測過程中，多光子信號(hào)強(qiáng)度幾乎沒有發(fā)生變化，即代表用石蠟油對重水有很好的密封效果。

下面分別舉在多光子成像時(shí)，重水密封和不密封條件下多光子信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間增加是否發(fā)生變化的實(shí)施例，來進(jìn)一步論證石蠟油對重水的密封效果。

我們通過將重水密封和將重水暴露在外部環(huán)境中兩種方式對同種樣品進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)對比，在每種方式下，樣品分別采用了熒光染料(sr101)和小鼠腦部白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

首先，成像過程中，我們在物鏡前浸潤了0.4ml未經(jīng)密封的重水，在沒有密封重水的情況下闡明三光子信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間衰減問題。在物鏡前的激光功率保持一定時(shí)，sr101的三光子熒光信號(hào)(圖4，左列)和小鼠腦部切片的三次諧波信號(hào)(圖4，右列)的強(qiáng)度會(huì)由于重水吸收水而隨時(shí)間衰減，圖4中的兩種信號(hào)都進(jìn)行歸一化處理，最大值均為65535。標(biāo)尺：50μm。當(dāng)然，這有可能是光漂白所導(dǎo)致的(尤其是對sr101)。為了排除這個(gè)可能性，我們將已經(jīng)吸收過空氣中水蒸汽的重水完全清除并替換上新的重水，再次觀察多光子信號(hào)，發(fā)現(xiàn)此時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度回到了初始值。成像期間，我們始終用scanimage控制快門使得在采集三光子熒光信號(hào)和三次諧波信號(hào)時(shí)才有激光照射到樣品上，避免光漂白現(xiàn)象。

其次，為了定量分析重水吸收水蒸汽的速度，我們測量了多光子信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間變化的關(guān)系，如圖5所示。盡管成像所使用的樣品以及成像方式并不相同，三光子熒光信號(hào)(圖5中的圈圈)和三次諧波信號(hào)(圖5中的方塊)都展現(xiàn)了相同的衰減特性，圖中的兩種信號(hào)進(jìn)行了歸一化處理，最大值均為65535。標(biāo)尺：50μm。35分鐘后，三光子熒光信號(hào)和三次諧波信號(hào)強(qiáng)度都降低為它們各自的初始值的一半(t＝0)，隨著時(shí)間的增加，信號(hào)強(qiáng)度變得更弱，一個(gè)小時(shí)后，三光子熒光信號(hào)和三次諧波信號(hào)強(qiáng)度降低了約65％。

接下來，我們采用密封重水的方法進(jìn)行三光子成像和三次諧波成像，在密封重水時(shí)，我們首先用牙科水泥將一個(gè)橡膠環(huán)(外徑22毫米，內(nèi)徑15.8毫米，厚度3.1毫米)固定在玻片上，如圖1。橡膠環(huán)15.8毫米的內(nèi)徑保證了物鏡在大范圍移動(dòng)的時(shí)候不會(huì)撞到橡膠環(huán)，對觀察生物組織十分有利，比如觀察小鼠腦部白質(zhì)的三次諧波信號(hào)。成像過程中，我們在物鏡前浸潤0.4ml經(jīng)過密封的重水，在密封重水時(shí)，我們將0.4ml的石蠟油迅速加到重水上以隔絕周圍環(huán)境。石蠟油的濃度為0.85g/ml，比重水的濃度(1.11g/ml)小，這意味著石蠟油能夠覆蓋在重水的上面，石蠟油的疏水性和低密度使它成為將重水與周圍環(huán)境隔絕開的最好選擇，整個(gè)加入重水和石蠟油的過程可以在30秒內(nèi)完成。實(shí)驗(yàn)過程中，室內(nèi)溫度和相對濕度分別在19.8～20.1℃和47～51％的范圍內(nèi)。這次成像時(shí)間為5小時(shí)，如圖6所示。與未密封重水時(shí)相比，三光子熒光信號(hào)(圖6，左列)和三次諧波信號(hào)(圖6，右列)都沒有觀察到衰減，圖中的兩種信號(hào)都進(jìn)行歸一化處理，最大值均為65535。標(biāo)尺：50μm；這證明了信號(hào)強(qiáng)度的衰減不是由于光漂白導(dǎo)致，而是由于重水吸收水后透過率下降導(dǎo)致的，同時(shí)證明了石蠟油密封重水的有效性。

最后，我們分析了密封重水后熒光染料sr101的三光子熒光信號(hào)隨時(shí)間變化的關(guān)系，如圖7所示，采樣間隔為10分鐘，三光子熒光信號(hào)經(jīng)歸一化處理，并且信號(hào)歸一化的平均值為1，信號(hào)平均強(qiáng)度的最大波動(dòng)為6.4％，均方根值的起伏為1.75％，這個(gè)抖動(dòng)是由孤子激光光源的功率抖動(dòng)所導(dǎo)致的。從圖中可以看到，重水被石蠟油很好的密封，與周圍環(huán)境隔絕。在5小時(shí)的實(shí)驗(yàn)過程中，重水對激發(fā)光的透過率沒有產(chǎn)生明顯的衰減。盡管測量時(shí)間為5小時(shí)，但這對更長時(shí)間的實(shí)驗(yàn)過程依然適用，原因?yàn)椋?1)，由于石蠟油的疏水性，水蒸汽不會(huì)被重水吸收；(2)，同時(shí)，重水也不會(huì)穿透石蠟油揮發(fā)到周圍環(huán)境中。

本發(fā)明提出了一種隔絕重水與周圍環(huán)境的方法，即用石蠟油密封重水；并在1700nm波段探測熒光染料三光子熒光信號(hào)和生物組織三次諧波信號(hào)的實(shí)驗(yàn)中展示了這種技術(shù)，在長達(dá)5個(gè)小時(shí)的成像過程中，被密封的浸潤介質(zhì)沒有受到周圍環(huán)境中水蒸汽的影響，所探測的三光子熒光信號(hào)和三次諧波信號(hào)強(qiáng)度均保持不變，說明石蠟油對重水有很好的密封性。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。