本發(fā)明屬于鈣離子跨膜流動檢測方法技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種非損傷檢測腦片神經(jīng)元鈣離子跨膜流動的方法。

背景技術(shù)：

ca²⁺作為細(xì)胞內(nèi)一種重要的第二信使，參與神經(jīng)細(xì)胞的一系列活動，對神經(jīng)細(xì)胞的代謝和功能產(chǎn)生廣泛的影響。安靜情況下，神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離ca²⁺的濃度很低，這使得細(xì)胞在受到刺激時能夠通過顯著的ca²⁺內(nèi)流改變功能活動。當(dāng)大量ca²⁺流入神經(jīng)元內(nèi)可使胞內(nèi)出現(xiàn)鈣超載，繼而激活某些磷脂酶、蛋白酶、內(nèi)切酶和一氧化氮合酶等，損害神經(jīng)元功能，最終使神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡或死亡。為維持細(xì)胞內(nèi)的ca²⁺穩(wěn)態(tài)，神經(jīng)元主要是通過質(zhì)膜鈉鈣交換體(na⁺/ca²⁺exchanger；ncx)和質(zhì)膜鈣離子atp酶(plasmamembranecalciumatpase；pmca)兩種途徑實(shí)現(xiàn)質(zhì)膜對ca²⁺的主動轉(zhuǎn)運(yùn)，即ca²⁺外排。因此在神經(jīng)科學(xué)的研究中，對生理和病理狀態(tài)下神經(jīng)元跨膜ca²⁺流的動態(tài)變化進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，不僅可以幫助了解細(xì)胞維持ca²⁺穩(wěn)態(tài)和正常功能活動的原理，也有助于揭示ca²⁺信號擾亂相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制。目前，測定神經(jīng)元跨膜ca²⁺流的技術(shù)手段主要有：細(xì)胞內(nèi)離子成像和電生理記錄膜電流。然而，受技術(shù)所限，這些方法均有不到之處。細(xì)胞內(nèi)ca²⁺離子成像需要使用能與ca²⁺結(jié)合的光敏染料(如fura-2/am和fluo-4/am等)，但存在熒光染料對細(xì)胞活性的影響、熒光染料隨著時間的延長有不同程度的淬滅等缺點(diǎn)，且僅限于在培養(yǎng)細(xì)胞水平上觀察胞內(nèi)的ca²⁺變化。電生理技術(shù)可以直接測定跨膜ca²⁺電流，但該技術(shù)僅限于單一離子通道的記錄和分析，不適合從整體上分析跨膜分子/離子的信息，并且存在封接成功率低、破膜過程會對細(xì)胞產(chǎn)生損害而記錄時間短和封接不穩(wěn)等問題。

非損傷微測技術(shù)(non-invasivemicro-testtechnique，nmt)是近年發(fā)展起來的一種以非接觸方式直接獲取離子跨膜內(nèi)流或外流流速的最新技術(shù)手段，其根據(jù)fick第一擴(kuò)散定律和nernst方程，通過檢測細(xì)胞外兩點(diǎn)間電位差的改變從而測得緊鄰細(xì)胞膜的胞外離子變化情況。其優(yōu)勢在于：測量時，微電極不接觸被測樣品，不會對樣品造成任何損傷；其空間分辨率高，可實(shí)現(xiàn)微米級的測量；測量數(shù)據(jù)精度高，對離子流動速率的測量可達(dá)到picomole·cm^-2·sec^-1。然而，目前針對動物組織特別是腦組織進(jìn)行的nmt實(shí)時、動態(tài)ca²⁺流研究尚未見報道，特別是記錄ca²⁺外排的研究尚未見報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，為開展實(shí)驗(yàn)動物腦功能的跨膜ca²⁺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究提供新的技術(shù)手段，本發(fā)明提供一種非損傷檢測腦片神經(jīng)元鈣離子跨膜流動的方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。

一種非損傷檢測腦片神經(jīng)元鈣離子跨膜流動的方法，它包括測試電極與參比電極，所述測試電極中測試電極絲的材質(zhì)為agcl絲，參比電極材質(zhì)為ag/agcl固態(tài)電極，按以下步驟依次進(jìn)行：

a、測試電極的設(shè)置：

測試電極還包括錐形管，首先，向錐形管尖嘴部填充ca²⁺液態(tài)離子交換劑；其次，再向錐形管中添加ca²⁺電解質(zhì)溶液；最后，將測試電極絲從錐形管圓口端插入錐形管內(nèi)并與電解質(zhì)溶液接觸，形成測試電極；

b、測試電極與參比電極位置的設(shè)置：

在培養(yǎng)皿上方設(shè)置電極固定架，所述參比電極固定設(shè)置于電極固定架的一端，參比電極下端部延伸至培養(yǎng)皿內(nèi)部并可以與腦片營養(yǎng)液接觸；測試電極設(shè)置于電極固定架的另一端，測試電極與驅(qū)動裝置連接，驅(qū)動裝置精確驅(qū)動測試電極產(chǎn)生位移；測試電極與參比電極之間通過電位測試裝置連接；

c、電壓/濃度校正曲線的獲得：為保證測試電極正常工作，在待測范圍內(nèi)以10為倍數(shù)改變濃度作為常規(guī)背景濃度，采用含有3毫摩爾ca²⁺的人工腦脊液作為測試電極的校正液a，含有0.3毫摩爾ca²⁺的人工腦脊液作為校正液b，分別將測試電極和參比電極一起放入校正液a或者校正液b中，分別獲得校正液a中的電極電位值和校正液b中的電極電位值，通過nernst方程獲取電壓/濃度校正曲線；

d、ca²⁺跨膜運(yùn)動的觀測及ca²⁺流動速率的確定：首先，在培養(yǎng)皿中分別添加含淀粉樣β蛋白的正常ca²⁺濃度的人工腦脊液或者低ca²⁺濃度的人工腦脊液作為測試液；其次，取腦片置于培養(yǎng)皿中；再次，將參比電極放入測試液中，并將測試電極移動至腦片的近端位置，通過驅(qū)動裝置驅(qū)動測試電極移動至腦片的遠(yuǎn)端位置，獲得位移差dx，同時采集近端位置與遠(yuǎn)端位置電極電位差dv，然后通過電壓/濃度校正曲線得出近端位置與遠(yuǎn)端位置之間ca²⁺的濃度差dc，將濃度差dc和位移差dx代入fick第一擴(kuò)散定律公式j(luò)＝-d·dc/dx，式中d為離子/分子特異的擴(kuò)散常數(shù)，其單位是cm^-2·sec^-1；j為ca²⁺的流動速率，其單位為picomole·cm^-2·sec^-1，其中j正值代表ca²⁺外排，負(fù)值代表ca²⁺內(nèi)流。

進(jìn)一步地，所述測試液為急性給予的濃度分別為含10微摩爾、30微摩爾、50微摩爾的31-35片段淀粉樣β蛋白的人工腦脊液。

進(jìn)一步地，所述測試液為急性給予的細(xì)胞外低鈣人工腦脊液，其中ca²⁺濃度為0.35毫摩爾。

進(jìn)一步地，所述測試液為濃度為含50微摩爾的31-35片段淀粉樣β蛋白的人工腦脊液，將腦片放入所述測試液中并記錄2分鐘時間內(nèi)測試液的基礎(chǔ)流速，然后給予細(xì)胞外低鈣人工腦脊液。

進(jìn)一步地，所述測試液為質(zhì)膜鈣泵抑制劑或質(zhì)膜鈉鈣交換體抑制劑預(yù)處理后給予細(xì)胞外低鈣人工腦脊液。

進(jìn)一步地，所述步驟a中ca²⁺液態(tài)離子交換劑的添加量的高度為40～50微米，添加的ca²⁺電解質(zhì)溶液的添加量的高度為1厘米。

進(jìn)一步地，所述電解質(zhì)溶液為cacl2溶液，其濃度為100毫摩爾cacl2。

進(jìn)一步地，所述步驟b中驅(qū)動裝置驅(qū)動測試電極與腦片之間的距離為50微米。

進(jìn)一步地，所述步驟d中測試電極沿豎直方向進(jìn)行自動往復(fù)式運(yùn)動的距離為30微米，采樣頻率為0.3赫茲。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果。

本發(fā)明利用nmt方法對小鼠海馬神經(jīng)元鈣離子跨膜流動進(jìn)行觀測，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，

1)aβ對小鼠海馬神經(jīng)元鈣離子穩(wěn)態(tài)的擾亂，不僅涉及到ca²⁺內(nèi)流增加，也與ca²⁺外排的抑制有關(guān)，兩者共同作用可能加速了細(xì)胞的鈣超載；

2)nmt可方便、實(shí)時、動態(tài)且非損傷性地用于檢測動物腦組織細(xì)胞的ca²⁺內(nèi)流或ca²⁺外排。因此，本研究為探討aβ神經(jīng)毒性作用機(jī)制的鈣超載學(xué)說提供了又一新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)；同時，本實(shí)驗(yàn)在檢測動物腦組織跨膜ca²⁺流中顯示出的快速、方便和非損傷特征，特別是低ca²⁺液可靠誘發(fā)ca²⁺外排的結(jié)果也為開展腦功能ca²⁺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究提供了一個新的技術(shù)方法和手段。

附圖說明

圖1為基于nmt法測定海馬腦片ca²⁺跨膜流動的測定原理示意圖；

圖中，1為測試電極，11為測試電極絲，12為錐形管，2為參比電極；其中實(shí)線繪制的測試電極表示測試電極處于腦片的近端位置，虛線繪制的測試電極表示測試電極處于腦片的遠(yuǎn)端位置，dx表示腦片近端位置與遠(yuǎn)端位置之間的位移差，dv表示腦片近端位置與遠(yuǎn)端位置之間的電位差。

圖2為ca²⁺選擇測試電極尖端充灌了lix之后的顯微鏡照片圖。

圖3為ca²⁺選擇測試電極移動至腦片邊緣時的顯微鏡照片圖。

圖4為ca²⁺選擇測試電極移動至海馬腦片ca1區(qū)正上方時的顯微鏡照片圖。

圖5為正常人工腦脊液中急性給予不同濃度aβ31-35誘發(fā)海馬腦片ca1區(qū)神經(jīng)元ca²⁺內(nèi)流的趨勢圖。

圖6為不同濃度aβ31-35誘發(fā)海馬腦片ca1區(qū)神經(jīng)元ca²⁺內(nèi)流的統(tǒng)計(jì)直方圖。

圖7為經(jīng)aβ或tfh或kb-r7943處理后，腦片在低鈣人工腦脊液中ca²⁺外流的趨勢圖。

圖8為經(jīng)aβ或tfh或kb-r7943處理后，腦片在低鈣人工腦脊液中下ca²⁺外流的統(tǒng)計(jì)直方圖。

圖中，^＊的含義為p<0.05，^＊＊＊的含義為p<0.001，p的含義為根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)中顯著性檢驗(yàn)方法計(jì)算得到顯著性水平，對照的含義為正常人工腦脊液，藥物的含義為aβ或者為tfh或者為kb-r7943。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)說明：本實(shí)施例是以本發(fā)明技術(shù)方案為前提進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下面的實(shí)施例。

本發(fā)明應(yīng)用nmt方法檢測了aβ31-35寡聚體對c57bl/6小鼠海馬腦片ca1區(qū)神經(jīng)元谷氨酸(glutamate，glu)誘發(fā)的ca²⁺內(nèi)流以及細(xì)胞外液低鈣引起的ca²⁺外排，并初步探討了aβ擾亂神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)的相關(guān)機(jī)制。

實(shí)施例一

如圖1～圖4所示，為非損傷微測技術(shù)測定海馬腦片鈣離子流的電極推進(jìn)過程和測定原理示意圖。一種非損傷檢測腦片神經(jīng)元鈣離子跨膜流動的方法，它包括測試電極1與參比電極2，所述測試電極1中測試電極絲11的材質(zhì)為為agcl絲，參比電極2材質(zhì)為ag/agcl固態(tài)電極，按以下步驟依次進(jìn)行：

a、測試電極1的設(shè)置：

測試電極1包括錐形管12，首先，向錐形管12尖嘴部填充ca²⁺液態(tài)離子交換劑，添加量的高度為40～50μm(μm即微米)；其次，再向錐形管12中添加ca²⁺電解質(zhì)溶液，添加量的高度為1cm(cm即厘米)；最后，將測試電極絲11從錐形管12圓口端插入錐形管12內(nèi)并與電解質(zhì)溶液接觸，形成測試電極1；所述電解質(zhì)溶液為cacl2溶液，其濃度為100mm(mm即毫摩爾)cacl2；

b、測試電極1與參比電極2位置的設(shè)置：

在培養(yǎng)皿上方設(shè)置電極固定架，所述參比電極2固定設(shè)置于電極固定架的一端，參比電極2下端部延伸至培養(yǎng)皿內(nèi)部并可以與腦片營養(yǎng)液接觸；測試電極1設(shè)置于電極固定架的另一端，測試電極1與驅(qū)動裝置連接，驅(qū)動裝置精確驅(qū)動測試電極1產(chǎn)生位移；測試電極1與參比電極2之間通過電位測試裝置連接；

c、電壓/濃度校正曲線的獲得：為保證測試離子選擇性電極正常工作，在待測范圍內(nèi)以10為倍數(shù)改變濃度作為常規(guī)背景濃度。采用含有3mmca²⁺的人工腦脊液作為測試電極1的校正液a，含有0.3mmca²⁺的人工腦脊液作為校正液b。分別將測試電極1和參比電極2一起放入校正液a或者校正液b中，分別獲得校正液a的電極電位值和校正液b的電極電位值，通過nernst方程獲取電壓/濃度校正曲線；

d、ca²⁺跨膜流動的觀測及ca²⁺流動速率的確定：首先，在培養(yǎng)皿中添加測試液為急性給予的濃度分別由31-35片段的淀粉樣β蛋白溶液；其次，取腦片置于培養(yǎng)皿中；再次，將參比電極2放入測試液中，并將測試電極1移動至腦片的近端位置，驅(qū)動裝置驅(qū)動測試電極1與腦片之間的距離為50μm，通過驅(qū)動裝置勻速驅(qū)動測試電極1移動至遠(yuǎn)端位置，并以固定距離30μm在豎直方向進(jìn)行自動往復(fù)式運(yùn)動，設(shè)定驅(qū)動裝置移動頻率為0.3hz(hz即赫茲)即采樣頻率，獲得位移差dx，同時分別采集近端位置與遠(yuǎn)端位置電極電位，獲得電位差dv。然后通過電壓/濃度校正曲線得出近端位置與遠(yuǎn)端位置之間ca²⁺的濃度差dc，將濃度差dc和位移差dx代入fick第一擴(kuò)散定律公式j(luò)＝-d·dc/dx，式中d為離子/分子特異的擴(kuò)散常數(shù)，其單位是cm^-2·sec^-1；j為ca²⁺的流動速率，其單位為picomole·cm^-2·sec^-1，其中j正值代表ca²⁺外排，負(fù)值代表ca²⁺內(nèi)流。

實(shí)施例二

如圖5～6所示為非損傷微測技術(shù)測定急性給予不同濃度aβ31-35引起海馬腦片ca1區(qū)神經(jīng)元ca²⁺內(nèi)流流速圖和直方圖。本實(shí)施例二中測試液為正常人工腦脊液和含不同濃度(10μm、30μm、50μm)(μm即微摩爾)的31-35片段淀粉樣β蛋白的人工腦脊液。操作步驟與實(shí)施例一相同，獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行如下分析：在正常人工腦脊液中，海馬腦片ca1區(qū)神經(jīng)元未記錄到明顯的ca²⁺內(nèi)流或外流。急性給予不同濃度的aβ31-35誘發(fā)了海馬腦片神經(jīng)元出現(xiàn)先快后慢的內(nèi)向跨膜ca²⁺流，并具有持續(xù)穩(wěn)定的特征，如圖5展現(xiàn)了ca²⁺流的趨勢。如圖6顯示的統(tǒng)計(jì)直方圖，與對照組5分鐘內(nèi)ca²⁺流速(2.912±2.466picomole·cm^-2·sec^-1)相比，10μm、30μm和50μmaβ31-35組給藥后5分鐘內(nèi)出現(xiàn)的內(nèi)向ca²⁺流平均流速分別為-32.262±17.347picomole·cm^-2·sec^-1(n＝12)(p>0.05)、-129.838±26.610picomole·cm^-2·sec^-1(n＝14)(p<0.05)和-310.297±35.231picomole·cm^-2·sec^-1(n＝15)(p<0.001)，表明aβ31-35誘發(fā)的海馬腦片ca1區(qū)神經(jīng)元跨膜ca²⁺內(nèi)流具有濃度依賴性(p<0.05)。

實(shí)施例三

如圖7～8所示為非損傷微測技術(shù)測定aβ31-35聯(lián)合kb-r7943或tfh預(yù)處理后給予低鈣人工腦脊液(artificialcerebrospinalfluid，acsf)誘發(fā)的海馬腦片神經(jīng)元ca²⁺外流流速圖和直方圖。本實(shí)施例三中測試液為分別含50μm的31-35片段淀粉樣β蛋白、tfh(質(zhì)膜鈣泵抑制劑)、kb-r7943(質(zhì)膜鈉鈣交換體抑制劑)的正常人工腦脊液和低鈣人工腦脊液(含0.35mmca²⁺的人工腦脊液)。操作步驟與實(shí)施例一相同，獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行如下分析：

圖7中實(shí)心圓點(diǎn)顯示在正常人工腦脊液中(正常對照組)基礎(chǔ)狀態(tài)下2分鐘內(nèi)的腦片ca²⁺流速接近零水平，給予vehicle(正常人工腦脊液)后5分鐘內(nèi)ca²⁺流速平均值也基本沒有變化(0.837±0.499picomole·cm^-2·sec^-1，n＝10)；空心圓點(diǎn)顯示給予低鈣人工腦脊液(對照+低鈣液)急性灌流腦片，可引起海馬ca1區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生明顯的外向ca²⁺流，峰值快速達(dá)到5186.969±300.595picomole·cm^-2·sec^-1，隨后逐漸回落但保持持續(xù)性外向ca²⁺流，5分鐘時基本穩(wěn)定在3337.39±231.405picomole·cm^-2·sec^-1上下；實(shí)心三角形顯示aβ31-35寡聚體預(yù)處理可部分抑制低鈣人工腦脊液引起的ca²⁺的外排；空心三角形顯示質(zhì)膜鈣泵抑制劑預(yù)處理可部分抑制低鈣人工腦脊液引起的ca²⁺的外排；實(shí)心正方形顯示低鈣人工腦脊液引起的ca²⁺的外排可被質(zhì)膜鈉鈣交換體拮抗劑kb-r7943大部分阻斷。

圖8顯示了各組在5分鐘內(nèi)的平均ca²⁺外排流速的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較直方圖。單純低鈣人工腦脊液(對照+低鈣液)誘發(fā)的ca²⁺外排5分鐘內(nèi)平均流速為3867.868±244.502picomole·cm^-2·sec^-1(p<0.001)。aβ31-35(50μm)預(yù)處理(aβ+低鈣液)可部分阻斷這種低鈣人工腦脊液誘發(fā)的ca²⁺外排，5分鐘內(nèi)平均ca²⁺流速只有2541.532±440.146picomole·cm^-2·sec^-1(p<0.05，n＝11)。接著，我們用質(zhì)膜鈣泵阻斷劑tfh或質(zhì)膜鈉鈣交換體阻斷劑kb-r7943分別預(yù)處理，以檢查這種低鈣人工腦脊液誘發(fā)的ca²⁺外流機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)，兩種阻斷劑在正常人工腦脊液中并不影響基礎(chǔ)性的ca²⁺流，但用tfh(100μm)預(yù)處理(tfh+低鈣液)后，低鈣人工腦脊液引起的ca²⁺流速較tfh未處理組明顯減少，平均流速降低到1954.733±327.616picomole·cm^-2·sec^-1(p<0.001，n＝11)；用kb-r7943(100nm)(nm即納摩爾)預(yù)處理(kb-r7943+低鈣液)后，低鈣人工腦脊液引起的ca²⁺流則大幅度減少，平均流速只有352.828±75.665picomole·cm^-2·sec^-1(p<0.001，n＝10)，抑制程度遠(yuǎn)大于tfh。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。