本發(fā)明涉及一種檢測尿外泌體荷載mirnas的試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

腎纖維化(renalfibrosis，rf)，包括腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化，是一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)展的過程,標(biāo)志著不可逆性腎損傷,是影響各類腎臟疾病的治療及預(yù)后的重要因素之一。[羅海清,梁冬,劉華鋒.腎間質(zhì)纖維化的形成機(jī)制及中醫(yī)藥防治作用.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2004,5(7):432-434.]因此,延緩和阻斷腎纖維化是防治腎損害的關(guān)鍵,也是目前國內(nèi)外腎臟病研究的熱點(diǎn)。能否及時(shí)、準(zhǔn)確地判斷是否存在腎纖維化及其程度,有助于臨床醫(yī)生合理制定治療方案及較準(zhǔn)確地判斷預(yù)后。

臨床上腎纖維化診斷有賴于腎臟病理學(xué)診斷,而腎活檢是一種有創(chuàng)性檢查,對于有腎活檢禁忌證的患者則無法施行；無法廣泛的在基層醫(yī)院開展。并且,鑒于醫(yī)學(xué)倫理學(xué),難以通過重復(fù)腎活檢對病情作動(dòng)態(tài)監(jiān)測,而且患者也不易接受。因此,尋找一組無創(chuàng)性診斷指標(biāo)對腎纖維化的診斷、病情動(dòng)態(tài)觀察、療效的客觀評價(jià),有著積極的臨床意義。

過去，一些血、尿蛋白被用于腎纖維化的診斷，如透明質(zhì)酸、層粘蛋白、ⅲ型前膠原、ⅳ型膠原等[許筠，張少山，程保智，等.測定血清等對腎纖維化診斷的意義.蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，37(4)：24-27、32.]，可以在一定程度上反應(yīng)腎纖維化的進(jìn)程，但這些蛋白直接暴露于體液中，容易降解而使結(jié)果不穩(wěn)定，不能實(shí)時(shí)的反應(yīng)病變。mirnas分子是近年研究的熱點(diǎn)，但目前還沒有得到公認(rèn)的用于檢測腎纖維化的mirnas分子診斷標(biāo)志物。

近年來,液體活檢方法診斷腎纖維化的價(jià)值日益受到人們的重視。尿外泌體(exosome)膜中包含特征性蛋白和核酸，比裸露的蛋白、核酸更穩(wěn)定的反映腎小球和腎小管細(xì)胞損傷和修復(fù)情況、間質(zhì)炎癥、基質(zhì)沉積等，從而反應(yīng)纖維化和疾病進(jìn)程。同時(shí)，由于尿液取樣方便，無創(chuàng)且可反復(fù)取樣，因此，檢測尿外泌體中標(biāo)志性分子，成為液體活檢研究中的熱點(diǎn)，可以實(shí)時(shí)了解腎纖維化的進(jìn)程。

比如，[lvll，caoyh，nihf，etal.microrna-29cinurinaryexosome/microvesicleasabiomarkerofrenalfibrosis[j].amjphysiolrenalphysiol，2013，305(8):f1220-f1227.]等研究發(fā)現(xiàn)腎纖維化患者尿液中的mir-29c較健康人呈低表達(dá)，能有效預(yù)測腎小球?yàn)V過率估算值(egfr)和小管間質(zhì)性纖維化程度，且能特異性區(qū)別輕度、中度和重度腎纖維化。因而，尿液exosome中的mir-29c與腎功能和纖維化程度的相關(guān)性，可以作為一種新的非侵入性腎纖維化指示分子。

但是，目前提取分離外泌體的方法多樣，包括超速離心、密度梯度離心、免疫磁珠、超濾或試劑盒等方法，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，超速離心法需要超速離心機(jī)，過程比較費(fèi)時(shí)，且回收率不穩(wěn)定(可能與轉(zhuǎn)子類型有關(guān))，純度也受到質(zhì)疑；此外，重復(fù)離心操作還有可能對囊泡造成損害，從而降低其質(zhì)量。密度梯度離心法獲得的外泌體純度較高，但步驟繁瑣，耗時(shí)。超濾離心法簡單高效，且不影響外泌體的生物活性，是提取細(xì)胞外泌體的一種新方法。磁珠法具有特異性高、操作簡便、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點(diǎn)，但是效率低，外泌體生物活性易受ph和鹽濃度影響，不利于下游實(shí)驗(yàn)，難以廣泛普及。試劑盒價(jià)格昂貴，不適合大規(guī)模檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種檢測尿外泌體中的mir-29c的試劑盒和方法。

本發(fā)明檢測尿外泌體荷載mirnas的試劑盒，它包括外泌體提取試劑和mirnas檢測試劑，其中，提取試劑為聚乙二醇和氯化鈉的混合溶液。

優(yōu)選地，所述聚乙二醇和氯化鈉的混合溶液中，聚乙二醇的濃度為0.16～0.24g/ml，所述氯化鈉的濃度為0.0584g/ml。

優(yōu)選地，所述聚乙二醇和氯化鈉的混合溶液中，聚乙二醇的濃度為0.16g/ml。

優(yōu)選地，所述mirnas檢測試劑為qpcr檢測試劑，優(yōu)選地，所述qpcr檢測試劑為基于莖環(huán)法的m-mlvfriststrandcdnasynthesiskit(omega)和greenpcrmastermix(appliedbiosystems)試劑盒。

優(yōu)選地，它還包括rna提取試劑，所述rna提取試劑為trizol試劑。

本發(fā)明還提供了一種檢測尿外泌體荷載mirnas的方法，步驟如下：

(1)取尿液，采用權(quán)利要求1～4任意一項(xiàng)所述試劑盒中的提取試劑提取尿外泌體；

(2)提取尿外泌體中的總rna，采用權(quán)利要求1～5任意一項(xiàng)所述試劑盒中的檢測試劑檢測，即可。

步驟(1)中，所述提取的方法如下：

1)取待檢樣品，離心，取上清；

2)將提取試劑加入步驟1)的上清中，混勻，反應(yīng)12h以上，離心，棄上清，收集沉淀，即可。

步驟1)中，所述離心是在4℃、2000g條件下離心10分鐘。

步驟2)中，反應(yīng)的溫度是4℃；離心是在4℃、3580g條件下離心1h。

本發(fā)明還提供了前述試劑盒在制備腎纖維化檢測試劑中的用途。

本發(fā)明采用試劑盒包含提取外泌體的試劑以及mir-29c的檢測試劑，本發(fā)明外泌體提取試劑可以有效提取外泌體，收率高，制備得到的產(chǎn)品純度也較高，可以有效檢測外泌體中的mir-29c，同時(shí)操作簡便，不需要超速離心，易于推廣應(yīng)用，成本低廉，臨床應(yīng)用前景良好。

下面通過具體實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但是并不是對本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

附圖說明

圖1外泌體檢測結(jié)果：a.外泌體電鏡(×15.0k)，b.外泌體westernblot結(jié)果，c.nta分析外泌體粒徑分布。

圖2mirna-29c水平roc曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1本發(fā)明檢測試劑盒的組成

(1)外泌體提取試劑

取聚乙二醇0.8g；氯化鈉0.292g，加雙蒸水，混勻，定容到5ml，得聚乙二醇-氯化鈉混合溶液。

(2)rna提取試劑

可以采用常規(guī)的rna提取試劑，如trizol試劑(invitrogen)。

(3)檢測試劑

基于poly-a加尾法的midetectatracktmmirnaqrt-pcr試劑盒(廣州銳博)。

實(shí)施例2本發(fā)明檢測試劑盒的組成

(1)外泌體提取試劑

取聚乙二醇0.8g；氯化鈉0.292g，加雙蒸水，混勻，定容到5ml，得聚乙二醇-氯化鈉混合溶液即。

(2)rna提取試劑

可以采用常規(guī)的rna提取試劑，如trizol試劑(invitrogen)。

(3)檢測試劑

m-mlvfriststrandcdnasynthesiskit(omega)和greenpcrmastermix(appliedbiosystems)試劑盒。

實(shí)施例3本發(fā)明檢測試劑盒的組成

(1)外泌體提取試劑

取聚乙二醇1.2g；氯化鈉0.292g，加雙蒸水，混勻，定容到5ml，得聚乙二醇-氯化鈉混合溶液。

(2)rna提取試劑

可以采用常規(guī)的rna提取試劑，如trizol試劑(invitrogen)。

(3)檢測試劑

m-mlvfriststrandcdnasynthesiskit(omega)和greenpcrmastermix(appliedbiosystems)試劑盒。

實(shí)施例4本發(fā)明mir-29c的檢測方法

一、尿液收集與保存

1.研究對象：選取2016年10月至2017年2月成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院和四川省人民醫(yī)院腎病內(nèi)科住院的經(jīng)腎穿刺診斷為腎纖維化的患者25例設(shè)為研究組。其中男20例，女19例。年齡31～72歲，平均(61.3±10.3)歲。腎組織均經(jīng)he、masson染色檢查證實(shí)，符合腎纖維化診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除①年齡＜18歲者或伴有尿路感染、sle、器官移植的患者。②因心血管疾病具有明顯癥狀、體征的嚴(yán)重合并癥而使用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的患者。③孕婦及哺乳期患者。④合并惡性腫瘤患者。⑤有明顯其他器官纖維化患者(如肝纖維化、肺纖維化、大面積纖維疤痕等)。⑥其他研究者認(rèn)為不適合納入研究的患者。將同期醫(yī)院體檢中心確診的的健康志愿者15例設(shè)為對照組，其中男12例、女8例，年齡46～79歲，平均(60.25±8.0)歲。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2.尿液收集與保存：健康志愿者于體檢中心采清晨第一次晨尿標(biāo)本，腎纖維化患者于腎穿刺術(shù)后7日內(nèi)收集晨尿標(biāo)本20ml以上，加入蛋白酶抑制劑后，-80℃凍存。收集患者近期血尿常規(guī)及肝腎功結(jié)果，及其他一些異常檢查結(jié)果。

研究組和對照組在性別、年齡間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)；血中尿素氮、肌苷的表達(dá)較對照組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。詳見表1。

表1研究對象的臨床、實(shí)驗(yàn)室結(jié)果情況表

二.尿外泌體的分離

分離方法：將保存于-80度的尿在冰上融化，3000g，4℃離心10min。將上清轉(zhuǎn)移至新的ep管中，加入5/7體積的聚乙二醇-氯化鈉混合溶液，輕輕顛倒混勻，4℃孵育過夜，4000g離心60min，去除上清，保留沉淀備用。

檢測：

①分析外泌體的粒徑和濃度：采用nanoparticle-trackinganalysis(nta)分析顆粒的數(shù)量和粒徑分布。將上述沉淀用30μl無顆粒pbs重懸，測試前再稀釋1000倍。

②透射電鏡觀察外泌體的形態(tài)：醋酸雙氧鈾負(fù)染外泌體后，80kv-120kv成像觀察外泌體電鏡結(jié)構(gòu)。

③westenblot檢測外泌體標(biāo)志物：采用sds上樣緩沖液充分提取外泌體蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白分布情況，10％sds-page分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到pvdf膜上，5％脫脂奶粉室溫封閉1h，分別加入cd63(abcam,usa)和cd9(abcam，usa)抗體(1:1000)，4℃封閉過夜，tbs-t洗3次，加入hrp標(biāo)記的2抗(1:1000)，室溫孵育1h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，膠片記錄。

本實(shí)驗(yàn)獲得的血清外泌體大致呈圓形、部分有凹陷，粒徑在100nm以下(圖1a)，表達(dá)cd9，cd63等外泌體的標(biāo)志分子，且研究組和對照組間無明顯差異(圖1b)。進(jìn)一步的nta分析顯示，分離到的外泌體粒徑并不均一，主要分布在40和100nm附近(圖1c)，說明成功分離了人尿外泌體。

三.外泌體rna抽提和定量及實(shí)時(shí)定量pcr

采用trizol抽提尿外泌體的總rna。

采用基于莖環(huán)法的m-mlvfriststrandcdnasynthesiskit(omega)和greenpcrmastermix(appliedbiosystems)試劑盒和7500realtimepcrsystem(appliedbiosystems)檢測mir-29c和內(nèi)參基因snrna-u6，各樣本重復(fù)檢測3次。

研究組尿外泌體中mir-29c的表達(dá)：采用qpcr檢測尿外泌體中mir-29c，其相對表達(dá)水平以方程2^-△ct計(jì)算，其中△ct＝(ctmirna-ctu6)。詳見表2。

表2腎纖維化患者和健康志愿者尿外泌體源mirna-29c水平情況表

尿外泌體中的mir-29c表達(dá)量與腎纖維化程度的關(guān)系：為評價(jià)尿外泌體中mir-29c的水平與腎纖維化程度之間的關(guān)系，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示mirna表達(dá)情況，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以受試者工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，簡稱roc曲線)評估m(xù)ir-29c對腎纖維化診斷的特異度和敏感度。詳見圖2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：腎纖維化病例中mir-29c在所有病例中均顯著降低，說明腎組織特異性mir-29c以外泌體形式進(jìn)入尿液，其水平較對照組顯著降低，且表達(dá)量與腎纖維化的程度呈負(fù)相關(guān)，roc曲線分析顯示曲線下面積(auc)分別為0.947，因此，可以準(zhǔn)確檢測腎纖維化的程度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明方法可以有效提取尿液外泌體，并且準(zhǔn)確檢測尿液中的mir-29c，進(jìn)而用于腎纖維化的診斷，臨床應(yīng)用前景良好。