本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測黃曲霉毒素b1的適配體分子對、試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

黃曲霉毒素是具有強毒性的真菌毒素，可污染玉米、花生等糧食、谷物和食品，動物和人食用被黃曲霉毒素污染的食品后，黃曲霉毒素會造成肝臟損傷、導(dǎo)致癌癥、對動物和人的健康造成重大危害，其中黃曲霉毒素b1(afb1)污染廣泛，毒性最強。檢測黃曲霉毒素b1對于食品安全、食品質(zhì)量控制和人類健康等具有重要意義。常用的一些檢測方法主要包括薄層色譜分析、酶聯(lián)免疫分析、液相色譜分析等方法。這些方法往往需要昂貴的儀器和復(fù)雜的操作步驟。采用免疫抗體的分析方法需要采用免疫抗體作為識別試劑，往往還需要采用黃曲霉素和蛋白偶聯(lián)的抗原，免疫抗體的制備成本高，制備批間重現(xiàn)性差，抗體穩(wěn)定性對溫度比較敏感，抗體試劑的保存和運輸?shù)臈l件要求高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種檢測黃曲霉毒素b1的適配體分子對、試劑盒及其檢測方法，以期解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的至少部分技術(shù)問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種檢測黃曲霉毒素b1的適配體分子對，其是如下的分子對：

(1)序列如seqidno.1所示核酸分子的5’端經(jīng)fam(fluorescein，熒光素)標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.4所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1(blackholequencher-1)標(biāo)記得到的分子組成的分子對；或

(2)序列如seqidno.1所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.5所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對；或

(3)序列如seqidno.2所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.6所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對；或

(4)序列如seqidno.2所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.7所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對；或

(5)序列如seqidno.3所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.8所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對。

上述技術(shù)方案換一種表述方式如下：一種檢測黃曲霉毒素b1的適配體分子對，其是如下的分子對：

由seqidno.1所示分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記與seqidno.4或seqidno.5所示分子的3’端經(jīng)bhq-1標(biāo)記所得分子組成的分子對，或者是由seqidno.2所示分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記與seqidno.6或seqidno.7所示分子的3’端經(jīng)bhq-1標(biāo)記所得分子組成的分子對，或者是由seqidno.3所示分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記與seqidno.8所示分子的3’端經(jīng)bhq-1標(biāo)記所得分子組成的分子對。

本發(fā)明還提供一種檢測黃曲霉毒素b1的試劑盒，其包括上述的適配體分子對。

本發(fā)明還提供一種檢測黃曲霉毒素b1的方法，其是將上述適配體分子對與待測樣本混合后溫育，測定熒光強度值。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：

本發(fā)明采用核酸適配體作為特異性識別黃曲霉毒素b1的親和配體，不同于以往利用免疫抗體檢測黃曲霉毒素的分析方法。核酸適配體具有易制備、穩(wěn)定性高、易引入熒光標(biāo)記等優(yōu)點。熒光檢測技術(shù)具有靈敏、簡單、快速、無需分離等優(yōu)點。本發(fā)明的產(chǎn)品和方法在應(yīng)用時，采用熒光染料標(biāo)記的核酸適配體和猝滅劑修飾的短鏈核酸所構(gòu)成的熒光開關(guān)方法，具有熒光背景低，熒光變化顯著，熒光增強倍數(shù)高、檢測靈敏度高等優(yōu)勢。本發(fā)明的檢測限可達(dá)到0.2nm。

附圖說明

圖1顯示實施例1中采用熒光素標(biāo)記的核酸適配體af31-5f和bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸分子af31-c13b或af31-c14b檢測不同濃度的黃曲霉毒素b1的結(jié)果。

圖2顯示實施例2中采用熒光素標(biāo)記的核酸適配體af29-5f和bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸分子af29-c14b或af29-c13b檢測不同濃度的黃曲霉毒素b1的結(jié)果。

圖3顯示實施例3中采用熒光素標(biāo)記的核酸適配體af27-5f和bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸分子af27-c14b檢測不同濃度的黃曲霉毒素b1的結(jié)果。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，并參照附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

核酸適配體是從寡聚核苷酸文庫中篩選得到的可高親和力高選擇性識別目標(biāo)分子的單鏈核酸分子。核酸適配體的出現(xiàn)為檢測黃曲霉毒素提供了新的研究手段。作為核酸類的親和配體，核酸適配體在分析檢測領(lǐng)域的應(yīng)用具有很多優(yōu)點，如合成制備方便，熱穩(wěn)定性高，易于引入功能團如熒光染料標(biāo)記等。核酸適配體在親和力和選擇性方面都可以和免疫抗體相媲美，核酸適配體的分析方法可以克服免疫分析中免疫抗體的在穩(wěn)定性和制備等方面的一些局限，顯示出潛力，核酸適配體的應(yīng)用也受到廣泛的關(guān)注，在分析傳感領(lǐng)域顯示出很大的潛力和應(yīng)用前景。

本申請的發(fā)明人基于本領(lǐng)域的現(xiàn)狀，經(jīng)過大量的實驗探究和反復(fù)的實踐驗證，終于發(fā)現(xiàn)能夠檢測黃曲霉毒素b1的dna核酸適配體及與其配對使用的互補短鏈核酸分子，并將其開發(fā)制備成試劑盒應(yīng)用于實際檢測中，從而得到了本發(fā)明。本發(fā)明的dna核酸適配體可以與黃曲霉毒素b1選擇性作用，具有很強的親和力，利用核酸適配體可以發(fā)展檢測黃曲霉毒素b1的檢測方法。

本發(fā)明的原理是：熒光素(fluorescein，簡稱fam)標(biāo)記的核酸適配體與猝滅劑bhq-1(blackholequencher-1)標(biāo)記的互補短鏈核酸雜交，由于熒光素和猝滅劑靠近，熒光素的熒光被猝滅。當(dāng)黃曲霉毒素b1存在時，fam標(biāo)記的核酸適配體與黃曲霉毒素b1結(jié)合，bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸不與fam標(biāo)記的核酸適配體雜交，bhq-1遠(yuǎn)離fam，fam的熒光恢復(fù)。隨著黃曲霉毒素b1的加入，fam標(biāo)記的核酸適配體熒光強度逐漸增加，從而實現(xiàn)對黃曲霉毒素b1的檢測。

本發(fā)明提供的檢測黃曲霉毒素b1的適配體分子對，其是如下的分子對：

(1)序列如seqidno.1所示核酸分子的5’端經(jīng)fam(fluorescein，熒光素)標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.4所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1(blackholequencher-1)標(biāo)記得到的分子組成的分子對；或

(2)序列如seqidno.1所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.5所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對；或

(3)序列如seqidno.2所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.6所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對；或

(4)序列如seqidno.2所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.7所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對；或

(5)序列如seqidno.3所示核酸分子的5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子與序列如seqidno.8所示核酸分子的3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子組成的分子對。

本發(fā)明提供的檢測黃曲霉毒素b1的試劑盒，其包括上述的適配體分子對。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽性對照黃曲霉毒素b1。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括ph為6～10的結(jié)合緩沖液，更優(yōu)選地，所述結(jié)合緩沖液的ph為7.5，包括10mmtris-hcl、50mmmgcl2、50mmnacl和0.1％tween20。

本發(fā)明提供的黃曲霉毒素b1的檢測方法，其是將上述適配體分子對與待測樣本混合后溫育，測定熒光強度值。

其中，優(yōu)選地，所述適配體分子對的使用濃度為50～100nm，更優(yōu)選地，其中，5’端經(jīng)fam標(biāo)記得到的分子的使用濃度為50nm，3’端經(jīng)猝滅劑bhq-1標(biāo)記得到的分子的使用濃度為100nm。

優(yōu)選地，所述待測樣本進(jìn)行預(yù)處理，即將待測的樣本采用結(jié)合緩沖溶液稀釋。

優(yōu)選地，所述溫育的溫度為2～8℃，更優(yōu)選地，所述溫育的溫度為4℃。

優(yōu)選地，所述溫育是在ph為6～10的結(jié)合緩沖液中進(jìn)行，更優(yōu)選地，所述結(jié)合緩沖液的ph為7.5，包括10mmtris-hcl、50mmmgcl2、50mmnacl和0.1％tween20。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

下面列舉一些具體實施例，以對本發(fā)明的實施和技術(shù)效果作更進(jìn)一步的說明。

下述具體實施例中，檢測所用的激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為528nm，狹峰寬度均為5nm。適配體分子對由生工生物工程(上海)股份有限公司合成純化。

實施例1：采用熒光素(fam)標(biāo)記的核酸適配體af31-5f和bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸分子af31-c13b或af31-c14b檢測黃曲霉毒素b1

fam標(biāo)記的核酸適配體af31-5f的序列為seqidno.1(5’-tggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcc-3’)，5’端標(biāo)記fam。bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸af31-c14b的序列為seqidno.4(5'-gacaacacgtgcca-3')，3’端標(biāo)記bhq-1。bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸af31-c13b序列為seqidno.5(5'-acaacacgtgcca-3')，3’端標(biāo)記bhq-1。在結(jié)合緩沖溶液(10mmtris-hcl(ph7.5)、50mmmgcl2、50mmnacl、0.1％tween20)中，af31-5f(50nm)與af31-c14b(100nm)或af31-c13b(100nm)以及黃曲霉毒素b1溫育，然后測fam的熒光強度(激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為528nm)。隨著黃曲霉毒素b1的加入，熒光強度逐漸增強。黃曲霉毒素b1的檢測限為0.2nm，結(jié)果如圖1所示。

實施例2：采用熒光素(fam)標(biāo)記的核酸適配體af29-5f和bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸分子a29-c14b或a29-c13b檢測黃曲霉毒素b1

fam標(biāo)記的核酸適配體af29-5f序列為seqidno.2(5'-tgcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcc-3')，fam標(biāo)記在序列的5’端。bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸af29-c14b序列為seqidno.6(5'-agacaacacgtgca-3')，猝滅劑bhq-1標(biāo)記在序列的3’端。bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸af29-c13b序列為seqidno.7(5'-gacaacacgtgca-3')，bhq-1標(biāo)記在序列的3’端。在結(jié)合緩沖溶液(10mmtris-hcl(ph7.5)、50mmmgcl2、50mmnacl、0.1％tween20)中，af29-5f(50nm)與af29-c14b(100nm)或af29-c13b(100nm)以及黃曲霉毒素b1溫育，然后測fam的熒光強度(激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為528nm)。隨著黃曲霉毒素b1的加入，熒光強度逐漸增強，結(jié)果如圖2所示。

實施例3：采用熒光素(fam)標(biāo)記的核酸適配體af27-5f和bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸分子af27-c14b檢測黃曲霉毒素b1

fam標(biāo)記的核酸適配體af27-5f序列為seqidno.3(5’-tcacgtgttgtctctctgtgtctcgtg-3’)，fam標(biāo)記在序列的5’端。bhq-1標(biāo)記的短鏈核酸a27-c14b的序列為seqidno.8(5’-gagacaacacgtga-3’)，猝滅劑bhq-1標(biāo)記在序列的3’端。在結(jié)合緩沖溶液(10mmtris-hcl(ph7.5)、50mmmgcl2、50mmnacl、0.1％tween20)中，af27-5f(50nm)與af27-c14b(100nm)以及黃曲霉毒素b1溫育，然后測fam的熒光強度(激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為528nm)。隨著黃曲霉毒素b1的加入，熒光強度逐漸增強，結(jié)果如圖3所示。

上述實施例的結(jié)果說明，本發(fā)明檢測所用的適配體分子對和檢測方法對目標(biāo)分子的響應(yīng)特異性強，檢測精度高，檢測限低。

綜上所述，本發(fā)明提供的檢測黃曲霉毒素b1的適配體分子對、試劑盒及其檢測方法為檢測黃曲霉毒素b1提供了新的技術(shù)手段，本發(fā)明的適配體分子對具有易合成、易標(biāo)記、成本低、穩(wěn)定性高等優(yōu)點，具有非常好的應(yīng)用前景。

以上所述的具體實施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心

<120>檢測黃曲霉毒素b1的適配體分子對、試劑盒及其檢測方法

<130>ib177076

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>af31-5f

<400>1

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<210>2

<211>30

<212>dna

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<220>

<223>af29-5f

<400>2

tgcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcc30

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>af27-5f

<400>3

tcacgtgttgtctctctgtgtctcgtg27

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列

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<400>4

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列

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<223>af29-c14b

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<212>dna

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<223>af29-c13b

<400>7

gacaacacgtgca13

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<211>14

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<400>8

gagacaacacgtga14