本發(fā)明屬于獸藥檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種獸藥制劑中122種非處方成分的篩查方法。
背景技術(shù)：
：獸藥是指用于預(yù)防、治療、診斷動(dòng)物疾病或者有目的地調(diào)節(jié)動(dòng)物生理機(jī)能的物質(zhì)(含藥物飼料添加劑)，主要包括：血清制品、疫苗、診斷制品、微生態(tài)制品、中藥材、中成藥、化學(xué)藥品、抗生素、生化藥品、放射性藥品及外用殺蟲(chóng)劑、消毒劑等。隨著我國(guó)城鎮(zhèn)居民和農(nóng)村居民人均可支配收入水平的不斷提高，肉類消費(fèi)的巨大需求拉動(dòng)我國(guó)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物規(guī)模逐年擴(kuò)大，這直接推動(dòng)獸藥需求的不斷增長(zhǎng)。以我國(guó)gdp、畜牧業(yè)生產(chǎn)總值和我國(guó)獸藥消費(fèi)總額來(lái)分別衡量我國(guó)宏觀經(jīng)濟(jì)的發(fā)展情況、我國(guó)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的養(yǎng)殖規(guī)模和我國(guó)獸藥行業(yè)的需求量，不難發(fā)現(xiàn)，在2010年至2015年之間，這三大指標(biāo)的增長(zhǎng)率間存在十分明顯的正相關(guān)性。隨著我國(guó)畜牧業(yè)產(chǎn)值及其占農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值比例的穩(wěn)步提升，我國(guó)獸藥行業(yè)也進(jìn)入了快速發(fā)展的上升通道。隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖技術(shù)的迅速發(fā)展，獸藥是現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)不可或缺的物質(zhì)基礎(chǔ)，其具有預(yù)防動(dòng)物疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料效率、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)、調(diào)節(jié)養(yǎng)殖生產(chǎn)、保護(hù)生態(tài)環(huán)境等多方面作用，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)起到保障生產(chǎn)、降低成本、增加產(chǎn)量、改善質(zhì)量，提高社會(huì)和生態(tài)效益的功效。但是，目前在獸藥行業(yè)中，不按規(guī)定處方生產(chǎn)，在獸藥中添加非處方成份的現(xiàn)象較為普遍，直接影響到獸藥的安全使用，增加動(dòng)物性食品中藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)而且，引起細(xì)菌耐藥性的增加，對(duì)人體健康造成潛在危害。近年來(lái)，一些獸藥生產(chǎn)企業(yè)違規(guī)在獸藥產(chǎn)品中非法添加化學(xué)藥物，使獸藥能達(dá)到快速有效的結(jié)果，從而提高銷量來(lái)獲得更大的利潤(rùn)。獸藥非法添加行為帶來(lái)了藥物超量使用的中毒風(fēng)險(xiǎn)和藥物殘留隱患，通過(guò)食物鏈傳遞，造成食品安全隱患，給人類健康造成嚴(yán)重的危害。人類長(zhǎng)期攝入含獸藥的動(dòng)物原性食品后，藥物不斷在人體內(nèi)蓄積，就會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒性作用。在臨床診治實(shí)踐中，不斷發(fā)現(xiàn)亂用獸藥給人的身體健康、養(yǎng)殖安全、經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益等帶來(lái)了巨大負(fù)面影響的情況，使得消費(fèi)者不敢吃，不愿吃，不想吃動(dòng)物食品。因此必須采取有效措施，控制獸藥產(chǎn)品的質(zhì)量，制定出獸藥中風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的檢測(cè)方法，為監(jiān)測(cè)提供可靠的技術(shù)手段尤為必要。目前，針對(duì)獸藥中是否添加抗菌藥物檢測(cè)手段中，最常用的有普通高效液相色譜儀和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。然而普通液相色譜法由于分離效率低、分析時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量、同時(shí)檢測(cè)多種抗菌藥物的目的。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法雖然可以做到高通量定性鑒別，但是質(zhì)譜儀造價(jià)昂貴，且獸藥制劑中非法抗菌藥物的濃度較高，遠(yuǎn)超過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)器的線性范圍，也限制了該方法的推廣應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種獸藥制劑中122種非處方成分的篩查方法，為獸用藥品中添加多種抗菌藥物提供了一種完整的檢測(cè)方法，填充了國(guó)家獸用藥品的檢測(cè)方法，增添了獸藥中多種抗菌藥物篩查技術(shù)手段，為國(guó)家畜牧行業(yè)及食品安全提供了安全保障。本發(fā)明的目的是以下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種獸藥制劑中122種非處方藥物的篩查方法，具體包括以下步驟：所述122種非處方藥物為：(a)磺胺類：磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯吡嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺吡啶、磺胺甲氧嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺異噁唑、苯?；前?、磺胺硝苯、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺噻唑、甲氧芐啶、磺胺二甲唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲異嘧啶；(b)β-內(nèi)酰胺類：氨芐西林、苯唑西林、氟氯西林、頭孢噻肟、頭孢噻呋、青霉素g；(c)四環(huán)素類：土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素；(d)酰胺醇類：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考；(e)大環(huán)內(nèi)酯類：泰樂(lè)菌素、替米考星、泰妙菌素、阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、羅紅霉素、吉他霉素a5；(f)林可胺類：林可霉素、克林霉素；(g)氟喹諾酮類：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星、那氟沙星、司帕沙星、諾氟沙星、惡喹酸、培氟沙星、奧比沙星、氟甲喹、萘啶酸、洛美沙星、氧氟沙星、氟羅沙星；(h)喹噁啉類：喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇；(i)硝基呋喃類：呋喃唑酮、呋喃它酮；(j)硝基咪唑類：奧硝唑、地美硝唑、異丙硝唑、塞克硝唑、甲硝唑；(k)抗球蟲(chóng)類：氯苯胍、氯羥吡啶；(l)苯并咪唑類：苯硫胍、氟苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑、芬苯噠唑、奧苯達(dá)唑、奧芬噠唑、噻苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑砜、甲苯達(dá)唑；(m)β-受體激動(dòng)劑：克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、氯丙那林、拉貝特羅、班布特羅、噴布特羅、溴布特羅；(n)鎮(zhèn)靜劑類：氯丙嗪、氟哌利多、氟哌啶醇、阿扎哌隆、異丙嗪、賽拉嗪、硝西泮、地西泮、奮乃近；(o)抗病毒類：金剛烷胺、金剛乙胺、泛昔洛韋；(p)解熱鎮(zhèn)痛類：對(duì)乙酰氨基酚、安乃近；(q)糖皮質(zhì)激素類：地塞米松、氫化可的松；(r)抗膽堿類：氨茶堿、二羥丙茶堿；(s)其他：阿托品；(1)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10mg，于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成1mg/ml各標(biāo)準(zhǔn)貯備液；對(duì)于難溶藥物，恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星加入少量0.1mol/lhcl溶液，洛美沙星加入少量0.1mol/lnaoh溶液，頭孢喹肟、喹乙醇和喹烯酮加適量二甲基亞砜使其溶解后，用甲醇定至刻度；量取各標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.0ml于100ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為10μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液；量取各混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液0.1ml，用乙腈+水(v/v＝50/50)混合液稀釋，制成1μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；(2)待測(cè)樣品的分析前處理：1)粉/散/預(yù)混劑：稱取2±0.02g試樣于50ml聚丙烯離心管中，加入20ml提取液，旋渦0.5min，超聲10min，離心10min，取上清液，用稀釋液稀釋，過(guò)0.22μm微孔尼龍濾膜；2)注射液/溶液：移取2±0.02ml試樣至10ml容量瓶，用提取液定容，超聲10min，用稀釋液稀釋，過(guò)0.22μm微孔尼龍濾膜；3)注射用粉針：取試樣1支，加注射用水溶解，振搖，用稀釋液稀釋，過(guò)0.22μm微孔尼龍濾膜；(3)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立：確定122種非處方藥物的分子式和精確分子量，將非處方成分的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，得到混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的總離子流圖，再把每種藥物的離子色譜圖提取出來(lái)，確定每種藥物的保留時(shí)間；將藥物的分子量和保留時(shí)間輸入msms分析系統(tǒng)，對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行msms分析，得到各藥物的子離子掃描質(zhì)譜圖，并根據(jù)各藥物的碎片的斷裂機(jī)理和斷裂難度，確定各藥物的特征碎片離子；將各藥物的種類、名稱、分子式、保留時(shí)間和特征碎片離子信息匯總，建立122中非處方藥物篩查數(shù)據(jù)庫(kù)，如下表所示：表1數(shù)據(jù)庫(kù)(4)定性分析：1)對(duì)經(jīng)過(guò)步驟(2)所述方法處理的待測(cè)樣品進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，將得到的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，空白溶劑不能出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的離子峰，試樣的母離子及特征碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的一致，偏差均應(yīng)≤0.05da，試樣色譜峰的保留時(shí)間，應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間一致，容許偏差為±0.2min，母離子與碎片離子色譜峰的信噪比(s/n)都在3:1以上，信噪比以峰對(duì)峰(ptp)計(jì)算，全掃描光譜記錄時(shí)，試樣中特征碎片離子的相對(duì)豐度必須超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液參照的特征離子光譜豐度的10％，篩選出滿足定性條件的藥物，即為疑似陽(yáng)性樣品；2)對(duì)于疑似陽(yáng)性樣品，根據(jù)藥物的保留時(shí)間和分子量編輯ms/ms方法，并采集數(shù)據(jù)，所得到的疑似物質(zhì)的子離子掃描質(zhì)譜圖，與標(biāo)準(zhǔn)溶液的子離子掃描質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，在相同的條件和相近的濃度下，試樣中主要碎片離子相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度的允許偏差不超過(guò)下表規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物：表2主要碎片離子相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度的允許偏差所述步驟(3)和步驟(4)中的液相色譜分析條件為：色譜柱：watersuplctmbehc18，2.1mm×100mm，1.7μm；有機(jī)相比例從初始的2％緩慢變化到95％，以保證所有藥物都能有效檢出，梯度洗脫程序見(jiàn)下表：表3色譜梯度洗脫程序注：esi+：a：0.1％甲酸溶液；b：乙腈，梯度洗脫；esi-：a：水；b：乙腈，梯度洗脫；1為即時(shí)變化，6為線性變化。所述步驟(3)中的質(zhì)譜分析條件如下表所示：表4離子源參數(shù)表5篩查質(zhì)譜方法參數(shù)注：亮氨酸腦啡肽實(shí)時(shí)在線分子量校正，分子量為556.2771(esi+)/554.2615(esi-)，掃描時(shí)間0.5s，掃描間隔10s。所述步驟(1)中乙腈和水的混合液中的乙腈和水的體積比為1:1。所述步驟(2)中的提取液為乙腈、甲醇和水混合溶液，乙腈、甲醇和水的體積比為1:1:2。所述步驟(2)中的稀釋液為乙腈和水混合液，乙腈和水的體積比為1:1。還包括對(duì)122種非處方藥物的檢測(cè)限的測(cè)定，測(cè)定方法為：對(duì)于散劑和預(yù)混劑，通過(guò)添加10μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液100μl，經(jīng)提取后測(cè)定，根據(jù)各藥物的信噪比s/n＞3，最終確定各藥物的檢測(cè)限為0.5mg/kg。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明搭建的高通量篩查和定性的檢測(cè)平臺(tái)，使得在本領(lǐng)域內(nèi)從檢測(cè)單一化合物向同時(shí)檢測(cè)多種化合物的方向發(fā)展，與原有的技術(shù)相比，檢測(cè)一種物質(zhì)中多種化合物的技術(shù)手段更加完善，成本降低了很多，極大提高了工作效率。該方法在農(nóng)業(yè)部實(shí)施的獸藥非法添加及細(xì)菌耐藥性計(jì)劃中發(fā)揮了重要的作用。在我國(guó)省級(jí)畜產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心進(jìn)行樣品檢測(cè)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，推廣應(yīng)用樣品數(shù)量共計(jì)萬(wàn)余份。從實(shí)驗(yàn)成本來(lái)說(shuō)，使用高通量篩查方法，大大降低了檢測(cè)成本，縮短了近一半的時(shí)間，經(jīng)濟(jì)效益每年可節(jié)省1000余萬(wàn)元，在食品安全和人類健康方面有不可估量的效益。本發(fā)明應(yīng)用為我國(guó)獸藥產(chǎn)品的質(zhì)量安全提供了安全保障；為我國(guó)畜產(chǎn)品進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)，沖破“綠色貿(mào)易壁壘”的限制提供保障；提高我國(guó)在國(guó)際貿(mào)易中的競(jìng)爭(zhēng)地位，保證我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的安全出口，增加外匯收入，創(chuàng)造良好的經(jīng)濟(jì)效益；同時(shí)對(duì)保證食品生產(chǎn)行業(yè)的健康發(fā)展，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展，維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定，產(chǎn)生巨大社會(huì)效益。本發(fā)明所述的獸藥篩查方法具有高靈敏度和高準(zhǔn)確性，在復(fù)雜多樣的樣品中能夠獲取準(zhǔn)確的化合物信息，專屬性高，實(shí)現(xiàn)“一針多參數(shù)”的檢測(cè)，檢測(cè)效率高。附圖說(shuō)明圖1是混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的總離子流圖(esi+)。圖2是芬苯達(dá)唑的母離子提取離子色譜圖(esi+)。圖3是芬苯達(dá)唑二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖4是甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)溶液特征碎片離子提取色譜圖。圖5是甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)溶液母離子提取色譜圖。圖6是供試品1中甲氧芐啶特征碎片離子提取色譜圖。圖7是供試品1中甲氧芐啶母離子提取色譜圖。圖8是供試品1中甲氧芐啶二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖9是空白溶劑中甲氧芐啶的二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖10是甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)溶液二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖11是對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液特征碎片離子提取色譜圖。圖12是對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液母離子提取色譜圖。圖13是供試品1中對(duì)乙酰氨基酚特征碎片離子提取色譜圖。圖14是供試品1中對(duì)乙酰氨基酚母離子提取色譜圖。圖15是供試品1中對(duì)乙酰氨基酚二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖16是空白溶劑中對(duì)乙酰氨基酚的二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖17是對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖18是乙酰甲喹標(biāo)準(zhǔn)溶液特征碎片離子提取色譜圖。圖19是乙酰甲喹標(biāo)準(zhǔn)溶液母離子提取色譜圖。圖20是供試品2中乙酰甲喹特征碎片離子提取色譜圖。圖21是供試品2中乙酰甲喹母離子提取色譜圖。圖22是供試品2中乙酰甲喹二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖23是空白溶劑中乙酰甲喹的二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖24是乙酰甲喹標(biāo)準(zhǔn)溶液二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖25是林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液母離子提取色譜圖。圖26是林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液特征碎片離子提取色譜圖。圖27是供試品3中林可霉素母離子提取色譜圖。圖28是供試品3中林可霉素特征碎片離子提取色譜圖。圖29是供試品3中林可霉素二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖30是空白溶劑中林可霉素二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。圖31是林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖。具體實(shí)施方式所檢122種非處方藥物為：(a)磺胺類(21種)：磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯吡嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺吡啶、磺胺甲氧嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺異噁唑、苯酰磺胺、磺胺硝苯、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺噻唑、甲氧芐啶(增效劑)、磺胺二甲唑(中間體)、磺胺甲噻二唑(中間體)、磺胺二甲異嘧啶(中間體)；磺胺異噁唑?yàn)槿擞盟幬铮?b)β-內(nèi)酰胺類(6種)：氨芐西林、苯唑西林、氟氯西林、頭孢噻肟、頭孢噻呋、青霉素g；(c)四環(huán)素類(4種)：土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素；(d)酰胺醇類(3種)：氯霉素(人用藥物，獸藥禁用)、甲砜霉素、氟苯尼考；(e)大環(huán)內(nèi)酯類(8種)：泰樂(lè)菌素、替米考星、泰妙菌素、阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、羅紅霉素、吉他霉素a5；阿奇霉素、克拉霉素、羅紅霉素為人用藥物；(f)林可胺類(2種)：林可霉素、克林霉素(人用)；(g)氟喹諾酮類(15種)：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星、那氟沙星、司帕沙星、諾氟沙星、惡喹酸、培氟沙星、奧比沙星、氟甲喹、萘啶酸、洛美沙星、氧氟沙星、氟羅沙星；那氟沙星、司帕沙星、奧比沙星、氟羅沙星為人用藥物；(h)喹噁啉類(4種)：喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇；(i)硝基呋喃類(2種)：呋喃唑酮、呋喃它酮，均為獸藥禁用；(j)硝基咪唑類(5種)：奧硝唑、地美硝唑、異丙硝唑、塞克硝唑、甲硝唑；奧硝唑、異丙硝唑、塞克硝唑、甲硝唑?yàn)槿擞盟幬铮?k)抗球蟲(chóng)類(2種)：氯苯胍、氯羥吡啶；(l)苯并咪唑類(9種)：苯硫胍、氟苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑、芬苯噠唑、奧苯達(dá)唑、奧芬噠唑、噻苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑砜、甲苯達(dá)唑；(m)β-受體激動(dòng)劑(8種)：克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、氯丙那林、拉貝特羅、班布特羅、噴布特羅、溴布特羅；克倫特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、拉貝特羅、班布特羅、噴布特羅、溴布特羅為人用藥物；(n)鎮(zhèn)靜劑類(9種)：氯丙嗪、氟哌利多、氟哌啶醇、阿扎哌隆、異丙嗪、賽拉嗪、硝西泮、地西泮、奮乃近；氟哌利多、氟哌啶醇、奧沙西泮、硝西泮、奮乃近為人用藥物；(o)抗病毒類(3種)：金剛烷胺、金剛乙胺、泛昔洛韋，均為人用藥物；(p)解熱鎮(zhèn)痛類(2種)：對(duì)乙酰氨基酚、安乃近；(q)糖皮質(zhì)激素類(2種)：地塞米松、氫化可的松；(r)抗膽堿類(2種)：氨茶堿、二羥丙茶堿(為人用藥物)；(s)其他(1種)：阿托品。1.標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10mg，于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成1mg/ml各標(biāo)準(zhǔn)貯備液；對(duì)于難溶藥物，恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星加入少量0.1mol/lhcl溶液，洛美沙星加入少量0.1mol/lnaoh溶液，頭孢喹肟、喹乙醇和喹烯酮加適量二甲基亞砜使其溶解后，用甲醇定至刻度；量取各標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.0ml于100ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為10μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液；量取各混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液0.1ml，用乙腈+水(v/v＝50/50)混合液稀釋，制成1μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。2.待測(cè)樣品的分析前處理：2.1樣品采集樣品主要選擇市售樣品，分別從獸藥生產(chǎn)廠家、獸藥經(jīng)營(yíng)門市部和畜禽養(yǎng)殖企業(yè)采集。2.2樣品處理2.2.1粉/散/預(yù)混劑：稱取2g試樣于50ml聚丙烯離心管中，加入20ml提取液，旋渦0.5min，超聲10min，離心10min，取上清液，用稀釋液稀釋，過(guò)0.22μm微孔尼龍濾膜；2.2.2注射液/溶液：移取2ml試樣至10ml容量瓶，用提取液定容，超聲10min，用稀釋液稀釋，過(guò)0.22μm微孔尼龍濾膜；2.2.3注射用粉針：取試樣1支，加注射用水溶解，振搖，用稀釋液稀釋，過(guò)0.22μm微孔尼龍濾膜；注:對(duì)于沒(méi)有標(biāo)注規(guī)格的樣品應(yīng)稀釋1000-10000倍并根據(jù)情況做相應(yīng)的調(diào)整。以獸藥注射液、溶液及可溶性粉等劑型為檢測(cè)對(duì)象，目標(biāo)分析物有110多種，藥物性質(zhì)差別較大，溶劑的選擇至關(guān)重要。參考相關(guān)文獻(xiàn)，我們考察了乙腈、甲醇和水這三種較常用的溶劑。發(fā)現(xiàn)甲醇或乙腈作為稀釋溶劑時(shí)，有些藥物稀釋過(guò)程容易析出，如硫酸慶大霉素用有機(jī)試劑稀釋時(shí)溶液混濁，用水稀釋則澄清。因此，我們選擇不同比例的乙腈+水作為稀釋溶劑。通過(guò)用20％、50％和90％乙腈溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，發(fā)現(xiàn)20％乙腈溶液做稀釋劑時(shí)，有些藥物不穩(wěn)定，容易降解；90％乙腈溶液做稀釋劑時(shí)，有些藥物峰型不好，如阿托品，50％乙腈水作為稀釋溶劑，絕大多數(shù)藥物穩(wěn)定，峰型較好。因此，選擇50％乙腈水溶液為稀釋溶液。獸藥的劑型比較多，而且同一劑型，即使同一品種，處方也差異也很大，而且，獸藥的含量規(guī)格也很多，通常是百分之幾的含量，若獲得近百種藥物的添加試樣比較困難，所以粉散劑、預(yù)混劑的提取受到很大限制。參考相關(guān)文獻(xiàn)，我們考察了乙腈、甲醇和水這三種較常用的溶液。為了提高粉散劑和預(yù)混劑中藥物的溶解性，本實(shí)驗(yàn)分別選用不同比例的乙腈、甲醇、水混合溶液作為提取溶劑。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，最終采用乙腈+甲醇+水(25+25+50)作為粉散劑和預(yù)混劑提取溶劑。對(duì)于可溶性粉劑和注射用粉針，我們根據(jù)藥物的給藥方式，一般選擇用純水做最初的提取溶劑，再用50％乙腈水溶液進(jìn)行稀釋。3.液相色譜條件:考慮到藥物的極性差異較大，實(shí)驗(yàn)采用watersuplctmbehc18(2.1mm×100mm，1.7μm)色譜柱，乙腈-0.1％甲酸水(esi+)、乙腈-水(esi-)作為流動(dòng)相，有機(jī)相比例從初始的2％緩慢變化到95％，以保證所有藥物都能有效檢出，梯度洗脫程序見(jiàn)下表3-1。表3-1色譜梯度洗脫程序注：esi+：a：0.1％甲酸溶液；b：乙腈，梯度洗脫。esi-：a：水；b：乙腈，梯度洗脫。1為即時(shí)變化，6為線性變化。4.質(zhì)譜色譜條件：由于涉及的藥物種類多，且藥物性質(zhì)差異大，不可能每種藥物都達(dá)到最佳檢測(cè)條件。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，最終確定離子源參數(shù)篩查質(zhì)譜方法參數(shù)，如表4-1、表4-2所示，在此條件下，大部分藥物都有較好的響應(yīng)。表4-1離子源參數(shù)表4-2篩查質(zhì)譜方法參數(shù)注：亮氨酸腦啡肽實(shí)時(shí)在線分子量校正，分子量為556.2771(esi+)/554.2615(esi-)，掃描時(shí)間0.5s，掃描間隔10s。5.數(shù)據(jù)庫(kù)的建立：確定122種非處方藥物的分子式和精確分子量，將非處方成分的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，得到混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的總離子流圖，如圖1所示；再把每種藥物的離子色譜圖提取出來(lái)，確定每種藥物的保留時(shí)間，以芬苯達(dá)唑?yàn)槔崛〗Y(jié)果如圖2所示；將藥物的分子量和保留時(shí)間輸入msms分析系統(tǒng)，對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行msms分析，得到各藥物的子離子掃描質(zhì)譜圖，以芬苯達(dá)唑?yàn)槔?，芬苯達(dá)唑的二級(jí)碎片離子掃描質(zhì)譜圖如圖3所示，并根據(jù)各藥物的碎片的斷裂機(jī)理和斷裂難度，確定各藥物的特征碎片離子；將各藥物的種類、名稱、分子式、保留時(shí)間和特征碎片離子信息匯總，建立122中非處方藥物篩查數(shù)據(jù)庫(kù)，如下表所示：表5-1數(shù)據(jù)庫(kù)6.對(duì)經(jīng)過(guò)步驟2所述方法處理的待測(cè)樣品進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定，進(jìn)樣順序?yàn)椋喝軇┛瞻走M(jìn)1針；標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)1針，其rsd<10％，確定系統(tǒng)是否在允許誤差之內(nèi)；溶劑空白進(jìn)1針；樣品1進(jìn)1針；溶劑空白進(jìn)1針；…………交替進(jìn)行；…………試劑空白進(jìn)1針；標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)1針；…………7.定性分析及結(jié)果確證7.1定性分析將步驟6得到的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，空白溶劑不能出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的離子峰，試樣的母離子及特征碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的一致，偏差均應(yīng)≤0.05da，試樣色譜峰的保留時(shí)間，應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間一致，容許偏差為±0.2min，母離子與碎片離子色譜峰的信噪比(s/n)都在3:1以上，信噪比以峰對(duì)峰(ptp)計(jì)算，全掃描光譜記錄時(shí)，試樣中特征碎片離子的相對(duì)豐度必須超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液參照的特征離子光譜豐度的10％，篩選出滿足定性條件的藥物，即為疑似陽(yáng)性樣品。7.2結(jié)果確證對(duì)于疑似陽(yáng)性樣品，根據(jù)藥物的保留時(shí)間和分子量編輯ms/ms方法，并采集數(shù)據(jù)，所得到的疑似物質(zhì)的子離子掃描質(zhì)譜圖，與標(biāo)準(zhǔn)溶液的子離子掃描質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，在相同的條件和相近的濃度下，試樣中主要碎片離子相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度的允許偏差不超過(guò)下表規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物：表7-1主要碎片離子相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度的允許偏差相對(duì)離子豐度(％)>50>20～50>10～20≤10允許的最大偏差(％)±20±25±30±508.樣品檢測(cè)用上述方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表8-1所示，陽(yáng)性結(jié)果見(jiàn)圖4-31。表8-1實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果樣品編號(hào)商品名樣品來(lái)源檢出非處方成分1銀黃提取物注射液養(yǎng)殖場(chǎng)甲氧芐啶，對(duì)乙酰氨基酚2鹽酸沙拉沙星注射液門市部乙酰甲喹3喉炎凈散養(yǎng)殖場(chǎng)林可霉素4甘草顆粒生產(chǎn)廠家未檢出5硫酸新霉素可溶性粉生產(chǎn)廠家未檢出6硫酸粘菌素預(yù)混劑門市部未檢出7注射用青霉素鈉養(yǎng)殖場(chǎng)未檢出9.檢測(cè)限的確定為了不引起儀器的污染，在樣品上機(jī)測(cè)定之前，對(duì)樣品至少稀釋1000倍后測(cè)定。注射液、溶液及可溶性粉經(jīng)提取液稀釋后，上機(jī)測(cè)定的溶液與標(biāo)準(zhǔn)品的溶液基本等同。我們將各種藥物標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)限定為本方法的檢測(cè)限。對(duì)于散劑和預(yù)混劑，通過(guò)添加10μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液100μl，經(jīng)提取后測(cè)定，根據(jù)各藥物的信噪比s/n＞3(按峰對(duì)峰計(jì))，確定本方法的檢測(cè)限，最終確定將本方法各藥物的檢測(cè)限為0.5mg/kg。10.回收率實(shí)驗(yàn)在確定樣品處理方法后，選擇可溶性粉(選用常見(jiàn)的可溶性粉輔料做空白基質(zhì)添加)、中藥散劑(白頭翁散)、注射液(魚(yú)腥草注射液)樣品做為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，做6次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表10-1。表10-1回收率試驗(yàn)結(jié)果以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明整體構(gòu)思前提下，還可以作出若干改變和改進(jìn)，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12