本發(fā)明涉及農(nóng)產(chǎn)品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種基于納米材料檢測萊克多巴胺的電化學(xué)傳感器。

背景技術(shù)：

我國畜牧、水產(chǎn)業(yè)年產(chǎn)值3.9萬億元（2013年），占農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的43%，年產(chǎn)量、產(chǎn)值均居世界第一。畜牧業(yè)是我國國民經(jīng)濟支柱產(chǎn)業(yè)，是居民優(yōu)質(zhì)蛋白來源之一。但是，近年來養(yǎng)殖、加工和流通環(huán)節(jié)濫用獸藥和違禁添加劑案件不斷曝光。萊克多巴胺是一種人工合成的克侖巴安β腎上腺受體激動劑，能夠顯著提高動物胴體的瘦肉率，但在動物組織和多種臟器中殘留，嚴重危害人體健康和生命安全。我國已于2011年將其列為禁用藥物。為更好的檢測畜禽產(chǎn)品中萊克多巴胺，研究建立快速、簡便、高效的萊克多巴胺檢測方法可以更好的保障畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

常用的萊克多巴胺有酶聯(lián)免疫法、免疫親和柱層析法、色譜分析法等，上述方法雖準確、靈敏，但樣品前處理及測定操作過程繁瑣、成本高，且不適宜于現(xiàn)場的快速檢查。電化學(xué)免疫傳感器是將抗原、抗體免疫反應(yīng)、酶的高效催化反應(yīng)及電化學(xué)方法有機結(jié)合而發(fā)展起來的一種融合性技術(shù)。由于其具有高選擇性、高靈敏度等特點，受到越來越多研究者的關(guān)注。納米金材料具有體積小、比表面積大、生物相容性好和加速電子傳輸速率等特點，不僅能夠增大生物分子的固定量，還可以影響修飾電極是的穩(wěn)定性。石墨烯是一種具有理想的二維平面結(jié)構(gòu)的碳納米材料，其具有容易分散、比表面積大，對電活性物質(zhì)及生物分子的高負載量，提供更均勻、更大的電活性位點分布，而且生產(chǎn)成本低，其優(yōu)越的電子性能和化學(xué)性能使其成為制備生物傳感器的理想材料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能夠克服傳統(tǒng)檢測技術(shù)的不足，具有操作簡單、成本低廉、檢測靈敏度高等優(yōu)點的萊克多巴胺生物傳感器的制備及應(yīng)用。

一種基于納米材料檢測萊克多巴胺的電化學(xué)傳感器，其特征在于，是在玻碳電極表面先后修飾上納米金粒子和制備的石墨烯-普魯士藍-殼聚糖復(fù)合物，然后在修飾好的電極上滴加萊克多巴胺抗原，得到檢測萊克多巴胺的電化學(xué)免疫傳感器。

一種基于納米材料檢測萊克多巴胺的電化學(xué)傳感器，其特征在于，制備方法如下：

步驟1）石墨烯-普魯士藍-殼聚糖復(fù)合物的制備；

步驟2）玻碳電極的預(yù)處理；

步驟3）將納米金粒子電沉積到玻碳電極上；

步驟4）將步驟1）制備得到的石墨烯-普魯士藍-殼聚糖復(fù)合物的制備修飾到步驟3）電鍍納米金的玻碳電極上，得到修飾好的玻碳電極；

步驟5）將萊克多巴胺抗原滴加到步驟3）所得的修飾好的玻碳電極上，干燥5小時；得到萊克多巴胺電化學(xué)傳感器。

作為優(yōu)選，步驟1）所述石墨烯-普魯士藍-殼聚糖復(fù)合物是以殼聚糖和普魯士藍復(fù)合膜作為分散劑，分散石墨烯，得到的分散均勻的懸濁液。

作為優(yōu)選，步驟2）玻碳電極的預(yù)處理：將玻碳電極分別在0.3和0.05μm的al2o3粉懸浮液中分別拋光，在二次蒸餾水和乙醇的混合溶液中超聲清洗10min，使其利用循環(huán)伏安法測定時ep1-ep2￡85mv的要求。

作為優(yōu)選，步驟3）所述納米金粒子的電沉積，是在1%haucl4溶液中，利用計時電流法，將au³⁺還原成au，沉積到電極表面；用二次蒸餾水沖洗10min，除去物理吸附的au，得到納米金沉積電極。

作為優(yōu)選，步驟4）所述在修飾好的電極上滴加將10μl殼聚糖-普魯士藍-石墨烯復(fù)合物溶液滴加到電極表面，干燥2h；再將10μl100ng/ml的萊克多巴胺抗原溶液滴加到修飾好的電極表面，干燥5小時；滴加10μl0.1%的牛血清白蛋白封閉電極表面的非特異性結(jié)合位點。得到萊克多巴胺電化學(xué)傳感器。

作為優(yōu)選，步驟5）所述萊克多巴胺電化學(xué)傳感器的兩種試驗條件萊克多巴胺固定抗原濃度、孵育時間進行了優(yōu)化：萊克多巴胺的檢測在固定抗原濃度為100ng/ml，孵育時間為40min。

進一步所述，試驗條件的優(yōu)化：設(shè)置固定抗原濃度分別為10，20，50，100和1000ng/ml，利用電流響應(yīng)值來確定最佳的固定抗原濃度，確定100ng/ml為最佳固定抗原濃度；選取10，20，30，40，50min作為孵育時間，利用電流響應(yīng)值來確定最佳的孵育時間，確定40min為最佳孵育時間；

萊克多巴胺的檢測：在最優(yōu)條件下：固定抗原濃度為100ng/ml，孵育時間40min，對不同濃度的萊克多巴胺進行電流檢測，并分別建立了萊克多巴胺濃度與響應(yīng)電流之間的線性關(guān)系，得不同濃度的萊克多巴胺的對數(shù)值與響應(yīng)電流之間的線性回歸方程為y=-0.9972x+36.807，相關(guān)系數(shù)為0.995。

一種基于納米材料檢測萊克多巴胺的電化學(xué)傳感器，其特征在于，具體檢測步驟如下：

1）豬肉樣品的前處理：從當?shù)爻匈徺I豬肉，稱取5g樣品，置于50ml離心管里，加入15.0ml乙腈，于振蕩器上劇烈震蕩10min。以4200r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液于另一離心管中，加2.0g氯化鈉和10.0ml正己烷，于震蕩器上劇烈震蕩10min，以4200r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，小心吸取中間乙腈層12.0ml于另一離心管中，氮吹至近干、用pbs緩沖液溶解；

2）樣品的檢測：在最優(yōu)條件下：固定抗原濃度為100ng/ml，孵育時間40min，對豬肉樣品進行檢測；

3）根據(jù)建立的相應(yīng)的線性關(guān)系，計算出相應(yīng)樣品的萊克多巴胺殘留量。

本發(fā)明所述檢測步驟用于檢測萊克多巴胺；采用本發(fā)明制備的基于納米材料檢測萊克多巴胺的傳感器具有操作簡單、成本低廉、檢測靈敏度高等優(yōu)點且反應(yīng)時間短，樣品和試劑消耗量少，穩(wěn)定性高，可用于實際樣品的現(xiàn)場檢測，符合我國萊克多巴胺殘留快速檢測技術(shù)發(fā)展和國際化要求。

一種基于納米材料的萊克多巴胺電化學(xué)傳感器及其檢測方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用石墨烯材料容易分散、比表面積大，對電活性物質(zhì)及生物分子的高負載量，提供更均勻、更大的電活性位點分布等優(yōu)點，與納米金粒子的生物相容性好和加速電子傳輸速率等優(yōu)點相結(jié)合，制備復(fù)合納米材料修飾在玻碳電極表面，有效提高所制備電化學(xué)免疫傳感器的靈敏度。同時利用殼聚糖實現(xiàn)萊克多巴胺抗體在電極上的有效固定。制備過程中，對免疫反應(yīng)的條件等參數(shù)進行優(yōu)化，選擇最佳的檢測條件：100ng/ml為固定抗原濃度、選取40min作為萊克多巴胺抗原抗體的孵育時間。制備出的萊克多巴胺免疫傳感器，通過計算接觸樣品前后免疫傳感器的阻抗值的變化，獲得樣品中萊克多巴胺的濃度信息。該傳感器在0.3-1.0×10³ng/ml濃度范圍檢測萊克多巴胺的線性關(guān)系良好，可用于實際樣品中目標成分萊克多巴胺的檢測。

附圖說明

圖1為pb-gr的sem圖；

圖2為cs-pb-gr的sem圖；

圖3裸電極（a）、納米金粒子修飾（b）、納米金粒子/殼聚糖-普魯士藍-石墨烯修飾（c）、固定抗原分子/納米金粒子/殼聚糖-普魯士藍-石墨烯修飾電極（d）在50mv/s的掃描速率下和2.0mmk3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6](1:1)溶液中的循環(huán)伏安表征；

圖4固定抗原濃度對傳感器電流響應(yīng)的影響；

圖5孵化時間對傳感器電流相應(yīng)的影響；

圖6納米金粒子/殼聚糖-普魯士藍-石墨烯傳感器對萊克多巴胺標準溶液的電流響應(yīng)值，萊克多巴胺濃度：0.3ng/ml；0.9ng/ml；2.7ng/ml；8.1ng/ml；100ng/ml；1000ng/ml；

圖7電流響應(yīng)值與萊克多巴胺濃度的對數(shù)的線性關(guān)系；

圖8納米金粒子/殼聚糖-普魯士藍-石墨烯傳感器對實際樣品加標回收率的檢測。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖1-8對本發(fā)明進行具體描述。

一種基于納米材料檢測萊克多巴胺的電化學(xué)傳感器，其特征在于，制備方法如下：

步驟1）石墨烯-普魯士藍-殼聚糖復(fù)合物的制備；

步驟2）玻碳電極的預(yù)處理；

步驟3）將納米金粒子電沉積到玻碳電極上；

步驟4）將步驟1）制備得到的石墨烯-普魯士藍-殼聚糖復(fù)合物的制備修飾到步驟3）電鍍納米金的玻碳電極上，得到修飾好的玻碳電極；

步驟5）將萊克多巴胺抗原滴加到步驟3）所得的修飾好的玻碳電極上，干燥5小時；得到萊克多巴胺電化學(xué)傳感器。

具體實施過程中，步驟1）所述石墨烯-普魯士藍-殼聚糖復(fù)合物是以殼聚糖和普魯士藍復(fù)合膜作為分散劑，分散石墨烯，得到的分散均勻的懸濁液。

具體實施過程中，步驟2）玻碳電極的預(yù)處理：將玻碳電極分別在0.3和0.05μm的al2o3粉懸浮液中分別拋光，在二次蒸餾水和乙醇的混合溶液中超聲清洗10min，使其利用循環(huán)伏安法測定時ep1-ep2￡85mv的要求。

具體實施過程中，步驟3）所述納米金粒子的電沉積，是在1%haucl4溶液中，利用計時電流法，將au³⁺還原成au，沉積到電極表面；用二次蒸餾水沖洗10min，除去物理吸附的au，得到納米金沉積電極。

具體實施過程中，步驟4）所述在修飾好的電極上滴加將10μl殼聚糖-普魯士藍-石墨烯復(fù)合物溶液滴加到電極表面，干燥2h；再將10μl100ng/ml的萊克多巴胺抗原溶液滴加到修飾好的電極表面，干燥5小時；滴加10μl0.1%的牛血清白蛋白封閉電極表面的非特異性結(jié)合位點。得到萊克多巴胺電化學(xué)傳感器。

具體實施過程中，步驟5）所述萊克多巴胺電化學(xué)傳感器的兩種試驗條件萊克多巴胺固定抗原濃度、孵育時間進行了優(yōu)化：萊克多巴胺固定抗原濃度為100ng/ml，孵育時間為40min。

具體實施過程中，試驗條件的優(yōu)化：設(shè)置固定抗原濃度分別為10，20，50，100和1000ng/ml，利用電流響應(yīng)值來確定最佳的固定抗原濃度，確定100ng/ml為最佳固定抗原濃度；選取10，20，30，40，50min作為孵育時間，利用電流響應(yīng)值來確定最佳的孵育時間，確定40min為最佳孵育時間；

具體實施過程中萊克多巴胺的檢測：在最優(yōu)條件下：固定抗原濃度為100ng/ml，孵育時間40min，對不同濃度的萊克多巴胺進行電流檢測，并分別建立了萊克多巴胺濃度與響應(yīng)電流之間的線性關(guān)系，得不同濃度的萊克多巴胺的對數(shù)值與響應(yīng)電流之間的線性回歸方程為y=-0.9972x+36.807，相關(guān)系數(shù)為0.995。

實施例1：

一種基于納米材料檢測萊克多巴胺的電化學(xué)傳感器的制備方法，

1）殼聚糖-普魯士藍-石墨烯復(fù)合物的制備：2ml石墨烯分散液在室溫攪拌條件下加到5ml的含6mgfecl3·6h2o,8mgk3fe(cn)6，37mgkcl的水溶液中，用hcl調(diào)節(jié)其ph為1.5。磁力攪拌24h。將混合液離心清洗幾次后，40℃真空干燥12h。稱取復(fù)合物10mg溶于0.5ml的蒸餾水中。稱取0.01g殼聚糖，溶于2ml1%乙酸溶液，得到0.5%的殼聚糖溶液；將0.5wt%殼聚糖與普魯士藍-石墨烯復(fù)合物按1：2（v/v)比例混合，超聲2h。得到殼聚糖-普魯士藍-石墨烯復(fù)合物溶液；

2）玻碳電極的預(yù)處理：將玻碳電極分別在0.3和0.05μm的al2o3粉懸浮液中分別拋光，在二次蒸餾水和乙醇的混合溶液中超聲清洗10min。使其利用循環(huán)伏安法測定時ep1-ep2￡85mv的要求；

3）玻碳電極的修飾：采用計時電流法將納米金粒子電沉積于玻碳電極上，將10μl殼聚糖-普魯士藍-石墨烯復(fù)合物溶液滴加到電極表面，干燥2h。得到納米金/殼聚糖-普魯士藍-石墨烯電極；

4）萊克多巴胺抗原的固定：在上述的電極上將10μl100ng/ml的紅霉素抗原大分子溶液滴加到修飾好的電極表面，干燥5小時；滴加10μl0.1%的牛血清白蛋白封閉電極表面的非特異性結(jié)合位點。

實施例2：

萊克多巴胺電化學(xué)傳感器組裝過程中的電化學(xué)表征

1）運用掃描電子顯微鏡（sem）對修飾有普魯士藍/石墨烯和殼聚糖/普魯士藍/石墨烯的玻碳電極的微觀結(jié)構(gòu)圖進行表征，如圖1和圖2所示，可以看到殼聚糖/普魯士藍/石墨烯懸浮液成功修飾到電極表面;

2）組裝過程中不同電極在50mv/s的掃描速率下和2.0mmk3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6](1:1)溶液的循環(huán)伏安曲線，如圖3所示，納米金和石墨烯、普魯士藍和殼聚糖好的導(dǎo)電性，使得殼聚糖-普魯士藍-石墨烯-納米金電極比裸金電極的電流響應(yīng)要好。當萊克多巴胺抗原固定到電極表面之后，由于抗原的絕緣性，阻礙氧化還原探針到電極表面的擴散，因次，峰電流均呈下降趨勢。上述結(jié)果進一步說明萊克多巴胺抗原已經(jīng)成功的固定到了電極表面。

實施例3：

試驗條件的優(yōu)化

1）固定抗原濃度的優(yōu)化

固定抗原濃度是電化學(xué)傳感器建立過程中比較重要的因素之一，為加大電化學(xué)傳感器檢測的精確度，利用電流響應(yīng)值來確定最佳的固定抗原濃度。如圖4所示，固定抗原濃度分別為10，20，50，100和1000ng/ml。電流隨著固定抗原濃度的增加而減少，直到100ng/ml時電流趨于穩(wěn)定，此時結(jié)合位點上的抗原濃度已經(jīng)飽和，更進一步的濃度增加不會增加電流信號的變化。因此，選擇100ng/ml為最佳固定抗原濃度。

2）孵化時間的優(yōu)化

農(nóng)抗體培養(yǎng)時間不夠可能會導(dǎo)致免疫反應(yīng)的不充足，而過長的培養(yǎng)時間可能會導(dǎo)致抗原或抗體的分離，因此，合適的反應(yīng)時間是保證測定結(jié)果準確的必要條件。如圖5所示，選取10，20，30，40，50min作為培養(yǎng)時間，電流響應(yīng)值隨著培養(yǎng)時間的增加而降低，這是由于抗體抗原反應(yīng)形成的免疫復(fù)合物阻礙了氧化還原探針到電極表面的擴散。而當培養(yǎng)時間大于40min時，電流不再減小，這說明抗體抗原反應(yīng)已經(jīng)徹底完成，沒有新的免疫復(fù)合物形成。因此，選擇40min作為最佳培養(yǎng)時間。

實施例4：

利用所制備的電流型萊克多巴胺傳感器的應(yīng)用

1）傳感器穩(wěn)定性的檢驗

利用5只電極，在相同的條件下，研究了免疫傳感器的重現(xiàn)性和重復(fù)性。在100ng/ml的萊克多巴胺溶液中測定的相對標準偏差范圍為3.6%-5.5%。單支電極連續(xù)5次在100ng/ml的萊克多巴胺溶液中測定的標準偏差為5.6%.

將殼聚糖-普魯士藍-石墨烯-納米金電極在冰箱（4℃）中儲存一周，在同一濃度的紅霉素溶液中檢測傳感電極的穩(wěn)定性。得到的峰電流值沒有顯著地變化，得到的相對偏差值為4.5%，這說明殼聚糖-普魯士藍-石墨烯-納米金構(gòu)建的電化學(xué)傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

2）萊克多巴胺濃度與電流響應(yīng)值間的線性關(guān)系

在優(yōu)化的條件下，利用循環(huán)伏安法檢測不同濃度的萊克多巴胺標準溶液（圖6）。在一定的濃度范圍內(nèi)，電流相應(yīng)值隨著紅霉素標準溶液濃度的增加而減小，這可能是由于在較高濃度的紅霉素溶液中，有更多的紅霉素分子與抗體結(jié)合，即待測的紅霉素濃度越高，結(jié)合到電極上的抗體復(fù)合物就越少。這是由于待測的紅霉素與固定在電極表面的紅霉素競爭抗體，通過抗原抗體的相互作用，結(jié)合到電極表面的抗體量隨著待測抗原濃度的增加而減少。實驗得到的線性曲線如圖7，在0.3-1000ng/ml范圍內(nèi)，紅霉素濃度的對數(shù)值與其響應(yīng)電流呈反比，線性相關(guān)方程為y=-0.9972x+36.807，相關(guān)系數(shù)為0.995，檢測限為0.16ng/ml。

3）檢測豬肉實際樣品

從當?shù)爻匈徺I新鮮的豬肉，洗凈粉碎后，稱取5g樣品，置于50ml離心管里，加入15.0ml乙腈，于振蕩器上劇烈震蕩10min。以4200r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液于另一離心管中，加2.0g氯化鈉和10.0ml正己烷，于震蕩器上劇烈震蕩10min，以4200r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，小心吸取中間乙腈層12.0ml于另一離心管中，氮吹至近干、用pbs緩沖液溶解。在最優(yōu)條件下對樣品進行檢測，樣品中萊克多巴胺的濃度根據(jù)校正曲線算出，其回收率可以達到83.0%-113.1%，如圖8所示。

雖然本發(fā)明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以做各種改動和修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。