本發(fā)明屬于藥物分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種同時(shí)測(cè)定血漿中六種酪氨酸激酶抑制劑濃度的方法。
背景技術(shù)：
：一直以來(lái)，癌癥因其居高不下的死亡率而備受關(guān)注。目前研究發(fā)現(xiàn)癌癥是一種多因素誘發(fā)的疾病，包括基因組紊亂、飲食不規(guī)律、環(huán)境污染、輻射等等。與正常的細(xì)胞相比較，癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的復(fù)制能力來(lái)對(duì)抗細(xì)胞的凋亡。臨床上主要使用外科手術(shù)、放射治療、化學(xué)藥物治療及靶向藥物治療等手段進(jìn)行治療，其中手術(shù)后的化學(xué)藥物治療是常用方法之一。大多數(shù)化學(xué)藥物特異性差，通常導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。因此，具有高度特異性的靶向藥物逐漸進(jìn)入臨床。靶向藥物通常能夠與癌癥細(xì)胞中的特殊分子進(jìn)行特異性結(jié)合，從而抑制癌癥細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移?；谏鲜鎏卣鳎》肿蛹っ敢种苿┇@得廣泛關(guān)注，其中酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinaseinhibitors，tkis)最為常見(jiàn)，例如：表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑(epidermalgrowthfactorreceptor-tkis，egfr-tkis)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑(vascularendothelialgrowthfactorreceptor-2-tkis，vegfr-2-tkis)，ros原癌基因1/間變性淋巴瘤激酶抑制劑(rosproto-oncogene1/anaplasticlymphomakinase-tkis，ros1/alk-tkis)等。目前，酪氨酸激酶抑制劑阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、?？颂婺岷屠撂婺岜粡V泛應(yīng)用于各類癌癥的治療，并且取得了良好的治療效果。同時(shí)，臨床工作者和研究人員依舊密切關(guān)注用藥安全方面的研究。眾所周知，血藥濃度的個(gè)體化差異通常會(huì)導(dǎo)致療效上的差異，臨床上的個(gè)體化給藥引起廣泛的關(guān)注。因此，用于血藥濃度檢測(cè)的高靈敏度、高選擇性的檢測(cè)方法顯得尤為重要。迄今為止，研究人員利用不同的液相色譜和質(zhì)譜開(kāi)發(fā)了一些方法分別用于上述藥物的血藥濃度檢測(cè)，例如，zheng等人研究開(kāi)發(fā)的lc-ms/ms方法，用于吉非替尼及其主要代謝物的檢測(cè)，靈敏度1ng/ml(參見(jiàn)：zhengn,zhaoc,hexetal.simultaneousdeterminationofgefitinibanditsmajormetabolitesinmouseplasmabyhplc-ms/msanditsapplicationtoapharmacokineticsstudy.j.chromatogr.banalyttechnol.biomed.lifesci.1011,215-222(2016))；lankheet等人建立了hplc-ms/ms方法，用于檢測(cè)血漿中厄洛替尼的濃度，靈敏度5ng/ml(參見(jiàn)：lankheetn,schaakee,rosinghetal.quantitativedeterminationoferlotinibando-desmethylerlotinibinhumanedtaplasmaandlungtumortissue.bioanalysis4(21),2563-2577(2012))；roberts等人建立了定量方法用于檢測(cè)血漿中克唑替尼濃度，靈敏度5ng/ml(參見(jiàn)：robertsm,turnerd,broniscera,stewartc.determinationofcrizotinibinhumanandmouseplasmabyliquidchromatographyelectrosprayionization-tandemmassspectrometry(lc-esi-ms/ms).journalofchromatographyb-analyticaltechnologiesinthebiomedicalandlifesciences.960,151-157(2014))。這些方法在靈敏度、特異性和高通量方面還有待提高。此外，這些方法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一。因此，迫切需要建立一種能夠同時(shí)測(cè)定上述藥物的方法，這樣就不必針對(duì)不同藥物的檢測(cè)需求來(lái)開(kāi)發(fā)不同的方法，可以大幅降低后續(xù)開(kāi)發(fā)成本，也有利于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一，從而為不同檢測(cè)點(diǎn)或?qū)嶒?yàn)室采集的數(shù)據(jù)能夠相互參考或使用提供可能性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)測(cè)定血漿中六種酪氨酸激酶抑制劑濃度的方法，采用hplc-q-orbitrap檢測(cè)方法，并結(jié)合藥物特征性二級(jí)碎片離子分析，同時(shí)對(duì)血漿中阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、?？颂婺岷屠撂婺岬臐舛冗M(jìn)行分析測(cè)定，實(shí)現(xiàn)了對(duì)血漿中上述藥物快速、靈敏、特異分析。一種同時(shí)測(cè)定血漿中六種酪氨酸激酶抑制劑濃度的方法，所述六種酪氨酸激酶抑制劑為阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、?？颂婺岷屠撂婺?，包括以下步驟：(1)取空白血漿，加入藥物的甲醇溶液和內(nèi)標(biāo)伊馬替尼的甲醇水溶液，分別制得各種藥物的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本；采用由體積比為1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚組成的混合溶液萃取所述標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本中藥物；再在高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀上進(jìn)樣分析，記錄色譜圖和質(zhì)譜圖；并在色譜圖中對(duì)藥物及內(nèi)標(biāo)的特征性二級(jí)碎片離子進(jìn)行提取，計(jì)算藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，然后以藥物濃度為橫坐標(biāo)，以藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中，所述藥物是指所述六種酪氨酸激酶抑制劑，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本中各藥物濃度范圍如下：阿帕替尼0.02-10ng/ml，克唑替尼0.10-20.0ng/ml，厄洛替尼0.05-10.0ng/ml，吉非替尼0.05-10.0ng/ml，?？颂婺?.05-10.0ng/ml，拉帕替尼2.0-200.0ng/ml；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本中內(nèi)標(biāo)伊馬替尼濃度為20.0ng/ml；(2)取患者血漿樣本，加入內(nèi)標(biāo)伊馬替尼的甲醇水溶液，使得內(nèi)標(biāo)濃度達(dá)到20ng/ml，得到患者待測(cè)血漿樣本；采用由體積比為1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚組成的混合溶液萃取所述患者待測(cè)血漿樣本中藥物；再在高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀上進(jìn)樣分析，記錄色譜圖和質(zhì)譜圖；并在色譜圖中對(duì)藥物及內(nèi)標(biāo)的特征性二級(jí)碎片離子進(jìn)行提取，計(jì)算藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到患者待測(cè)血漿樣品中藥物濃度；其中，液相色譜條件：hypersilgold-c18色譜柱，流動(dòng)相為流動(dòng)相a和流動(dòng)相b，流動(dòng)相梯度洗脫條件為：0-0.5min，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為20％；0.5-3.0min，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為20％-95％；3.0-6.0min，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為95％；6.0-6.1min，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為95％-20％；6.1-8.0min，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為20％；流速為0.4ml/min，進(jìn)樣量5μl，柱溫30℃，進(jìn)樣器內(nèi)溫度4℃，其中，流動(dòng)相a為體積分?jǐn)?shù)為0.1％的甲酸水溶液，流動(dòng)相b為100％甲醇；質(zhì)譜條件：離子源為hesi，噴霧電壓3000v，毛細(xì)管溫度350℃，鞘氣和輔助氣分別為45psi和10arb；正離子模式下以平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(parallelreactionmonitoring,prm)模式進(jìn)行掃描，二級(jí)碎片掃描分辨率為17500；各藥物和內(nèi)標(biāo)的具體碰撞解離能量分別為：阿帕替尼35％、克唑替尼21％、厄洛替尼37％、吉非替尼25％、埃克替尼35％、拉帕替尼35％、伊馬替尼32％；各藥物和內(nèi)標(biāo)的母離子/特征性二級(jí)碎片離子的檢測(cè)離子對(duì)如下：阿帕替尼398.1975/212.0818、克唑替尼450.1258/260.1506、厄洛替尼394.1761/336.1343、吉非替尼447.1593/128.1070、?？颂婺?92.1604/304.1081、拉帕替尼581.1420/458.1066、伊馬替尼494.2662/394.1662。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，步驟(1)中，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本按以下方法制得：取100μl空白血漿，加入一定體積的某一藥物貯備液和內(nèi)標(biāo)貯備液，或者加入一定體積的用體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水稀釋后的某一藥物貯備液和內(nèi)標(biāo)貯備液，制得該藥物某一標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本，并依此法分別制得各藥物的不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本；其中，所述藥物貯備液是以甲醇作為溶劑配制的各藥物濃度為1.0mg/ml的藥物甲醇溶液，所述內(nèi)標(biāo)貯備液是以體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水作為溶劑配制的內(nèi)標(biāo)濃度為1μg/ml的內(nèi)標(biāo)甲醇水溶液；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本中，最終內(nèi)標(biāo)濃度為20.0ng/ml，最終血漿各藥物的標(biāo)準(zhǔn)濃度如下：吉非替尼：0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、8.0ng/ml、10.0ng/ml；?？颂婺幔?.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、8.0ng/ml、10.0ng/ml；厄洛替尼：0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、8.0ng/ml、10.0ng/ml；拉帕替尼：2.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、80.0ng/ml、100.0ng/ml、160.0ng/ml、200.0ng/ml；阿帕替尼：0.02ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、10.0ng/ml；克唑替尼：0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、10.0ng/ml、16.0ng/ml、20.0ng/ml。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，步驟(1)中，用所述混合溶液萃取所述標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本中藥物，包括：將所述標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本渦旋20s，然后加入500μl的由體積比為1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚組成的混合溶液，渦旋1min后在4℃條件下10000g離心5min，取400μl上清液置于新管內(nèi)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后加入100μl的體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水重溶，隨后在4℃條件下10000g離心5min，取上清置進(jìn)樣管中，待進(jìn)樣分析。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，步驟(2)中，用所述混合溶液萃取所述患者待測(cè)血漿樣本中藥物，包括：將所述患者待測(cè)血漿樣本渦旋20s，然后加入500μl的由體積比為1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚組成的混合溶液，渦旋1min后在4℃條件下10000g離心5min，取400μl上清液置于新管內(nèi)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后加入100μl的體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水重溶，隨后在4℃條件下10000g離心5min，取上清置進(jìn)樣管中，待進(jìn)樣分析。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，步驟(2)中，所述患者待測(cè)血漿樣本的體積為20μl。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，步驟(2)中，在萃取前，先用空白血漿稀釋所述患者待測(cè)血漿樣本。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，所述hypersilgold-c18色譜柱的規(guī)格為50×2.1mm，粒徑為5μm。本發(fā)明建立了一種基于高效液相色譜聯(lián)合高分辨質(zhì)譜的檢測(cè)方法，先對(duì)上述藥物進(jìn)行液相分離，隨后采用高分辨質(zhì)譜儀中的平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(prm)模式，即通過(guò)高分辨質(zhì)譜中的四級(jí)桿對(duì)母離子進(jìn)行有目的地篩選，篩選后的離子進(jìn)入碰撞池發(fā)生高能碰撞進(jìn)行碎裂，所產(chǎn)生的碎片被同時(shí)送入orbitrap進(jìn)行高分辨掃描，然后選擇特征性二級(jí)碎片離子進(jìn)行靶向定量，能夠有效地增強(qiáng)選擇性，降低假陽(yáng)性率。本發(fā)明中，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后所采用的流動(dòng)相組成為：體積分?jǐn)?shù)為0.1％的甲酸水(流動(dòng)相a)、100％甲醇(流動(dòng)相b)，如此一來(lái)，在梯度洗脫下前述六種藥物在3.5min時(shí)全部出峰完畢，得到的色譜質(zhì)譜峰更窄、檢測(cè)所需時(shí)間更短。本發(fā)明中，對(duì)內(nèi)標(biāo)進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后所采用的內(nèi)標(biāo)為伊馬替尼，其對(duì)上述的各藥物無(wú)干擾。本發(fā)明中，對(duì)碰撞能量進(jìn)行了優(yōu)化，分別確定藥物阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、?？颂婺?、拉帕替尼、以及內(nèi)標(biāo)伊馬替尼的碰撞能量依次為35％、21％、37％、25％、35％、35％、32％時(shí)，如此一來(lái)，所獲取的離子信號(hào)最強(qiáng)，各藥物的二級(jí)碎片離子峰強(qiáng)度最高。而且，由orbitrap檢測(cè)器進(jìn)行的精度檢測(cè)顯示了本發(fā)明中數(shù)據(jù)精度的高可靠性：與理論值相比，上述各藥物一級(jí)母離子在orbitrap檢測(cè)器中質(zhì)量偏差小于5ppm，二級(jí)碎片母離子在orbitrap檢測(cè)器中質(zhì)量偏差亦小于5ppm。本發(fā)明中，在采用高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜對(duì)血漿中藥物濃度進(jìn)行分析前，通過(guò)由體積比為1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚混合溶液對(duì)待測(cè)血漿樣本進(jìn)行預(yù)處理，獲得了較高的回收率，且能夠避免基質(zhì)效應(yīng)。本發(fā)明中，所用待測(cè)血漿樣本量為20μl，顯著低于其他文獻(xiàn)報(bào)道所使用的樣本量，因此，本發(fā)明適用于臨床樣本量較少的情況。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：(1)本發(fā)明建立了一種同時(shí)測(cè)定血漿中六種酪氨酸激酶抑制劑濃度的方法，可以同時(shí)適用和滿足六種不同藥物的檢測(cè)需求，能夠大幅降低后續(xù)開(kāi)發(fā)成本，同時(shí)，有利于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一，從而為不同檢測(cè)點(diǎn)或?qū)嶒?yàn)室采集的數(shù)據(jù)能夠相互參考或使用提供可能性。(2)本發(fā)明在采用高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜測(cè)定前對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行預(yù)處理，獲得了較高的回收率，并且能夠避免基質(zhì)效應(yīng)。(3)本發(fā)明所用待測(cè)血漿樣本量為20μl，顯著低于其他文獻(xiàn)報(bào)道所使用的樣本量，從而使得本發(fā)明適用于臨床樣本量較少的情況。(4)經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本發(fā)明方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密度和準(zhǔn)確度良好、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)；并且，各藥物的提取回收率在可接受范圍內(nèi)，也未見(jiàn)明顯基質(zhì)效應(yīng)，無(wú)明顯稀釋效應(yīng)；同時(shí)，本發(fā)明方法還具有快速、通量高的優(yōu)點(diǎn)。(5)臨床血漿樣本中藥物濃度的測(cè)定結(jié)果，進(jìn)一步證明了本發(fā)明方法適用于臨床血漿中藥物濃度的檢測(cè)。附圖說(shuō)明圖1給出了7種物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，其中，(1)阿帕替尼；(2)克唑替尼；(3)吉非替尼；(4)?？颂婺?；(5)拉帕替尼；(6)厄洛替尼；(7)伊馬替尼。圖2a和圖2b分別是對(duì)空白血漿、加入各藥物和內(nèi)標(biāo)的血漿所測(cè)得的色譜圖中進(jìn)行特征性二級(jí)碎片離子提取的結(jié)果。具體實(shí)施方式為了更好地說(shuō)明本發(fā)明，以便理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)理解，下述的實(shí)施實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)為準(zhǔn)。以下實(shí)施例中所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)得的常規(guī)產(chǎn)品。例如，阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、?？颂婺?、拉帕替尼、伊馬替尼從美國(guó)selleck公司購(gòu)買(mǎi)；乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇和甲酸從美國(guó)tedia公司購(gòu)買(mǎi)。一、標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本和質(zhì)控血漿樣本的制備1.1貯備液的制備：用甲醇作為溶劑，分別配制六種酪氨酸激酶抑制劑藥物(阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、?？颂婺?、拉帕替尼)的貯備液，六種藥物貯備液的藥物濃度均為1.0mg/ml；用體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水作為溶劑，配制內(nèi)標(biāo)伊馬替尼的貯備液，內(nèi)標(biāo)貯備液的內(nèi)標(biāo)濃度為1μg/ml；所有的貯備液均存放在玻璃管中，4℃保存；1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本的制備：取100μl空白血漿，加入一定體積的前述的1.1項(xiàng)所制得的一種藥物貯備液和內(nèi)標(biāo)貯備液(或者加入一定體積的用體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水稀釋后的上述1.1項(xiàng)所制得的一種藥物貯備液和內(nèi)標(biāo)貯備液)，制得該藥物某一標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本，并依此法分別制得各種藥物的不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本。標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本中，最終血漿藥物濃度如下表1所示，最終內(nèi)標(biāo)濃度為20.0ng/ml。表1.各藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本的最終濃度1.3質(zhì)控血漿樣本的制備：取100μl空白血漿，加入一定體積的前述的1.1項(xiàng)所制得的一種藥物貯備液和內(nèi)標(biāo)貯備液(或者加入一定體積的用體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水稀釋后的上述1.1項(xiàng)所制得的一種藥物貯備液和內(nèi)標(biāo)貯備液)，制得該藥物某一質(zhì)控濃度的質(zhì)控血漿樣本，并依此法分別制得各個(gè)藥物的不同質(zhì)控濃度的質(zhì)控血漿樣本。質(zhì)控血漿樣本中，最終血漿藥物濃度如下表2所示，最終內(nèi)標(biāo)濃度為20.0ng/ml。表2.各藥物的質(zhì)控血漿樣本的最終濃度二、患者血漿樣本的制備(以阿帕替尼為例)得到患者知情及倫理的同意下，在患者服用阿帕替尼至少一個(gè)月后開(kāi)始采集血液。給藥方式：1天一次。血液收集后在4℃條件下3000g離心5min，取上層血漿作為樣本，-80℃保存。取20μl患者血漿樣本，加入一定體積內(nèi)標(biāo)貯備液(或者用體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水稀釋后的內(nèi)標(biāo)貯備液)，使得內(nèi)標(biāo)濃度達(dá)到20ng/ml，得到待測(cè)患者血漿樣本。三、血漿樣本的預(yù)處理將血漿樣本渦旋20s，然后加入500μl的由體積比為1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚組成的混合溶液，渦旋1min后在4℃條件下10000g離心5min，取400μl上清液置于新管內(nèi)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后加入100μl的體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水重溶，隨后在4℃條件下10000g離心5min，取上清置進(jìn)樣管中，待進(jìn)樣分析。上述的血漿樣本為標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本、質(zhì)控血漿樣本、待測(cè)患者血漿樣本、空白血漿樣本。四、hplc-ms/ms測(cè)試4.1色譜條件高效液相：ultimate3000lc(thermoscientific)色譜柱：hypersilgold-c18柱子(50×2.1mm,5μm,thermoscientific)流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)為0.1％的甲酸水(流動(dòng)相a)，100％甲醇(流動(dòng)相b)流速：0.4ml/min進(jìn)樣量：5μl柱溫：30℃進(jìn)樣器內(nèi)溫度：4℃流動(dòng)相梯度設(shè)置如下：時(shí)間(min)流動(dòng)相a(％)流動(dòng)相b(％)流速(ml/min)080％20％0.40.580％20％0.43.05％95％0.46.05％95％0.46.180％20％0.48.080％20％0.44.2質(zhì)譜條件質(zhì)譜儀：q-exactive；離子源：hesi電離源，噴霧電壓3000v，毛細(xì)管溫度350℃，鞘氣和輔助氣分別為45psi、10arb；離子極性：正離子模式；離子檢測(cè)方式：平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(prm)模式各藥物和內(nèi)標(biāo)的具體碰撞解離能量下見(jiàn)表3；二級(jí)碎片掃描分辨率為17500；各藥物母離子和特征性二級(jí)碎片離子見(jiàn)下表3。表3.各藥物保留時(shí)間、精確分子量及碰撞能量五、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備對(duì)于按照“表1”中所列的某一藥物的各標(biāo)準(zhǔn)濃度配制的各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本中的每個(gè)樣本進(jìn)行以下操作：按照“三、血漿樣本的預(yù)處理”項(xiàng)操作后，取5μl置于進(jìn)樣管中，依照“4.1”和“4.2”的條件，進(jìn)行hplc-ms/ms(使用target-ms/ms模式)測(cè)定，記錄色譜圖和質(zhì)譜圖；并在色譜圖中對(duì)該藥物及內(nèi)標(biāo)伊馬替尼的特征性二級(jí)碎片離子(“表3”理論值)進(jìn)行提取，計(jì)算藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值；全部樣本完成上述操作后，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，以藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得該藥物的直線回歸方程，即為該藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。依照同樣的步驟，制備各藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，本分析方法下：阿帕替尼線性范圍為0.02-10ng/ml，克唑替尼線性范圍為0.10-20.0ng/ml，厄洛替尼線性范圍為0.05-10.0ng/ml，吉非替尼線性范圍為0.05-10.0ng/ml，?？颂婺峋€性范圍為0.05-10.0ng/ml，拉帕替尼線性范圍為2.0-200.0ng/ml。各藥物的直線回歸方程以及定量下限的結(jié)果如表4所示。表4.各藥物線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及定量下限*y代表藥物峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積，x代表濃度由表4可見(jiàn)，各藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均為良好(r2﹥0.99)，并均取得了較低的定量下限。阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、?？颂婺?、拉帕替尼的定量下限分別為0.02ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml、0.05ng/ml、0.05ng/ml、2.0ng/ml。六、方法學(xué)驗(yàn)證方法學(xué)驗(yàn)證主要包括線性、靈敏度、特異性、精密度、準(zhǔn)確度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性。6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限見(jiàn)上述“五、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)的內(nèi)容。結(jié)果顯示：各藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均為良好(r2﹥0.99)，并均取得了較低的定量下限。6.2特異性取100μl空白血漿，不加藥物和內(nèi)標(biāo)，按照“三、血漿樣本的預(yù)處理”項(xiàng)操作后，取5μl置于進(jìn)樣管中，依照4.1和4.2的條件，進(jìn)行hplc-ms/ms(使用target-ms/ms模式)測(cè)定，記錄色譜圖和質(zhì)譜圖，并在色譜圖中對(duì)各藥物及內(nèi)標(biāo)的特征性二級(jí)碎片離子(“表3”理論值)進(jìn)行提取，結(jié)果如圖2a所示，其中，從上至下依次為對(duì)以下藥物及內(nèi)標(biāo)的特征性二級(jí)碎片離子的提取結(jié)果：?？颂婺?、厄洛替尼、阿帕替尼、吉非替尼、克唑替尼、伊馬替尼、拉帕替尼。取100μl空白血漿，加入一定體積的前述的1.1項(xiàng)所制得的一種藥物貯備液和內(nèi)標(biāo)貯備液(或加入一定體積的用體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水稀釋后的上述1.1項(xiàng)所制得的一種藥物貯備液和內(nèi)標(biāo)貯備液)，最終使得該藥物濃度達(dá)到如“表1”中所示的濃度5，內(nèi)標(biāo)濃度為20.0ng/ml。隨后，按“三、血漿樣本的預(yù)處理”項(xiàng)操作，取5μl置于進(jìn)樣管中，依照“4.1”和“4.2”的條件，進(jìn)行hplc-ms/ms(使用target-ms/ms模式)分析，記錄色譜圖和質(zhì)譜圖，并在色譜圖中對(duì)藥物及內(nèi)標(biāo)的特征性二級(jí)碎片離子(“表3”理論值)進(jìn)行提取。分別對(duì)六種藥物依此法操作。結(jié)果如圖2b所示。圖2b顯示了各藥物和內(nèi)標(biāo)伊馬替尼的特征性二級(jí)碎片離子峰。由圖2a和圖2b可見(jiàn)，在未添加藥物的空白血漿中沒(méi)檢測(cè)到特征性二級(jí)碎片離子峰，如圖2a所示；在添加了藥物的血漿中可檢測(cè)到明顯的特征性二級(jí)碎片離子峰，且各藥物和內(nèi)標(biāo)峰形均良好，無(wú)雜峰干擾，如圖2b所示。可見(jiàn)，血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾各藥物及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，證明本發(fā)明方法對(duì)血漿中上述6種藥物的檢測(cè)具有較強(qiáng)的特異性。6.3精密度和準(zhǔn)確度對(duì)于按照“表2”中所列的各質(zhì)控濃度配制的各藥物的質(zhì)控血漿樣本(每個(gè)藥物每個(gè)濃度各制備6份，每天制備一批樣品，連續(xù)3天，一共制備3批作為考察精密度和準(zhǔn)確度的樣品)中的每個(gè)樣本進(jìn)行以下操作：按照“三、血漿樣本的預(yù)處理”項(xiàng)操作后，取5μl置于進(jìn)樣管中，依照“4.1”和“4.2”的條件，分別進(jìn)行hplc-ms/ms(使用target-ms/ms模式)測(cè)定，記錄色譜圖和質(zhì)譜圖，并在色譜圖中對(duì)藥物及內(nèi)標(biāo)的特征性二級(jí)碎片離子(“表3”理論值)進(jìn)行提取，計(jì)算藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入當(dāng)天所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線求測(cè)試濃度，最后計(jì)算批內(nèi)和批間精密度(絕對(duì)值小于15％為合格)和準(zhǔn)確度(85％-115％為合格)。具體結(jié)果見(jiàn)表5。表5.各藥物準(zhǔn)確度和精密度測(cè)試結(jié)果由表5可見(jiàn)，血漿中各藥物的各測(cè)試濃度的準(zhǔn)確度均在85％-115％的合格區(qū)間內(nèi)，血漿中各藥物的各測(cè)試濃度的批內(nèi)和批間精密度絕對(duì)值均小于15％。由此證明本發(fā)明方法對(duì)血漿中上述6個(gè)藥物的檢測(cè)具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。6.4基質(zhì)效應(yīng)和回收率第1組：取空白血漿100μl，加入500μl的由體積比為1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚組成的混合溶液，渦旋1min后在4℃條件下10000g離心5min，取400μl上清液置于新管內(nèi)，加入“表6”中所列的一種藥物和內(nèi)標(biāo)，使得該藥物和內(nèi)標(biāo)濃度為“表6”所示的質(zhì)控濃度，每個(gè)濃度均制備6份。依照此法分別制備如下“表6”所示的六種藥物的不同質(zhì)控濃度的樣本。對(duì)于每個(gè)樣本進(jìn)行如下操作：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后，加入100μl的體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水重溶，隨后在4℃條件下10000g離心5min，取5μl上清置進(jìn)樣管中，依照“4.1”和“4.2”的條件，分別進(jìn)行hplc-ms/ms(使用target-ms/ms模式)測(cè)定，記錄每次測(cè)試中藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積。第2組：對(duì)于按照“表6”中所列的各質(zhì)控濃度配制的各藥物的質(zhì)控血漿樣本(制備方法見(jiàn)1.3項(xiàng)，每個(gè)藥物每個(gè)濃度各制備6份)中的每個(gè)樣本進(jìn)行以下操作：按照“三、血漿樣本的預(yù)處理”項(xiàng)操作后，取5μl置于進(jìn)樣管中，依照“4.1”和“4.2”的條件，分別進(jìn)行hplc-ms/ms(使用target-ms/ms模式)分析，記錄每次測(cè)試中藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積。第3組：用體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水稀釋按照1.1項(xiàng)所制得的藥物貯備液和內(nèi)標(biāo)貯備液，分別制得20μl的如“表6”所示的不同質(zhì)控濃度的各藥物溶液(含內(nèi)標(biāo))，加入到ep管中。每個(gè)藥物每個(gè)濃度均制備6份。對(duì)于每個(gè)藥物溶液進(jìn)行以下操作：將藥物溶液渦旋20s，然后加入500μl的由體積比為1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚組成的混合溶液，渦旋1min后在4℃條件下10000g離心5min，取400μl上清液置于新管內(nèi)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后加入100μl的體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水重溶，隨后在4℃條件下10000g離心5min，取5μl上清置進(jìn)樣管中，依照“4.1”和“4.2”的條件，分別進(jìn)行hplc-ms/ms(使用target-ms/ms模式)分析，記錄每次測(cè)試中藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，其中，回收率和基質(zhì)效應(yīng)根據(jù)以下公式計(jì)算得到：回收率％＝第2組藥物峰面積/第1組藥物峰面積×100％；基質(zhì)效應(yīng)％＝第1組藥物峰面積/第3組藥物峰面積×100％。表6.人血漿內(nèi)基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率試驗(yàn)(n＝6)由表6可見(jiàn)，血漿中各藥物的低濃度基質(zhì)效應(yīng)在81.1％-93.4％之間，中高濃度基質(zhì)效應(yīng)在88.2％-97.4％之間，rsd值均在±15％之內(nèi)，提示本發(fā)明對(duì)血漿中上述6個(gè)藥物的檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)明顯的基質(zhì)效應(yīng)。此外，血漿中各藥物的各濃度(低、中、高)提取回收率在88.3％-103.6％之間，rsd值均在±15％之內(nèi)，提示本發(fā)明對(duì)血漿中上述6個(gè)藥物具有較高的提取回收率。因此，本發(fā)明方法中，各藥物的提取回收率在可接受范圍內(nèi)，且未見(jiàn)明顯基質(zhì)效應(yīng)。6.5稀釋效應(yīng)(一百倍稀釋)對(duì)于按照“表1”中所列的各藥物的濃度7配制的各個(gè)藥物血漿樣本(制備方法見(jiàn)1.2項(xiàng)，每個(gè)藥物均制備3份)分別進(jìn)行以下操作：用空白血漿稀釋100倍后，按“三、血漿樣本的預(yù)處理”項(xiàng)操作，進(jìn)行hplc-ms/ms(使用target-ms/ms模式)分析，記錄色譜圖和質(zhì)譜圖，并在色譜圖中對(duì)藥物及內(nèi)標(biāo)的特征性二級(jí)碎片離子(“表3”理論值)進(jìn)行提取，計(jì)算藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入當(dāng)天所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線求測(cè)試濃度，將測(cè)試濃度乘以100，計(jì)算得出未稀釋時(shí)的血漿藥物濃度。將計(jì)算得到的各藥物濃度與各藥物所對(duì)應(yīng)的濃度7進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：100倍稀釋后，各藥物的精密度均在15％以內(nèi)，準(zhǔn)確度均在85％-115％之間，表明在該稀釋條件下，未出現(xiàn)明顯的稀釋效應(yīng)，樣品的精密度和準(zhǔn)確度不受影響。6.6穩(wěn)定性穩(wěn)定性考察涵蓋樣品的整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中。各藥物均設(shè)置低、中、高3個(gè)濃度，具體見(jiàn)表7?？疾祉?xiàng)目主要包括如下幾個(gè)方面：室溫短期穩(wěn)定性，自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)穩(wěn)定性，凍融和長(zhǎng)期穩(wěn)定性。表7.穩(wěn)定性測(cè)試具體操作如下：將按照“表7”中所列的各藥物的質(zhì)控濃度配制的質(zhì)控血漿樣本(制備方法見(jiàn)1.3項(xiàng))，每個(gè)藥物每個(gè)濃度各制備15份。其中，3份按“三、血漿樣本的預(yù)處理”項(xiàng)下操作，立即進(jìn)樣分析，所得的結(jié)果為0h的對(duì)照樣品；3份于室溫放置12小時(shí)后按“三、血漿樣本的預(yù)處理”項(xiàng)下操作分析；3份按“三、血漿樣本的預(yù)處理”項(xiàng)下操作，于自動(dòng)進(jìn)樣器中放置12h后，再進(jìn)樣分析；3份于配制好后反復(fù)凍融三次(每次冰凍24小時(shí)后化凍)，按“三、血漿樣本的預(yù)處理”項(xiàng)下操作分析；3份于配制好后放入-80℃冰箱中冷凍保存30天后取出化凍，按“三、血漿樣本的預(yù)處理”項(xiàng)下操作分析。計(jì)算各種條件下樣品相對(duì)于0h樣品均值的偏差(即準(zhǔn)確度)以及cv(變異系數(shù))值。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可見(jiàn)：血漿中各藥物的各濃度在上述考察條件下檢測(cè)得出的cv值均小于10％，提示在上述考察條件下本發(fā)明方法對(duì)血漿中上述6個(gè)藥物的檢測(cè)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。七、患者血漿樣本中藥物濃度的檢測(cè)將“二、患者血漿樣本的制備”所得的患者待測(cè)血漿樣本按照“三、血漿樣本的預(yù)處理”操作后，取5μl置于進(jìn)樣管中，依照4.1和4.2的條件，進(jìn)行hplc-ms/ms(使用target-ms/ms模式)測(cè)定，記錄色譜圖和質(zhì)譜圖，并在色譜圖中對(duì)藥物及內(nèi)標(biāo)的特征性二級(jí)碎片離子(“表3”理論值)進(jìn)行提取，計(jì)算藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入當(dāng)天所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得測(cè)定濃度。具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表8。表8.臨床血漿樣本中阿帕替尼濃度測(cè)定樣本編號(hào)性別年齡劑量(mg)用藥后采集時(shí)間(h)測(cè)定濃度(ng/ml)1男62500123052男7125012723男63250121424*男62250121825女5425012896男5450012207女5237512668男6125012577*表示樣本采集于同一位病患，該病患因經(jīng)濟(jì)條件限制而調(diào)整藥物劑量。結(jié)果分析：(1)表8中樣本1號(hào)和4號(hào)采集于同一位患者，該患者因經(jīng)濟(jì)原因?qū)⑺幬锓脛┝繌脑鹊?00mg/天調(diào)整為250mg/天，本發(fā)明所測(cè)得的調(diào)整前后的血藥濃度隨即發(fā)生變化，顯示本發(fā)明方法在上述藥物血漿濃度檢測(cè)方面的適用性。(2)根據(jù)表8中結(jié)果顯示，不同患者在服用相同藥物劑量的情況下，出現(xiàn)了差異較大的血藥濃度。該結(jié)果提示臨床上患者在服用上述藥物時(shí)確實(shí)存在個(gè)體差異，顯示本發(fā)明的血藥濃度檢測(cè)具有臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。綜上，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本發(fā)明方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密度和準(zhǔn)確度良好、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)；并且，各藥物的提取回收率在可接受范圍內(nèi)，也未見(jiàn)明顯基質(zhì)效應(yīng)，無(wú)明顯稀釋效應(yīng)；同時(shí)，本發(fā)明方法還具有快速、通量高的優(yōu)點(diǎn)。臨床血漿樣本中阿帕替尼濃度測(cè)定結(jié)果，進(jìn)一步證明了本發(fā)明方法適用于臨床血漿中藥物濃度的檢測(cè)。在以上實(shí)施例中，如沒(méi)有特別說(shuō)明的情況下，藥物均是指六種酪氨酸激酶抑制劑藥物(阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼、拉帕替尼)中的一種或多種。應(yīng)當(dāng)注意的是，以上所述的實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制，通過(guò)參照典型實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解為其中所用的詞語(yǔ)為描述性和解釋性詞匯，而不是限定性詞匯?？梢园匆?guī)定在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明作出修改，以及在不背離本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修訂。盡管其中描述的本發(fā)明涉及特定的方法、材料和實(shí)施例，但是并不意味著本發(fā)明限于其中公開(kāi)的特定例，相反，本發(fā)明可擴(kuò)展至其他所有具有相同功能的方法和應(yīng)用。當(dāng)前第1頁(yè)12