本發(fā)明涉及醫(yī)藥分析技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種巰基β-環(huán)糊精功能化sers紙基的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著中藥材市場的不斷擴大，中藥材違禁添加染料的事件在國內(nèi)層出不窮。不法商販為謀取利益，躲避藥監(jiān)部門對商品中染料的檢查，通常會采用著色力強的脂溶性染料，或者采用兩種或以上的混合染料對中藥材中的次品進行染色。然而大多數(shù)染料分子對人體存在危害隱患。比如蘇丹紅分子，它是一類具有苯基偶氮萘酚結(jié)構(gòu)的化合物，經(jīng)過體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為芳胺化合物，導致人體中肝臟細胞發(fā)生基因突變，從而提高了癌癥的發(fā)生率。因此，為了保障公眾的用藥安全，建立一種適用于蘇丹紅分子的現(xiàn)場快速靈敏的檢測方法具有重要的意義。

目前，常用于蘇丹紅分子檢測的方法主要有高效液相色譜法、毛細管電泳色譜法、免疫方法等，這些方法雖然高效靈敏，但是儀器龐大、造價高、分析周期長、樣品前處理復(fù)雜，不能滿足現(xiàn)場快速檢測的需求。相反，表面增強拉曼光譜由于它快速、靈敏、可實現(xiàn)對樣品無損檢測以及提供豐富的分子指紋特征，在現(xiàn)場快速檢測中受到了廣泛的關(guān)注，具有很好的應(yīng)用前景。

sers技術(shù)的關(guān)鍵在于基底的制備，近年來，濾紙由于具有輕、薄、造價低、方便攜帶和取樣、可批量生產(chǎn)且生物兼容等特點，受到越來越多研究者的青睞，將其作為構(gòu)筑各種納米結(jié)構(gòu)的支撐載體，應(yīng)用于現(xiàn)場檢測的實用化sers基底。然而，就脂溶性分子而言，其疏水性與親水紙基之間親和力弱，脂溶性分子不能有效地接近紙基的活性位點(“熱點”)，導致紙基對脂溶性分子的檢測靈敏性具有局限性。因此，為了提高基底與脂溶性分子之間的親和力，通常會對基底進行表面疏水化或功能化修飾。目前，有方法利用氧化鋁模板構(gòu)筑巰基β-環(huán)糊精修飾銀納米棒基底，也有方法基于玻璃片上構(gòu)筑巰基β-環(huán)糊精修飾金納米球基底，均可用于提高對水污染中脂溶性分子多氯聯(lián)苯(pcb)的檢測靈敏性。然而，上述方法所采用的sers基底質(zhì)地堅硬，制備成本較高，樣品前處理復(fù)雜，而且銀納米顆粒易被氧化，導致基底的檢測靈敏度快速降低，不利于基底的保存與攜帶。因此，限制了sers基底的實用化應(yīng)用前景。本發(fā)明以巰基β-環(huán)糊精(hs-β-cd)為功能分子修飾金納米棒(gnr)，不僅利用hs-β-cd的疏水空腔捕獲脂溶性染料，提高基底與脂溶性染料的親和力，而且相比于銀納米材料，gnr不易被氧化，信號穩(wěn)鍵，方便貯存。此外，本發(fā)明采用濾紙為支撐材料，輕薄柔韌，方便攜帶，而且具有吸水性和毛細力特性，可簡化樣品采集過程，具有良好的實用化應(yīng)用潛力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種適用于現(xiàn)場快速檢測脂溶性染料的sers紙基的制備方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一方面，提供一種巰基β-環(huán)糊精功能化sers紙基的制備方法，包括以下步驟：

步驟一(s1)：巰基β-環(huán)糊精功能化金納米棒的制備

金納米棒溶液預(yù)處理：取適量金納米棒原液，離心后去除表面活性劑，用等體積的超純水清洗底層的金納米棒，離心后去除上清液，底層用等體積超純水重新分散備用；配制濃度為100～0.1μm的巰基β-環(huán)糊精；取預(yù)處理后的金納米棒溶液與巰基β-環(huán)糊精溶液混合，使巰基β-環(huán)糊精的最終濃度為50～1μm，振蕩后，于恒溫水浴中靜置，使巰基β-環(huán)糊精與金納米棒充分進行化學吸附作用，混合時間為3～48h，離心轉(zhuǎn)速為8000～10000rpm，離心時間為10～20min；

步驟二(s2)：功能化金納米棒在濾紙表面的吸附沉積量

將步驟一得到的功能化金納米棒通過浸泡的方式吸附于濾紙表面：取適量功能化金納米棒離心后去除上清液，底層用2～4倍濃縮量的超純水重新分散，將濾紙裁剪成1×1cm²的正方形，分別浸泡于3個濃縮量的功能化金納米棒溶液中，靜置于恒溫水浴中，使濾紙充分均勻吸附功能化金納米棒；所述離心轉(zhuǎn)速為8000～10000rpm，離心時間為10～20min，浸泡時間為12～48小時。

優(yōu)選的，步驟一采用的巰基β-環(huán)糊精的最終濃度優(yōu)選5μm，金納米棒與巰基β-環(huán)糊精的混合比例優(yōu)選9:1，混合時間優(yōu)選24h，水浴中溫度優(yōu)選40℃，離心轉(zhuǎn)速優(yōu)選9000rpm，離心時間優(yōu)選15min。

優(yōu)選的，步驟二采用的金納米棒的濃縮倍數(shù)優(yōu)選3倍，水浴中溫度優(yōu)選40℃，離心轉(zhuǎn)速優(yōu)選9000rpm，離心時間優(yōu)選15min。

本發(fā)明的第二方面，提供一種采用上述制備方法制備得到的巰基β-環(huán)糊精功能化sers紙基。

本發(fā)明的第三方面，提供一種采用上述制備方法制備得到的巰基β-環(huán)糊精功能化sers紙基sers性能的考察方法，以蘇丹紅iv作為探針分子，分別考察紙基的靈敏性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

具體包括以下步驟：

步驟a：考察功能化sers紙基的靈敏性

配制了不同濃度的蘇丹紅iv溶液備用，分別將濃度50μm-0.5μm的蘇丹紅iv滴加于紙基表面，在拉曼光譜儀下進行檢測，采集20個不同位點的光譜，通過選取1097cm^-1特征峰的強度作為紙基對不同濃度的蘇丹紅iv的靈敏性表征；

步驟b：考察功能化sers紙基的重現(xiàn)性

將濃度為50μm的蘇丹紅iv滴加于紙基表面，采集得到50個不同位點的光譜，選取蘇丹紅iv的特征峰1097cm^-1(ω(c-h/n-h)/υ(n-n))和1485cm^-1(ρ(n-h)/υ(c＝n)/ρ(c-h)ph)的強度計算平均標準偏差值；

步驟c：考察功能化sers紙基的穩(wěn)定性

將紙基放置在空氣中保存90天，分別在第1、7、15、30、60、90天時，將50μm的蘇丹紅iv滴加于紙基上，采集得到光譜，通過觀察蘇丹紅iv的特征峰1097cm^-1的sers強度變化，評估功能化sers紙基的貯存穩(wěn)定性。

優(yōu)選的，所述的步驟a、b、c中sers檢測條件為積分時間5s，激光波長為633nm。

與傳統(tǒng)的沒有經(jīng)過功能化修飾的金納米棒紙基對比，功能化金納米棒紙基對蘇丹紅iv表現(xiàn)出更好的靈敏性(lod＝0.5μm)。紙基在50個不同位點檢測所得的平均標準偏差均小于15％。紙基穩(wěn)定性如圖9所示，將其放置在空氣中貯存90天，sers靈敏性僅降至60％。

本發(fā)明的第四方面，提供一種上述的巰基β-環(huán)糊精功能化sers紙基在檢測中藥材中違禁添加蘇丹紅染料中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第五方面，提供一種上述的巰基β-環(huán)糊精功能化sers紙基用于檢測中藥材中違禁添加蘇丹紅染料的方法，包括以下步驟：

用丙酮、乙醚、環(huán)己烷試劑潤濕所述的功能化sers紙基，用潤濕后的紙基擦拭待檢樣品的表面，通過拉曼檢測得到sers光譜，將得到的sers光譜進行基線校正，分析待檢樣品中是否添加了蘇丹紅染料。

優(yōu)選的，所述的潤濕試劑優(yōu)選環(huán)己烷，sers檢測條件為積分時間5s，激光波長為633nm。

本發(fā)明的巰基β-環(huán)糊精功能化sers紙基檢測真實樣品中蘇丹紅iv的檢測限達到38.04ng/cm²。

與背景技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案的有益效果在于：

1、利用巰基β-環(huán)糊精功能化金納米棒，有利于捕獲蘇丹紅分子

本發(fā)明以hs-β-cd作為功能化分子，利用了hs-β-cd具有獨特的外親水內(nèi)疏水的空腔結(jié)構(gòu)，提供了一個良好的疏水位點，與脂溶性分子具有較好的親和性，能夠包合脂溶性分子，縮短了脂溶性分子與增強基底之間的距離，實現(xiàn)對脂溶性分子的靈敏性檢測。此外，將hs-β-cd修飾于gnr表面，由于s-au化學鍵比br-au強，因此，可以替換出gnr表面的ctab，形成穩(wěn)鍵的功能化gnr基底，保證了紙基在檢測環(huán)境中的穩(wěn)定性。本發(fā)明巰基β-環(huán)糊精功能化金納米棒步驟，保證gnr表面hs-β-cd的最大覆蓋率，有利于提高hs-β-cd的疏水性空腔捕獲脂溶性分子的效率，增加紙基對脂溶性分子的靈敏性和特異性檢測。

2、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好

本發(fā)明制備的紙基由于功能化金納米棒在其表面吸附量多，而且吸附分布均一性較好，因此進行拉曼檢測時，呈現(xiàn)出較好的重現(xiàn)性。此外，金納米棒不易被氧化，所以功能化紙基的貯存穩(wěn)定性也表現(xiàn)良好。因此，功能化sers紙基可以滿足實用化基底的要求。

3、紙基提供了3d構(gòu)型，而且制備和操作過程簡單，檢測成本低

本發(fā)明中紙基表面由交叉堆疊的纖維素構(gòu)成了3d構(gòu)型，有利于產(chǎn)生較多的熱點，提高基底的sers增強性能。此外，利用紙基的吸水性和毛細力特性，通過試劑潤濕后，能夠?qū)崿F(xiàn)對真實樣品表面的染料分子的簡易提取，簡化了對樣品的前處理過程，檢測速度快。并且紙基的制備方式簡單，檢測成本低，滿足現(xiàn)場快速檢測的需求。

4、本發(fā)明方法制備步驟簡單，檢測時間短，能夠?qū)崿F(xiàn)對中藥材中違禁添加蘇丹紅染料的快速靈敏性檢測。

附圖說明

圖1為功能化sers紙基的制備以及應(yīng)用于檢測中藥材中違禁添加蘇丹紅染料的流程圖；

圖2為實施例1中不同濃度的巰基β-環(huán)糊精與金納米棒隨混合時間的變化，sers強度的變化趨勢；

圖3為實施例1中不同濃縮倍數(shù)的功能化金納米棒的sers靈敏性；

圖4為實施例1中3倍濃縮的功能化金納米棒在紙基表面不同沉積時間的sers靈敏性；

圖5為實施例1中功能化金納米棒紙基對不同濃度的蘇丹紅iv的靈敏性檢測光譜以及與金納米棒紙基靈敏性的對比圖；

圖6為實施例1中功能化金納米棒紙基在不同位點采集所得的50條光譜；

圖7為實施例1中功能化金納米棒紙基檢測所得50條光譜在1097cm^-1特征峰處的強度圖以及它的rsd值；

圖8為實施例1中功能化金納米棒紙基檢測所得50條光譜在1485cm^-1特征峰處的強度圖以及它的rsd值；

圖9為實施例1中功能化金納米棒紙基隨著保存時間的變化，檢測蘇丹紅iv特征峰1097cm^-1的峰強變化；

圖10為實施例2中不同試劑潤濕的功能化金納米棒紙基擦拭血竭空白樣本采集得到的空白背景；

圖11為實施例2中不同試劑潤濕的功能化金納米棒紙基擦拭血竭染色樣本采集得到的sers光譜；

圖12為實施例2中功能化金納米棒紙基檢測用不同濃度蘇丹iv染色的血竭采集得到的sers光譜以及它們在1097cm^-1特征峰處的強度變化。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。

實施例1

本實施例1采用的拉曼光譜儀是labramhr800共聚顯微拉曼光譜儀(horibajy)，配備激光波長為632.8mn的he-ne激光器，選用×50lmplfln物鏡，數(shù)值孔徑(na)為0.5，激光功率為～1mw。采用的增強基底為金納米棒溶膠，制備方法是：1.金納米棒的制備：將盛有10ml十六烷基三甲基溴化銨(ctab，0.1m)的燒杯放置在水浴鍋中(恒溫28℃)，加入103μl水合氯金酸(haucl4,25mm)混勻，在攪拌下迅速加入新配置的硼氫化鈉溶液(nabh4,0.01m)600μl，持續(xù)攪拌2min，28℃靜置1h，即為種子液備用。再將盛有10mlctab(0.1m)的三角瓶放置在水浴鍋中(恒溫28℃)，先后加入120μl硝酸銀(agno3,0.08m)，100μl硝酸(hno3,2m)，206μl水合氯金酸(haucl4·3h2o,25mm)，維生素a(aa,0.1m)，攪拌混勻后，加入120μl種子液，攪拌數(shù)秒后28℃下靜置24h生長成金納米棒備用。

圖1為本實施例對功能化金納米棒紙基的不同優(yōu)化條件的制備流程圖，具體包括以下三步：

步驟一(s1)：巰基β-環(huán)糊精功能化金納米棒的制備條件優(yōu)化

金納米棒溶液預(yù)處理：取適量金納米棒原液，離心后去除表面活性劑，用等體積的超純水清洗底層的金納米棒，離心后去除上清液，底層用等體積超純水重新分散備用；配制濃度為100～0.1μm的巰基β-環(huán)糊精；取預(yù)處理后的金納米棒溶液分別與不同濃度的巰基β-環(huán)糊精以合適的比例混合，使巰基β-環(huán)糊精的最終濃度為50～1μm，振蕩后，于恒溫水浴中靜置，使巰基β-環(huán)糊精與金納米棒充分進行化學吸附作用，混合時間為3～48h，離心轉(zhuǎn)速為8000～10000rpm，離心時間為10～20min。

步驟二(s2)：功能化金納米棒在濾紙表面的吸附沉積量優(yōu)化

將步驟一得到的功能化金納米棒通過浸泡的方式吸附于濾紙表面：取適量功能化金納米棒離心后去除上清液，底層用2-4倍濃縮量的超純水重新分散，將濾紙裁剪成1×1cm²的正方形，分別浸泡于3個濃縮量的功能化金納米棒溶液中，靜置于恒溫水浴中，使濾紙充分均勻吸附功能化金納米棒；所述離心轉(zhuǎn)速為8000-10000rpm，離心時間為10-20min，浸泡時間為12-48小時。

步驟三(s3)：功能化金納米棒紙基的sers性能考察

考察步驟二得到的功能化金納米棒紙基的sers性能，以蘇丹紅iv作為探針分子，分別考察紙基的靈敏性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。配制了不同濃度的蘇丹紅iv溶液備用，首先考察紙基的靈敏性，分別將不同濃度(50μm-0.5μm)的蘇丹紅iv滴加于紙基表面，在拉曼光譜儀下進行檢測，采集20個不同位點的光譜，通過選取1097cm^-1特征峰的強度作為紙基對不同濃度的蘇丹紅iv的靈敏性表征。其次考察紙基的重現(xiàn)性，將濃度為50μm的蘇丹紅iv滴加于紙基表面，采集得到50個不同位點的光譜，選取蘇丹紅iv的特征峰1097cm^-1(ω(c-h/n-h)/υ(n-n))和1485cm^-1(ρ(n-h)/υ(c＝n)/ρ(c-h)ph)的強度計算平均標準偏差(rsd)值。最后考察紙基的穩(wěn)定性，將紙基放置在空氣中保存90天，分別在第1、7、15、30、60、90天時，將50μm的蘇丹紅iv滴加于紙基上，采集得到光譜，通過觀察蘇丹紅iv的特征峰1097cm^-1的sers強度變化，評估功能化sers紙基的貯存穩(wěn)定性。上述sers檢測條件為積分時間5s，激光波長為633nm。

根據(jù)步驟一至步驟三(s1～s3)所述方法進行sers效果分析。

經(jīng)步驟一得到不同濃度巰基β-環(huán)糊精與金納米棒混合不同時間所對應(yīng)的sers信號強度變化，如圖2所示，巰基β-環(huán)糊精的最終濃度為5μm時，且金納米棒與巰基β-環(huán)糊精的混合比例9:1時，其與金納米棒在任意混合時間均比其它濃度的sers強度更高，而且在混合時間為24h時達到最高，因此選擇優(yōu)化條件為5μm濃度和24h混合時間。

經(jīng)步驟二得到不同濃縮倍數(shù)的功能化金納米棒的sers信號響應(yīng)，如圖3所示。濾紙在功能化金納米棒溶液中不同浸泡時間所得的紙基的sers信號響應(yīng)，如圖4所示。紙基的sers信號隨著功能化金納米棒濃縮倍數(shù)的增加而增強，但3倍與4倍濃縮量的差距不大，考慮成本效益選擇優(yōu)化條件為3倍的濃縮膠。此外，紙基的sers信號隨著濾紙在功能化金納米棒溶液中的浸泡時間的增加而逐漸增強，但24h和48h的強度差距不大，考慮時間效益選擇優(yōu)化條件為24h的浸泡時間。

經(jīng)步驟三探索了功能化金納米棒紙基的sers性能。以蘇丹紅iv為探針分子，分別考察了紙基對蘇丹紅iv的檢測靈敏性，如圖5所示，考察了紙基不同位點的sers重現(xiàn)性，如圖6、7、8所示，考察了紙基在空氣中隨貯存時間的延長的sers穩(wěn)定性，如圖9所示。與傳統(tǒng)的沒有經(jīng)過功能化修飾的金納米棒紙基對比，功能化金納米棒紙基對蘇丹紅iv表現(xiàn)出更好的靈敏性(lod為0.5μm)。紙基在50個不同位點檢測所得的平均標準偏差均小于15％，重現(xiàn)性好。將其放置在空氣中貯存90天，sers靈敏性僅降至60％，穩(wěn)定性好。

實施例2

本實施例2將上述優(yōu)化制備所得的功能化紙基應(yīng)用于經(jīng)過不同濃度蘇丹紅iv染色的血竭中藥材進行分析檢測。

步驟四：功能化金納米棒紙基應(yīng)用于血竭中藥材違禁添加的蘇丹紅的檢測

將步驟二得到的功能化金納米棒紙基應(yīng)用于血竭中蘇丹紅染料的檢測，配制濃度為10^-3mol/l的蘇丹紅iv溶液作為母液，其它濃度則通過對母液進行稀釋得到。量取20μl的相應(yīng)溶度的蘇丹紅iv對血竭進行模擬染色，制備染色的血竭樣本。把功能化紙基當成抹布，分別用三種不同試劑(乙醚、環(huán)己烷、丙酮)潤濕的紙基輕輕擦拭血竭樣本表面，簡單提取血竭表面的蘇丹紅iv染料，通過拉曼檢測得到sers光譜，對得到的sers光譜進行基線校正，分析功能化紙基對血竭樣本中蘇丹紅iv的檢測靈敏性。sers檢測條件為積分時間5s，激光波長為633nm。

經(jīng)步驟四，考察了不同潤濕試劑對真實樣品檢測的影響，如圖9所示，三種試劑分別為乙醚、環(huán)己烷、丙酮，潤濕紙基后分別擦拭空白血竭以及染色血竭后檢測sers光譜，如圖10、11所示，發(fā)現(xiàn)乙醚和丙酮作為潤濕試劑分別擦拭空白血竭和染色血竭表面檢測得到的光譜之間無差異，說明乙醚和丙酮均不能實現(xiàn)對血竭中染料分子的有效提取。相反，以環(huán)己烷試劑潤濕的紙基在空白血竭表面擦拭得到的sers光譜中幾乎沒有出現(xiàn)任何雜質(zhì)干擾峰，而擦拭染色血竭后得到了豐富的sers信號峰，并與蘇丹紅iv圖譜進行對比，特征峰基本一致，說明環(huán)己烷是一種合適的潤濕劑，能最大程度減少真實樣品的基質(zhì)干擾，并且最大程度提高對真實樣品中蘇丹紅iv分子的提取。此外，通過對不同濃度蘇丹紅iv染色的血竭樣本進行sers檢測，如圖12所示，功能化金納米棒紙基檢測真實樣品中蘇丹紅iv的檢測限達到38.04ng/cm²。因此，本文建立的巰基環(huán)糊精功能化金納米棒紙基適用于中藥材中違禁添加蘇丹紅染料的靈敏性檢測。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。