本發(fā)明屬于電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)領(lǐng)域，涉及一種帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學(xué)檢測傳感器。

背景技術(shù)：

肺癌診斷的傳統(tǒng)方法往往依賴于胸片、胸部ct、正電子放射斷層造影術(shù)(pet)、磁共振成像(mri)、痰細(xì)胞學(xué)檢查和活組織檢查等方法，這些方法對癌癥初期亞毫米大小的腫瘤的檢測分辨率都不高，且結(jié)果具有較高的假陽性。近十余年來，隨著高通量、大規(guī)模基因及蛋白質(zhì)分析技術(shù)的涌現(xiàn)，腫瘤基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等研究方興未艾，已篩選出了許多有前景的候選標(biāo)志物(profiles)。其中，一種小型非編碼rna——mirna，在人類體液中穩(wěn)定的存在，被認(rèn)為是最有前景的癌癥早期診斷生物標(biāo)志物。由于mirna的片段短，同源序列多，在血液中的濃度較低以及堿基序列組成的巨大差異，使得要實現(xiàn)無標(biāo)記檢測mirna具有極大的挑戰(zhàn)性的。

因此，科學(xué)家提出了一些mirna的檢測方法來克服這些問題，其中主要選用northern雜交充當(dāng)mirna早期分析的黃金標(biāo)準(zhǔn)。然而，這種方法需要大量的rna樣品和低通量分析，且不適用于大規(guī)模的使用，因此仍然受到技術(shù)上的限制。此外，定量逆轉(zhuǎn)錄實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qrt-pcr)測定法和微陣列技術(shù)已經(jīng)被用于mirna的檢測。然而，這些方法要求擴(kuò)增，交叉雜交，且步驟耗時長，因此容易出錯；而短序列的mirna同樣使得引物的設(shè)計難度加大，從而導(dǎo)致其靈敏度變差。此外，所有這些方法都非常消耗人力，并需要配置完善的實驗室和專業(yè)的、訓(xùn)練有素的操作人員。除了這些傳統(tǒng)的mirna檢測方法，科學(xué)家已經(jīng)開發(fā)了一些無需標(biāo)記的分析方法用作mirna檢測，包括光子微環(huán)諧振器，納米孔，表面增強拉曼光譜和表面等離子體共振。和傳統(tǒng)的技術(shù)相比，這些新興的技術(shù)提高了靈敏度和選擇性，擴(kuò)展了檢測(lod)極限，增加了復(fù)式檢測能力，降低了成本，并實現(xiàn)了小型化。然而，這些方法仍然需要對目標(biāo)mirna進(jìn)行化學(xué)修飾，在生理介質(zhì)中不容易操作，不能進(jìn)行復(fù)式檢測，而且需要昂貴的設(shè)備。這些問題嚴(yán)重地限制了它們在資源極其有限的情況下的即時診斷能力。因此，市場上急需一個平臺可以提供不需要任何放大處理就達(dá)到高靈敏度和特異性，操作流程簡單，并且能夠復(fù)式檢測多種mirna的高通量診斷模式。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學(xué)檢測傳感器。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1.帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學(xué)檢測傳感器，其特征在于，所述傳感器包括電極區(qū)域、電極和連接金線；所述電極區(qū)域由工作電極區(qū)域(9)、參比電極區(qū)域(10)和對電極區(qū)域(8)組成，工作電極區(qū)域上設(shè)有帶dna分子探針石墨烯微電極。

進(jìn)一步，所述工作電極區(qū)域上并列設(shè)置四個帶dna分子探針石墨烯微電極，連接石墨烯電極連接金線(6)，再通過電極夾(5)與電極轉(zhuǎn)向控制器(4)連接至工作電極(2)，四個帶dna分子探針石墨烯微電極共用參比電極(1)和對電極(3)，參比電極和對電極分別通過電極連接金線(11)與參比電極區(qū)域(10)和對電極區(qū)域(8)相接。

進(jìn)一步，所述帶dna分子探針石墨烯微電極所帶dna分子探針序列分別如seqidno：1～seqidno：4所示。

進(jìn)一步，帶dna分子探針石墨烯微電極的制備方法是：將石墨烯微電極的電極導(dǎo)電區(qū)進(jìn)行等離子體清洗預(yù)處理，并且在dna分子探針的5’端修飾二茂鐵分子(ferrocene)，采用物理吸附方式，將dna分子探針固定在石墨烯微電極上，得帶dna分子探針石墨烯微電極。

進(jìn)一步，所述石墨烯微電極的制備方法為：

(1)將硅晶片切割成邊長1～1.5cm的硅片，用王水浸泡、純凈水清洗去除硅片表面污漬；

(2)在步驟(1)處理干凈的硅片表面上，采用化學(xué)氣相沉積方法生長一層600-1000納米的二氧化硅，形成二氧化硅絕緣層，再通過物理氣相沉積將金屬薄膜沉積在二氧化硅絕緣層上；

(3)用光刻技術(shù)剝離圖案化成t字形芯片基板；

(4)采用直接干法或濕法轉(zhuǎn)移3～5層石墨烯到二氧化硅絕緣層表面，石墨烯與t字形金屬薄膜下端部位接觸并覆蓋1-2mm，再在石墨烯層上沉積10納米的二氧化硅，形成鈍化層；

(5)采用圖案化剝離鈍化層，以露出邊長為0.1cm正方形墨烯作為電極導(dǎo)電區(qū)。

進(jìn)一步，所述金屬薄膜為10nm鉻或鈦。

進(jìn)一步，所述金屬薄膜為150nm金或鉑。

進(jìn)一步，所述鈍化層采用氮化硅制備。

2.以上所述石墨烯微電極電化學(xué)檢測傳感器在檢測mirna中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述mirna為：mirna-21、mirna-25、mirna-10b或/和mirna-155。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學(xué)檢測傳感器，可以同時檢測四種不同mirna，達(dá)到高通量檢測目的，檢測快速方便，且具有高靈敏度、高選擇性、高準(zhǔn)確度、無需標(biāo)記等優(yōu)點。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明：

圖1是帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學(xué)檢測傳感器示意圖；其中1為參比電極；2為工作電極；3為對電極；4為電極轉(zhuǎn)向控制器；5為電極夾；6為石墨烯電極連接金線；7為帶dna分子探針石墨烯微電極；8為對電極區(qū)域；9為工作電極區(qū)域；10為參比電極區(qū)域；11為電極連接金線；

圖2是石墨烯微電極制備方法流程圖；

圖3是帶dna分子探針的石墨烯微電極檢測mirna標(biāo)記物示意圖；

圖4是本發(fā)明mirna-10b電化學(xué)檢測電化學(xué)伏安曲線峰電流曲線圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1

石墨烯微電極的制備方法：

(1)將硅晶片切割成1cm*1cm大小的硅片，采用王水浸泡、純凈水清洗去除硅片表面污漬；

(2)在步驟(1)處理干凈的硅片表面上，采用化學(xué)氣相沉積方法生長一層800納米的二氧化硅，形成二氧化硅絕緣層，再通過物理氣相沉積將一層10納米鉻或鈦金屬薄膜沉積在二氧化硅絕緣層上；

(3)用光刻技術(shù)剝離圖案化成t字形0.5cm*0.5cm芯片基板；

(4)采用直接干法轉(zhuǎn)移4層石墨烯到二氧化硅絕緣層表面，石墨烯與t字形金屬薄膜下端部位接觸并覆蓋2mm，再在石墨烯層上沉積10納米的二氧化硅，形成鈍化層；

(5)采用圖案化剝離鈍化層，以露出邊長為0.1cm正方形墨烯作為電極導(dǎo)電區(qū)。

實施例2

(1)將硅晶片切割成1cm*1cm大小的硅片，采用王水浸泡、純凈水清洗去除硅片表面污漬；

(2)在步驟(1)處理干凈的硅片表面上，采用化學(xué)氣相沉積方法生長一層700納米的二氧化硅，形成二氧化硅絕緣層，再通過物理氣相沉積將一層150納米金薄膜沉積在二氧化硅絕緣層上；

(3)用光刻技術(shù)剝離圖案化成t字形0.5cm*0.5cm芯片基板；

(4)采用濕法轉(zhuǎn)移3～5層石墨烯到二氧化硅絕緣層表面，石墨烯與t字形金屬薄膜下端部位接觸并覆蓋1mm，再在石墨烯層上沉積10納米的二氧化硅，形成鈍化層；

(5)采用圖案化剝離鈍化層，以露出邊長為0.1cm正方形石墨烯作為電極導(dǎo)電區(qū)。

以上技術(shù)方案步驟(2)中金薄膜也可采用鉑薄膜代替實現(xiàn)發(fā)明目的，鈍化層可以采用氮化硅制備。

圖2是石墨烯微電極制備方法流程圖。

實施例3

帶dna分子探針石墨烯微電極的制備方法：

將石墨烯微電極的電極導(dǎo)電區(qū)進(jìn)行等離子體清洗，并且在dna分子探針的5’端修飾二茂鐵分子(ferrocene)，采用物理吸附方式將dna分子探針固定在石墨烯微電極上，得到dna分子探針石墨烯微電極。將四種dna分子探針分別固定到石墨烯微電極上，dna分子探針及其檢測mirna的序列如表1所示：

表1dna分子探針序列及其檢測mirna

實施例4

帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學(xué)檢測傳感器

如圖1所示，傳感器為實施例2制備的四個帶dna分子探針石墨烯微電極7并列置于工作電極區(qū)域9，各帶dna分子探針石墨烯微電極7各連接石墨烯電極連接金線6，再通過電極夾5與電極轉(zhuǎn)向控制器4連接至工作電極2，通過電極轉(zhuǎn)向控制器控制電極夾對四個石墨烯電極連接金線的選擇，可分別實現(xiàn)檢測各dna分子探針?biāo)鶛z測的mirna的電化學(xué)伏安曲線；四個帶dna分子探針石墨烯微電極共用參比電極1和對電極3，參比電極和對電極分別通過電極連接金線11與參比電極區(qū)域10和對電極區(qū)域8相接。

1——參比電極；2——工作電極；3——對電極；4——電極轉(zhuǎn)向控制器；5——電極夾；6——石墨烯電極連接金線；7——帶dna分子探針石墨烯微電極；8——對電極區(qū)域；9——工作電極區(qū)域；10——參比電極區(qū)域；11——電極連接金線。

實施例5

肺癌早期標(biāo)記物mirna電化學(xué)伏安曲線分析及肺癌早期篩查和診斷

圖3是帶dna分子探針的石墨烯微電極檢測mirna標(biāo)記物示意圖。

檢測方法：以體液(血液、血清、血漿、唾液或尿液)中的肺癌標(biāo)記物mirna為研究對象，滴定在帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學(xué)檢測傳感器的對電極區(qū)域8、工作電極區(qū)域9和參比電極區(qū)域10，保證各電極區(qū)域和待測體液充分接觸，以備電化學(xué)信號檢測；由電極轉(zhuǎn)向控制器4對四個工作電極進(jìn)行依次選擇，分別獲得四個工作電極上的待測體液的電化學(xué)伏安曲線。

肺癌mirna標(biāo)記物濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：在正常人體液中分別加入一定梯度濃度的早期肺癌mirna標(biāo)記物，并對其電化學(xué)伏安曲線進(jìn)行測試，進(jìn)而繪制出體液中mirna濃度與電化學(xué)伏安曲線峰電流的標(biāo)準(zhǔn)曲線；按照同樣的方法，繪制4種不同的早期肺癌標(biāo)記物mirna濃度與標(biāo)準(zhǔn)電化學(xué)伏安曲線峰電流曲線。

采用方波伏特安培測量法(swv)，在測試范圍0.1v-0.6v，振幅0.025v，頻率25hz，靈敏度1e-5條件下，分別滴加空白緩沖液(trisbuffer:50mmtrisbuffer,150mmnacl,ph7.4indepcwater)和含500nmmirna-10b的樣品液(pbsbuffer：10mmpb,150mmnacl,ph7.4indepcwater)于實施例4所制備的電化學(xué)檢測傳感器上，檢測結(jié)果如圖4所示，在固定了dna分子探針的石墨烯微電極電化學(xué)檢測傳感器上滴上空白的緩沖液時，其電化學(xué)信號峰值僅降低4.2％(小于5％)，當(dāng)傳感器上滴定500nmmirna-10b時(pbsbuffer：10mmpb,150mmnacl,ph7.4indepcwater)，電化學(xué)信號峰值降低了37.3％，表明一定量的肺癌標(biāo)志物mirna與dna分子探針雜化并離開傳感器表面，使得電化學(xué)信號峰值的降低。

早期肺癌的篩查和診斷：以體液(血液、血清、血漿、唾液或尿液)中的肺癌標(biāo)記物mirna為研究對象，滴定在帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學(xué)檢測傳感器的對電極區(qū)域8、工作電極區(qū)域9和參比電極區(qū)域10，保證各電極區(qū)域和待測體液充分接觸，以備電化學(xué)信號檢測；由電極轉(zhuǎn)向控制器4對四個工作電極進(jìn)行依次選擇，分別獲得四個工作電極上的待測體液的電化學(xué)伏安曲線；再與對應(yīng)的標(biāo)記物mirna建立的標(biāo)準(zhǔn)電化學(xué)伏安曲線峰電流曲線進(jìn)行比對分析，獲得四種肺癌早期標(biāo)記物mirna的濃度，并以此濃度為依據(jù)，結(jié)合臨床信息，對早期肺癌進(jìn)行篩查和診斷。

最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。

<110>重慶石墨烯研究院有限公司,中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院

<120>帶dna分子探針的石墨烯微電極電化學(xué)檢測傳感器

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