本發(fā)明屬于復雜樣品中手性異構體分離、分析檢測技術研究，具體涉及一種正相液相色譜-串聯(lián)質譜法分析煙草及煙草制品中煙堿旋光異構體，主要是用naoh溶液-正己烷提取煙葉中的煙堿，采用手性色譜柱實現(xiàn)煙堿旋光異構體的分離，柱后高壓輸液泵引入異丙醇并進行分流，結合串聯(lián)質譜分析，實現(xiàn)了煙草及煙草制品中s-(-)-煙堿和r-(+)-煙堿的分離及靈敏檢測。
背景技術：
：煙堿是煙草和煙氣中含量最豐富的生物堿，是人類吸煙的主要動力。煙堿有兩個旋光異構體，即s-(-)-煙堿和r-(+)-煙堿。二者具有完全不同的代謝機理和生理特性，s-(-)-煙堿的生理活性和毒性比r-(+)-煙堿更強。因此，煙堿旋光異構體的分離分析在藥學和吸煙與健康方面具有重要意義。目前文獻報道的煙堿旋光異構體的分離分析主要方法有手性色譜柱-二維氣相色譜法、手性色譜柱-液相色譜法等。手性色譜柱-二維氣相色譜法存在的問題分析時間長；而手性色譜柱-液相色譜法存在的問題是靈敏度較低。由于天然煙草中的煙堿主要是s-(-)-煙堿，而r-(+)-煙堿僅占煙堿總量的0.2~0.3%?，F(xiàn)有方法對含量較低的r-(+)-煙堿難以實現(xiàn)準確定量。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對以上問題，提出了一種正相液相色譜-串聯(lián)質譜法分析煙草及煙草制品中煙堿旋光異構體，主要是采用結合柱后高壓輸液泵引入異丙醇并進行分流，以實現(xiàn)質譜檢測并提高方法靈敏度。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：一種煙草及煙草制品中煙堿旋光異構體的正相液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法，是用naoh溶液-正己烷提取煙葉中的煙堿，采用手性色譜柱實現(xiàn)煙堿旋光異構體的分離，柱后高壓輸液泵引入異丙醇并進行分流，結合串聯(lián)質譜分析，實現(xiàn)煙草及煙草制品中s-(-)-煙堿和r-(+)-煙堿的分離及靈敏檢測,具體步驟如下：a、煙葉樣品前處理：準確稱取0.1~0.3g煙絲，置于50ml具塞三角瓶中，加入1~5ml5.0%naoh溶液，靜置5~30min，準確加入含有內標的正己烷溶液10~50ml，超聲萃取5~30min，取上層清液過有機相濾膜，有機相濾膜上加有1~3.0g無水硫酸鈉，凈化后的樣品溶液進正相液相色譜-串聯(lián)質譜分析。b、樣品分析：液相色譜條件：采用正相液相色譜-串聯(lián)質譜分析，所用色譜柱為手性色譜柱；柱溫：30oc；流動相a：含有堿性添加劑的正己烷，流動相b：異丙醇；等度洗脫；流速0.5~1.0ml/min；進樣體積10μl，分析時間為17min；柱后加入異丙醇及分流：為提高正相液相色譜-串聯(lián)質譜法的靈敏度，實現(xiàn)煙堿旋光異構體定量分析的要求，在柱后通過三通閥連接，采用安捷倫高壓輸液泵引入異丙醇，控制異丙醇流速。同時，為適應質譜分析的要求，進行柱后分流以減少進入質譜的溶劑量。采用離子源上配置的三通閥進行柱后分流，通過控制peek管的長度，控制分流比。離子源：電噴霧電離源（esi）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測mrm；電噴霧電壓：5000v；氣簾氣壓力：30psi；輔助氣1壓力：70psi；輔助氣2壓力：70psi；離子源溫度：550oc。各化合物及內標的保留時間、母離子、子離子、碰撞能量（ce）及去簇電壓（dp）參見表1。在本發(fā)明中，步驟a中所述內標為：采用外消旋的d3-煙堿為內標，d3-s-(-)-煙堿和d3-r-(+)-煙堿合并計算，濃度范圍為1~10mg/ml。步驟b中所述的手性色譜柱為大賽璐手性色譜柱chiralpak?ic，規(guī)格為4.6mm×250mm，i.d.5μm；堿性流動相添加劑為二乙胺，添加量為正己烷質量的0.02%~0.2%；所述的等度洗脫條件為a:b=95：5；柱后加入異丙醇流速為0.1~1.0ml/min；柱后分流比例為1:3~1:5；本發(fā)明采用正己烷配制煙堿旋光異構體混合母液用于配制標準工作溶液，氘代內標溶液和標準工作溶液同樣采用正己烷配制。分別對標準工作溶液進行正相液相色譜-串聯(lián)質譜法分析，并以s-(-)-煙堿和r-(+)-煙堿與內標物峰面積比對濃度比進行線性回歸，得到各目標化合物的標準工作曲線。取最低濃度標準工作溶液，10次平行測定，計算標準偏差，3倍標準偏差為檢測限，10倍標準偏差為定量限，結果見表2。本發(fā)明的有益效果如下：（1）首次采用正相液相色譜-串聯(lián)質譜法分析煙草及煙草制品中煙堿旋光異構體，實現(xiàn)了煙葉中煙堿旋光異構體的分離檢測；（2）由于正相液相色譜流動相主要為非極性溶劑（正己烷），離子化效率低，不適合質譜檢測。因此，采用柱后高壓輸液泵引入異丙醇，提高極性溶劑的比例，以提高質譜離子化效率和分析的靈敏度。同時，為了進一步提高質譜的霧化和離子化效率，在加入異丙醇后再進行柱后分流，減少進入質譜的溶劑量，滿足液相色譜串聯(lián)質譜分析的要求，提高分析的靈敏度；（3）與文獻報道方法比較，本發(fā)明兩種煙堿旋光異構體的色譜分離度高（保留時間相差1min）；分析時間短（僅需17min）；方法靈敏度高，滿足含量較低的r-(+)-煙堿的定量要求。附圖說明圖1為煙堿旋光異構體的多反應監(jiān)測質譜（mrm）圖其中：a為s-(-)-煙堿，b為r-(+)-煙堿。具體實施方式本發(fā)明以下將結合實施例作進一步說明：實施例1（1）煙葉樣品前處理：準確稱取0.30g煙絲，加入到50ml具塞三角瓶中，加入2ml5.0%naoh溶液，靜置10min，準確加入含有d3-煙堿外消旋體的正己烷溶液20ml，外消旋的d3-煙堿濃度為5mg/ml，超聲萃取15min，取上層清液過針筒中加有2.0g無水硫酸鈉的有機相濾膜，濾出液進正相液相色譜-串聯(lián)質譜分析。（2）儀器分析條件：采用正相液相色譜-串聯(lián)質譜法分析，所用色譜柱為大賽璐手性色譜柱chiralpak?ic，規(guī)格為4.6mm×250mm，i.d.5μm；柱溫：30oc；流動相a：含有0.1%二乙胺的正己烷，流動相b：異丙醇；95%a+5%b等度洗脫；流速1.0ml/min；進樣體積10μl，分析時間為17min。采用安捷倫高壓輸液泵進行柱后加入異丙醇，控制異丙醇流速為1ml/min；并利用離子源上配置的三通閥進行柱后分流，控制分流比為1:5。采用esi離子源，正離子掃描模式；多反應監(jiān)測mrm；電噴霧電壓：5000v；氣簾氣壓力：30psi；輔助氣1壓力：70psi；輔助氣2壓力：70psi；離子源溫度：550oc。實施例2選取5種煙葉樣品，按照實施例1所述的分析方法，測定樣品中煙堿旋光異構體的含量，結果如表3所示。表3煙葉樣品中煙堿旋光異構體的含量（mg/g）樣品編號s-(-)-煙堿r-(+)-煙堿1#14.300.0362#16.320.0493#19.600.0454#18.300.0495#18.420.052當前第1頁12